專利名稱：：生產(chǎn)流感病毒的方法生產(chǎn)流感病毒的方法本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)流感病毒的方法，其使用來自于經(jīng)免疫抵抗流感的母雞的雞蛋，以及本發(fā)明還涉及這類方法用于制造流感疫苗的用途。目前已知三類流感病毒(A、B和C)，其中A型病毒引起動(dòng)物和人類的病癥，而B型和C型病毒則特別地對(duì)于人類是致病性的。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原結(jié)構(gòu)，A型病毒被細(xì)分為一些亞型，其中所述血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是病毒包膜的主要糖蛋白。存在有16種HA亞型(HlH16)和9種NA亞型(附N9)。因此，A型病毒的亞型是由在病毒包膜上存在的HA亞型和NA亞型所限定的。野生禽類構(gòu)成了所有A亞型流感的倉(cāng)庫(kù)(reservoir)。某些A型流感病毒的亞型地方性地或流行性地(年度流行病)感染家禽(各種亞型包括H5m和H9N2)、馬(主要是H3N8)、豬(主要是H1N1，H3N2和H1N2)以及人類(主要是Hmi和H3N2)。狗、貓和其他野生物種也能夠偶爾被某些亞型所感染(在狗中為H3N8和H5N1；在貓中為H5N1)。在獸醫(yī)領(lǐng)域中，飼養(yǎng)家禽，更具體地小雞、雛雞、母雞和公雞代表了最易于受到流感病毒影響的群體數(shù)目。H5和H7亞型的禽流感株可以是兩種病變型的低病原性(或LP)病變型和高病原性(或HP)病變型。HP株引起禽流感，并且衍生自LP株H5和H7在突變/插入之后，特別是在血凝素切割位點(diǎn)(存在多個(gè)堿性氨基酸)。到目前為止，嚴(yán)格的衛(wèi)生措施和正規(guī)的控制在農(nóng)場(chǎng)中是強(qiáng)烈推薦的，以防止禽流感，以及特別是H5和H7亞型的感染。在人類中，推薦免疫接種抵抗季節(jié)性流行的病毒株，這些病毒株引起傳染病，這些傳染病根據(jù)年份或多或少嚴(yán)重的。大多數(shù)目前的疫苗是使用含胚雞蛋進(jìn)行生產(chǎn)的，其中這些雞蛋被感染三種不同的流感病毒株(具有H3N2和Hmi亞型的兩種A型流感病毒株，和一種B型病毒株)。使用來自還未被針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的含胚雞蛋以防止任何可能損害病毒復(fù)制的干擾現(xiàn)象。事實(shí)上，已知的是，母體的抗體在雞蛋中一段時(shí)間后會(huì)轉(zhuǎn)移給小雞，并保護(hù)它們?cè)谏念^幾天免于微生物感染，但如果這些小雞被提前針對(duì)微生物試劑進(jìn)行免疫，同時(shí)仍然存在針對(duì)該試劑的保護(hù)性母體抗體，則這些抗體會(huì)引起免疫缺陷。H.Stone等(1992，AvianDis.361048-1051)已經(jīng)顯示新生小雞可以通過接種來自雞蛋的卵黃被動(dòng)地免疫抵抗新城疫病(maladiedeNewcastle)，其中所述雞蛋來自于針對(duì)新城疫病病毒(NDV)進(jìn)行免疫的母雞。然而，如果給藥雞蛋黃之后，小雞使用NDV病毒進(jìn)行免疫，則觀察到針對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答的降低。根據(jù)Hamal等(2006，PoultryScience651364-1372)的研究，還已知保護(hù)性母體抗體向新生小雞的轉(zhuǎn)移比率，特別是針對(duì)NDV病毒或感染性支氣管炎病毒(IBV)的抗體的轉(zhuǎn)移比率為30%40%(在三天大的小雞的血液中循環(huán)的母雞血漿的抗體量的百分比)，這表明大量的母體抗體在雞蛋中被隱蔽(sequestres)這得到了J.R.Beck等(2003，AvianDis.471196-1199)研究的確認(rèn)，其顯示了在使用滅活流感病毒株對(duì)母雞進(jìn)行免疫后大約3星期，所有的雞蛋都含有抗-HA抗體。最后，根據(jù)Fontaine等(1963，Pathobiologie，11/9:611_613)的研究已知如果含胚雞蛋被接種抗-流感血清，則這些雞蛋被保護(hù)抵抗流感病毒感染。