>[0152] 配制方法：將上述檢測組合物配方中各試劑的儲備溶液與去離子水相混合，然后 用濃度為1N的NaOH或Κ0Η溶液將混合溶液的pH值調(diào)整為6. 5,然后用去離子水將溶液調(diào) 至最終體積。在2_8°C條件下進行過夜貯藏。
[0153] 2、檢測方法
[0154] 將20或200TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33)各10μL分別與配制好的90μL 的檢測組合物混合，然后通過光度計（德國伯托的Sirius)測定60分鐘的光信號讀數(shù)以記 錄反應(yīng)動力學情況，每10秒鐘測量一次光信號。
[0155] 20TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33)樣品的信號檢測不到，200TCID50單位的流 感病毒（A/WSN/33)樣品，前30分鐘的結(jié)果信號不明顯，不足以顯示。
[0156] 對比例3
[0157] 1、流感病毒實時檢測試劑盒，包括檢測組合物。
[0158] 檢測組合物配方：
[0159]
[0160]N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素，如下式24 μ g/mL ;
[0161]
[0162] 螢火蟲熒光素酶10 μ g/mL。
[0163] 配制方法：將上述檢測組合物配方中各試劑的儲備溶液與去離子水相混合，然后 用濃度為1N的NaOH或Κ0Η溶液將混合溶液的pH值調(diào)整為7. 5,然后用去離子水將溶液調(diào) 至最終體積。在2-8°C條件下進行過夜貯藏。
[0164] 2、檢測方法
[0165] 將200TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33)10 μL與配制好的90 μL的檢測組合物 混合，然后通過光度計（德國伯托的Sirius)測定60分鐘的光信號讀數(shù)以記錄反應(yīng)動力學 情況，每10秒鐘測量一次光信號。
[0166] 200TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33)樣品，前30分鐘的結(jié)果信號不明顯，不足 以顯不。
[0167] 對比例4
[0168] 1、流感病毒實時檢測試劑盒，包括檢測組合物。
[0169] 檢測組合物配方：
[0170]
[0171] N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素，如下式24μg/mL;(或者替換為其他）
[0172]
[0173] 螢火蟲熒光素酶12μg/mL。
[0174] 配制方法：將上述檢測組合物配方中各試劑的儲備溶液與去離子水相混合，然后 用濃度為1N的NaOH或Κ0Η溶液將混合溶液的pH值調(diào)整為7. 0,然后用去離子水將溶液調(diào) 至最終體積。在2-8°C條件下進行過夜貯藏。
[0175] 2、檢測方法
[0176] 分別將20或200TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33) 10μL與配制好的90μL的 檢測組合物混合，然后通過光度計（德國伯托的Sirius)測定60分鐘的光信號讀數(shù)以記錄 反應(yīng)動力學情況，每10秒鐘測量一次光信號。
[0177] 20TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33)樣品的信號檢測不到，200TCID50單位的流 感病毒（A/WSN/33)樣品，前30分鐘的結(jié)果信號不明顯，不足以顯示。
[0178] 對比例5
[0179] 1、流感病毒實時檢測試劑盒，包括檢測組合物。
[0180] 檢測組合物配方：
[0181]
[0182]N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素，如下式24μg/mL;(或者替換為其他）
[0183]
[0184] 螢火蟲熒光素酶14μg/mL。
[0185] 配制方法：將上述檢測組合物配方中各試劑的儲備溶液與去離子水相混合，然后 用濃度為1N的NaOH或Κ0Η溶液將混合溶液的pH值調(diào)整為7. 0,然后用去離子水將溶液調(diào) 至最終體積。在2-8°C條件下進行過夜貯藏。
[0186] 2、檢測方法
[0187] 分別將20或200TCID50單位的流感病毒（A/WSN/33) 10μL與配制好的90μL的 檢測組合物混合，然后通過光度計（德國伯托的Sirius)測定60分鐘的光信號讀數(shù)以記錄 反應(yīng)動力學情況，每10秒鐘測量一次光信號。
[0188] 結(jié)果顯示信號不強或者檢測不到。
【主權(quán)項】
1. 一種流感病毒實時檢測試劑盒，其特征在于，包括檢測組合物，所述檢測組合物pH 值為7. 0-7. 2,組成包括以下： Trizma 喊，pH 7. 0-7. 2 0· l_80mM ; BSA 0. 1-lOmg/mL ； ATP-鈉鹽 0· l-20mM ; DTT 0. l-40mM ； 輔酶 A (λ l-20mM ; MgS04 0. l-40mM ； CaCl2 0. l-20mM ； 甘露醇3-9% ; 蔗糖2-8% ; N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽2-200 μ g/mL ; 螢火蟲熒光素酶10-1000 μ g/ml ; 所述N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物結(jié)構(gòu)式如式（I)所示，其中，各自為氫或1-5個碳原子的烷基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒實時檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測組合物，組 成包括以下： Trizma 堿，pH 7. 