所有這些原因都已經(jīng)引導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮如果使用來自已經(jīng)被針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋，則由于將母體針對(duì)流感的抗體轉(zhuǎn)移入雞蛋中，所述雞蛋將不能產(chǎn)生流感病毒。自進(jìn)入21世紀(jì)起，隨著高感染性和致病性禽流感病毒株的出現(xiàn)，家禽農(nóng)場(chǎng)中禽流感所造成的經(jīng)濟(jì)損失就一直沒有停止過增長(zhǎng)，這些禽流感病毒殺死了全部飼養(yǎng)家禽，或者在不太嚴(yán)重的情況中，使得被感染的母雞停止產(chǎn)卵。高度致病性病毒株的HA分型顯示它們幾乎所有都具有H5或H7亞型。目前擔(dān)心具有H5或H7亞型的病毒株會(huì)適應(yīng)人類，并且可能在人類中引起實(shí)際的流感大流行；已經(jīng)報(bào)道了牽涉這些亞型的經(jīng)確實(shí)分離的嚴(yán)重人類流感病例。面對(duì)這樣的風(fēng)險(xiǎn)，即雞蛋的供應(yīng)可能不再能確保用于制造流感疫苗，新的生產(chǎn)抵抗流感的疫苗的方法目前被指向使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容雖然新的用于生產(chǎn)流感疫苗的方法，然而還需要能夠在任何情況下在短期內(nèi)并且以很大的數(shù)量生產(chǎn)流感病毒用于制造流感疫苗。本發(fā)明通過描述了一種生產(chǎn)流感病毒的方法滿足了該需要，出乎意料地，該方法基于使用來自于預(yù)先針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋。事實(shí)上，本發(fā)明的主題涉及生產(chǎn)流感病毒的方法，根據(jù)該方法a.向母雞給藥流感疫苗，b.從經(jīng)免疫的母雞獲得雞蛋，c.觸發(fā)胚胎發(fā)生過程，d.通過將流感病毒接種入尿囊腔中來感染含胚雞蛋，e.在允許病毒復(fù)制的溫度和濕度條件下孵化被感染的含胚雞蛋，和f.收獲包含病毒的尿囊液。優(yōu)選地，疫苗保護(hù)母雞抵抗禽流感。典型地，流感疫苗在它的組合物中含有呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素。按照一個(gè)方面，流感疫苗的組合物包含滅活的完整流感病毒。按照另一個(gè)方面，流感疫苗的組合物包含來源于完整流感病毒的產(chǎn)品。按照另一方面，疫苗的組合物還包含佐劑。在另一個(gè)方面，流感疫苗的組合物包含減毒的流感病毒。按照另一種方式，流感疫苗含有載體，所述載體含有編碼流感病毒的血凝素的基因。優(yōu)選，載體是痘病毒。在一個(gè)具體的方面中，所述載體還含有編碼流感病毒的神經(jīng)氨酸酶的基因。按照另一方面，疫苗的組合物還包含佐劑。按照本發(fā)明方法的一種實(shí)施方式，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有不同的亞型。按照另一種實(shí)施方式，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有相同的亞型。按照另一種實(shí)施方式，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素是一致的。按照另一種實(shí)施方式，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的流感病毒與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒是一致的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5、H6、H7或者H9亞型。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5或者H7亞型。在具體的方面中，本發(fā)明的方法包含純化病毒的附加步驟。在另一個(gè)具體的方面中，本發(fā)明的方法包含滅活病毒的附加步驟。