0-7. 2 60mM ; BSA 4mg/mL ； ATP-鈉鹽 18mM ; DTT 16mM ； 輔酶A 8mM ; MgS04 35mM ； CaCl2 lOmM ； 甘露醇6% ; 蔗糖4% ; N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽24 μ g/mL ; 螢火蟲熒光素酶7-9 μ g/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的流感病毒實時檢測試劑盒，其特征在于，還包括捕獲 劑，所述捕獲劑為：濃度為4-6mg/mL的待檢測流感病毒的特異性抗體溶液，所述溶液為 0. lwt%的疊氮化鈉溶液，所述待檢測流感病毒的特異性抗體附著于磁粉上。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感病毒實時檢測試劑盒，其特征在于，還包括流感病毒的 裂解緩沖液與清洗緩沖液；所述清洗緩沖液為0. 005M PBS緩沖液；所述裂解緩沖液為pH 7. 0、16mM 的 Trizma 堿，含有 0· 5%的曲拉通 X-100〇5. -種流感病毒實時檢測試方法，其特征在于，包括：將流感病毒與檢測組合物在pH 值為7. 0-7. 2的環(huán)境下結(jié)合，然后檢測是否有螢火蟲熒光素信號；所述檢測組合物包括螢 火蟲熒光素酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽； 所述N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物如式（I)所述，其中，Ri、R2、私各自為氫 或1-5個碳原子的烷基。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的流感病毒實時檢測試方法，其特征在于，所述檢測組合物的 組成包括： Trizma 喊，pH 7. 0-7. 2 0· l_80mM ; BSA 0. 1-lOmg/mL ； ATP-鈉鹽 0· l-20mM ; DTT 0. l-40mM ； 輔酶 A (λ l-20mM ; MgS04 0. l-40mM ； CaCl2 0. l-20mM ； 甘露醇3-9% ; 蔗糖2-8% ; N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽2-200 μ g/mL ; 螢火蟲熒光素酶10-1000 μ g/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的流感病毒實時檢測試方法，其特征在于，所述檢測組合物，組 成包括以下： Trizma 堿，pH 7. 0-7. 2 60mM ; BSA 4mg/mL ； ATP-鈉鹽 18mM ; DTT 16mM ； 輔酶A 8mM ; MgS04 35mM ； CaCl2 lOmM ； 甘露醇6% ; 蔗糖4% ; N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽24 μ g/mL ; 螢火蟲熒光素酶7-9 μ g/ml。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的流感病毒實時檢測試方法，其特征在于，檢測組合 物使用前于2-8°C下靜置2-8小時。9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的流感病毒實時檢測試方法，其特征在于，還包括：將 流感病毒用捕獲劑捕獲，然后與檢測組合物結(jié)合，所述捕獲劑為：濃度為4-6mg/mL的待檢 測流感病毒的特異性抗體溶液，所述溶液為〇. lwt%的疊氮化鈉溶液，所述待檢測流感病毒 的特異性抗體附著于磁粉上。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的流感病毒實時檢測試方法，其特征在于，還包括將捕獲的流 感病毒裂解后，再與檢測組合物結(jié)合；其中，所用裂解緩沖液為pH 7. 0、16mM的Trizma堿， 含有0. 5%的曲拉通X-100,所用清洗緩沖液為0. 005M PBS緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種流感病毒實時檢測試劑盒及方法。所述實時檢測試劑盒包括檢測組合物，所述檢測組合物pH值為7.0-7.2，并同時包括N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素軛合物或其鹽和螢火蟲熒光素酶。所述實時檢測方法為包括：將流感病毒與檢測組合物在pH值為7.0-7.2的環(huán)境下結(jié)合，然后檢測螢火蟲熒光素信號。本發(fā)明的實時檢測試劑盒包含的檢測組合物通過限定檢測組合物中的物質(zhì)組成，并進一步限定這些物質(zhì)的含量，在對流感病毒的神經(jīng)酰胺酶進行檢測時不需要分兩步進行，只需將檢測組合物和流感病毒直接混合進行一步反應(yīng)即可，在保證具有較高的檢測靈敏性的同時，簡化了操作步驟，實現(xiàn)了實時檢測。
【IPC分類】C12Q1/66, C12Q1/70
【公開號】CN105274252
【申請?zhí)枴緾N201510657581
【發(fā)明人】李興祥
【申請人】賽萊克斯生物科技(蘇州)有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年10月12日