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的方法獲得的流感疫苗。本發(fā)明的主題還是本發(fā)明的方法用于制造用于防止流感的疫苗的用途。在具體的方面中，使用本發(fā)明的方法用來制造用于防止人類的大流行性流感的疫田ο在另一個(gè)具體的方面中，使用本發(fā)明的方法用來制造用于防止人類的流行性流感的疫苗的用途。本發(fā)明還涉及用于防止人類中流感病毒流行株感染或者流感病毒大流行株感染的方法，其中所述方法包括為人類給藥有效量的使用本發(fā)明的方法獲得的流感疫苗。在另一方面具體的方面中。使用本發(fā)明的方法用來制造用于防止在馬科、豬科、犬科、貓科、鼬科和禽類物種中的流感的疫苗。本發(fā)明還涉及防止在選自馬科、豬科、犬科、貓科、鼬科和禽類物種的動(dòng)物中的流感的方法，其中所述方法包括向動(dòng)物給藥有效量的使用本發(fā)明的方法獲得的流感疫苗。本發(fā)明的主題還是來自針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋用于生產(chǎn)流感病毒的用途。按照優(yōu)選的方面，使用來自針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋用于制造流感疫苗。最后，按照最后的方面，使用來自針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋用于生產(chǎn)流感病毒或者制造流感疫苗，根據(jù)該用途，雞蛋包含針對(duì)流感病毒的血凝素的抗體，特別地雞蛋包含針對(duì)具有H5、H6、H7或者H9亞型的流感病毒的血凝素的抗體。發(fā)明的詳細(xì)說明措詞"流感病毒或流感的病毒"表示產(chǎn)生自野生型菌株的流感病毒和產(chǎn)生自重配株(souchereassortante)的流感病毒二者，其中所述重配株是通過一種或更多種野生型株與"主體(master)“株的基因組區(qū)段重配產(chǎn)生的，其中所述主體株由于其在雞蛋中的強(qiáng)生長(zhǎng)能力而被選擇。重配株獲得"主體"株的特征但是保持至少野生型株的HA和NA的特征，這意味著重配株的HA和NA的蛋白質(zhì)序列與野生型株的HA和NA的蛋白質(zhì)序列之間的同一性為至少95%，優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%，并且甚至更優(yōu)選100%，其通過完整序列比較程序測(cè)定的。重配株可以通過將敏感細(xì)胞共感染野生型株和主體株，隨后通過用于選擇期望的重配株的適當(dāng)手段而獲得。它還可以通過反向遺傳學(xué)由來自野生型株和"主體〃株核酸核酸，并在多質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)而獲得，如在W001/83794和W003/091401和Proc.Nat.Acad.Sci.USA969345-9350(1999)中所述的。在高病原性株例如H5和H7株的情況中，可以進(jìn)行對(duì)含有多個(gè)堿性氨基酸的切割位點(diǎn)進(jìn)行修飾以賦予重配株低病原性。為了語(yǔ)言的方便，術(shù)語(yǔ)"疫苗株"或者"疫苗病毒"被無差異進(jìn)行使用以表示用來制造流感疫苗的流感病毒；類似地，術(shù)語(yǔ)"感染株"或者"感染病毒"用來表示用于感染生物材料(雞蛋、動(dòng)物)的流感病毒。而且，術(shù)語(yǔ)"來自經(jīng)免疫的母雞的雞蛋"用來表示受精母雞的雞蛋，其來自預(yù)先被免疫并且接觸到公雞的母雞。通常，被用來免疫母雞的流感疫苗可以是由任何流感病毒株制造的。疫苗株可能是A型病毒，也可以是B或者C型病毒。當(dāng)它是A型病毒株時(shí)，病毒可以是任何HA亞型和/或任何NA亞型。例如它可以是具有Hmi或者H3N2亞型的病毒株，其目前引起A型流行性流感。一旦當(dāng)免疫賦予抵抗禽流感的保護(hù)，利用流感病毒免疫母雞的好處是重要的。禽流感可能被忽略過去或者可以通過一組現(xiàn)象而被表征，通常為呼吸和/或腸內(nèi)等級(jí)的，或大或小強(qiáng)度的特征，禽流感會(huì)或多或少地削弱母雞的整體狀況，并且在病毒株高度致病性時(shí)禽流感會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡。禽流感通常導(dǎo)致產(chǎn)卵活性的降低或者甚至消失。屬于H6N2或者H9N2或者甚至H5或者H7亞型的低病原性病毒株引起輕微形式的禽流感，通常導(dǎo)致產(chǎn)蛋量的降低或者消失，但是沒有大的死亡率。相反地，屬于H5和H7亞型高病原性病毒株(特別地H5m、H5N2、H5N9、H7Nl、H7N4或者H7N7)是高度病毒性的并且在母雞農(nóng)場(chǎng)中引起很高的死亡率。HA是在針對(duì)流感的保護(hù)性免疫的產(chǎn)生中關(guān)鍵的抗原。用于本發(fā)明的方法的疫苗在它的組合物中至少包含呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的HA。術(shù)語(yǔ)〃基因〃的意思是對(duì)應(yīng)于開放閱讀框(phaseouvertedelecture)并且編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止子等)控制下的基因被插入到載體的核酸(特別地質(zhì)粒或者病毒)中，這些調(diào)控序列可以是是那些通常與開放閱讀框(內(nèi)源序列)相關(guān)的那些，或者來自不同起源(外源序列)。其可以是人類流感病毒株的HA，但其對(duì)于母雞不是致病性的。優(yōu)選，其包含所關(guān)心的HA，即與引起禽流感的病毒株(期望免疫抵抗該病毒株并保護(hù)母雞)的HA具有相同的亞型。優(yōu)選，存在于疫苗中的HA的蛋白質(zhì)序列和期望保護(hù)母雞所抵抗的株的蛋白質(zhì)序列之間同一性為至少80%，優(yōu)選至少90%，并且甚至更優(yōu)選至少95%，其通過整體序列比較程序(例如Blast程序)測(cè)定的。通常，含有HA的疫苗是包含滅活的完整流感病毒的組合物形式的，或者為來源于滅活的完整流感病毒的產(chǎn)品。表達(dá)"來源于滅活的完整病毒的產(chǎn)品"的意思是滅活的(即非傳染性的)疫苗組合物，其是從病毒株制備的并且至少包含所述病毒株的HA。來源于完整病毒株的產(chǎn)品可以是片段化(或者分裂的)病毒，并且在這種情況下被稱為"分裂的(splitt6)"疫苗。另一個(gè)來源于完整病毒株的產(chǎn)品是該本身株的HA，或者同樣地與通過使用提取和純化方法獲得的NA有關(guān)，并且在這種情況下被稱為"亞單位"疫苗。HA也可以被再次結(jié)合到病毒體中。含有滅活的完整流感病毒的疫苗組合物或者來源于滅活的完整病毒的產(chǎn)品也可以包含一種或更多種助劑或者佐劑制劑。作為非限制性佐劑制劑的實(shí)例，可以提到油包水或7K包油乳劑，例如MF59乳劑(VaccineDesign—TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ.Powell和Μ.Newman編輯，PlenumPress,1995第183頁(yè))，基于脂質(zhì)體的制劑，以及基于MPL的制齊[J(VaccineDesign—TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ·Powell禾口Μ.Newman編輯，PlenumPress,1995第1186-187頁(yè))，基于Avridine的制劑(VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ·Powell禾口Μ·Newman編輯,PlenumPress,1995第148頁(yè))，基于二甲基雙十八烷基溴化銨的制劑(VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ.Powell禾口Μ·Newman編輯，PlenumPress,1995第157頁(yè))，基于小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)的制劑，基于皂角苷的制劑，基于溶血卵磷脂的制劑，基于泊洛沙姆衍生物的制劑(HunterH.等1991，vaccine,9250-256)(VaccineDesign—TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ·Powell禾口Μ·Newman編輯，PlenumPress,1995第200頁(yè)和第297-311頁(yè))，基于鋁鹽的制劑，或基于它們的組合的制劑(VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ.Powell禾口M.Newman編輯，PlenumPress,1995第249-276頁(yè))。優(yōu)選，油包水乳劑是由液體石蠟構(gòu)成的，由親水性表面活性劑例如聚山梨酸酯80或聚山梨酸酯85構(gòu)成的，以及由親脂性表面活性劑例如油酸失水山梨糖醇酯或三油酸失水山梨糖醇酯構(gòu)成的。在母雞中使用的乳劑的實(shí)例描述于下列中=Stone等(1983,AvianDis.,27:688_697；1993；AvianDis.,37:399_405；1991,AvianDis.,358-16)；M.Brugh等(1983，Am.J；Vet.Res.,4472~75)；WoodwardL.等(1985，Vaccine,3137-144)；(VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach由Μ·Powell禾口Μ·Newman編輯，PlenumPreSS，1995第219頁(yè))。疫苗株通常來自于野生型株，其已經(jīng)在母雞、火雞、鴨、鵝或在其他禽類物種中得到分離，最通常這種株對(duì)于母雞是低病原性的。作為用于制備保護(hù)母雞抵抗禽流感的亞型H5或H7的疫苗的分離物(野生型株)的例子，提到的是A/火雞/威斯康星/68或A/小雞/意大利/22A/98分離物(具有H5N9亞型病毒株)，A/火雞/英格蘭/N-28/73，A/小雞/墨西哥/238/94/CPA，A/小雞/墨西哥/232/94/CPA或A/鴨/波茨坦/1402/86分離物(具有H5N2亞型的病毒株)，A/鵝/廣東/1/1996分離物(具有H5N1亞型的HP病毒株)，A/小雞/意大利/AG-473/1999或者A/小雞/意大利/1067/1999分離物(具有H7W亞型的病毒株)，A/小雞/巴基斯坦/95分離物(具有H7N3亞型的HP株)，以及A/鴨/波茨坦/15/80分離物(具有H7N7亞型的病毒株)。作為用于保護(hù)家禽抵抗H9亞型禽流感的H9N2病毒株的實(shí)例，可以提到的是A/小雞/伊朗/AV12221/98和A/小雞/UAE/415/99分離物。作為用于保護(hù)母雞抵抗H6亞型禽流感的H6N2病毒株的實(shí)例，可以提到的是A/火雞/意大利/90分離物。用于制造疫苗的疫苗株還可以是野生型株的重配株，特別的是通過反向遺傳學(xué)獲得的。特別地，可以提到的是Re-I疫苗株，其是通過反向重組H5W野生型株A/鵝/廣東/1/96與“主體”株A/PR/8/34而獲得的重配株，其在雞蛋中非常好地再生產(chǎn)(Tian等，2005，Virology，341:153-162)。通過反向遺傳學(xué)獲得的重配株的另一個(gè)實(shí)例是通過遺傳重配獲得的H5N3株，其含有A/小雞/越南/C58/04H5N1株的H5血凝素，A/鴨/德國(guó)/1215/73H2N3株的神經(jīng)氨酸酶，以及A/PR/8/34“主體”株的內(nèi)部基因(Webster等，2006，Virology,351:301_311)。針對(duì)禽流感的疫苗通常含有單一滅活流感病毒株的病毒(單價(jià)疫苗)，但在某些情況中，有利的是使用含有多種滅活流感病毒株的多價(jià)疫苗。特別地，其是基于H7N1和H5N9株的疫苗，其為含有A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)和A/小雞/意大利/1067/1999(H7N1)的滅活疫苗株的水包油乳劑。滅活的疫苗還可以含有不同的效價(jià)，例如抗H9N2禽流感和新城疫病的二價(jià)疫苗。通常，通過腸胃外(肌內(nèi)或者皮下)給藥所述滅活的疫苗。它們還可以以噴劑的形式給藥，如在InvestigacionAplicada銷售的AerovacAI疫苗情況中，其含有滅活的疫苗株A/小雞/墨西哥/232/94/CPA(H5N2)。免疫方案通常包括一次或者間隔24周的兩次給藥。所給藥的疫苗劑量根據(jù)動(dòng)物的年齡而變化，但通常包含在滅活前具有IO8IOkiEID5ciAiI滴度的10200μ1尿囊液的等同物。通常在0.05Iml范圍內(nèi)的體積中給藥所述疫苗劑量。滅活禽流感疫苗的制備描述于H.Stone(1987，AvianDis.31:483-490)。在疫苗株HA亞型與引起致病性禽流感的株的HA亞型相同，以及基于約80%90%的通過整體序列對(duì)比程序測(cè)定的兩種HA的蛋白質(zhì)序列之間的同一性的情況下，所獲得的抵抗禽流感臨床癥狀(發(fā)病率和死亡率)的保護(hù)率通常大于80%，優(yōu)選大于90%。這是通過M.Bublot等，2007，AvianDis.51:332_337的研究確認(rèn)的，該研究顯示疫苗株HA的蛋白質(zhì)序列與致病性感染株HA的蛋白質(zhì)序列之間約80%90%的同一性程度足以獲得該保護(hù)率。此外，為了獲得該保護(hù)率，疫苗株的HA亞型不必要與致病性感染株的NA亞型相同。此外，禽流感疫苗大大地降低了病毒在用感染性病毒攻擊的經(jīng)免疫動(dòng)物中的排泄，這是通過口腔和泄殖腔樣品中觀察到的病毒負(fù)載的非常明顯降低得到證實(shí)(M.Bublot等，2007，AvianDis.51:332_337)。禽流感疫苗的另一個(gè)有利的效果是降低病毒在母雞農(nóng)場(chǎng)中的擴(kuò)散。按照本發(fā)明的方法的另一種實(shí)施方式，用于免疫母雞的疫苗是含有減毒流感病毒株的組合物形式的。疫苗株通常是重配株(Wassortant)形式的，其在表達(dá)所關(guān)心的HA和次要地表達(dá)所關(guān)心的NA的野生型株與已經(jīng)冷適應(yīng)和/或?qū)囟让舾械?主體"株之間進(jìn)行遺傳重配后進(jìn)行挑選。該重配株(Wassortant)是在它的表面表達(dá)所關(guān)心的HA和次要地表達(dá)NA的病毒株，同時(shí)保持"主體"株的表型特征，其中所述"主體"涉及它僅在低于鳥內(nèi)部溫度的狹窄溫度限制內(nèi)的復(fù)制能力。結(jié)果，疫苗株在已經(jīng)給藥于母雞之后會(huì)以有限地和局部地復(fù)制。獲得這些重配株的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且特別地描述在WO03/091401與W02006/063053中，以及在WareingM.D.等，2002，Vaccine20；2082-2090中。通常通過噴霧法進(jìn)行疫苗的給藥。另一種生產(chǎn)減毒株的方法是截短編碼NSl蛋白質(zhì)的基因(RichtJ.A.等，VaccinationofpigsagainstswineinfluenzavirusesbyusinganNSl—truncatedmodifiedlive-virusvaccine,2006,J.Virol.,8011009-18；QuinlivanΜ.等，AttenuationofequineinfluenzavirusesthroughtruncationsoftheNSlprotein,2005,J.Virol.,798431-9)可以以任何方式生產(chǎn)疫苗株，通過使用在細(xì)胞如Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞或者小雞胚細(xì)胞(CEK，PCJ)的培養(yǎng)技術(shù)和/或使用傳統(tǒng)的在含胚雞蛋上生產(chǎn)的方法。用于收獲、純化和根據(jù)所述情況下的滅活病毒的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，疫苗是以在體外表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的形式。例如HA可以在使用重組桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生(CrawfordJ.等，Baculοvirus-derivedhemagglutininvaccinesprotectagainstlethalinfluenzainfectionsbyavianH5andH7subtypes,1999，Vaccine,17:2265_74)。血凝素還可以在體外以“病毒樣顆?！?VLP)的形式表達(dá)(PrelA.等，AssessmentoftheprotectionaffordedbytriplebaculovirusrecombinantcoexpressingH5,N3,MlproteinsagainstahomologousH5N3low-pathogenicityavianinfluenzaviruschallengeinMuscovyducks,2007,AvianDis.,51484-9；PushkoP.等，Influenzavirus-IikeparticlescomprisedoftheHA,NA,andMlproteinsofH9N2influenzavirusinduceprotectiveimmuneresponsesinBALB/cmice,2005,Vaccine,23:5751_9)或者以基于反轉(zhuǎn)錄病毒的假模標(biāo)本的形式表達(dá)(SzecsiJ.等，2006，Virol.J.，3:70)。體外生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或者所產(chǎn)生的病毒顆粒被或多或少地純化，隨后用各種佐劑進(jìn)行輔助，諸如在滅活疫苗中所使用的那些。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案，流感疫苗包含載體，所述載體含有編碼流感病毒HA的核酸片段。術(shù)語(yǔ)"載體"是指核酸結(jié)構(gòu)，其可以在生物體、細(xì)胞或者細(xì)胞組分中增殖和/或轉(zhuǎn)移到生物體、細(xì)胞或者細(xì)胞組分中。特別地，這包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、前病毒、噬粒與人工染色體，其能夠自主復(fù)制，或者其能夠整合到宿主細(xì)胞的染色體中。表達(dá)"含有編碼流感病毒的HA和/或NA的基因的載體"理解為其含有編碼所關(guān)心的HA和/或NA的核酸，并且其在引入到禽類細(xì)胞之后，能在該細(xì)胞中表達(dá)HA和/或NA的核酸的載體。其可以是表達(dá)所關(guān)心的HA的質(zhì)粒，但其通常是病毒載體，該病毒載體在其基因組中包含編碼所關(guān)心的HA并且能在受感染細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)心的HA的核酸。編碼HA的核酸整合到病毒載體的基因組中通常是通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行的，特別地通過遺傳重組、克隆、反向遺傳學(xué)等等。HA可以或者不可以在病毒載體的表面上表達(dá)。優(yōu)選，病毒載體已經(jīng)通常通過多次體外傳代進(jìn)行減毒，或者通過缺失某些基因而被減毒，以便載體病毒在禽類細(xì)胞中的復(fù)制被充分地限制并且對(duì)母雞的整體狀況沒有影響，因此被認(rèn)為是不致病的。作為病毒載體的例子，可以提到的是禽類副粘病毒(GeJ.，等，Newcastlediseasevirus-basedliveattenuatedvaccinecompletelyprotectschicksandmicefromlethalchallengeofhomologousandheterologousH5Nlavianinfluenzaviruses，2007，JVirol.，81:150-8)；火雞皰疹病毒(HVT)或者馬立克氏病(Marek，sdisease)皰疹病毒(Sondermeijer等，1993，Vaccine，11，349-358)；傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)(VeitsJ.，等，Deletionofthenon-essentialULOgeneofinfectiouslaryngotracheitis(ILT)virusleadstoattenuationinchicks，andULOmutantsexpressinginfluenzavirushaemagglutinin(H7)protectagainstILTandfowlplague，2003，JGen.Virol.，84:3343_52；LuschowD.等，ProtectionofchicksfromlethalavianinfluenzaAvirusinfectionbylive-virusvaccinationwithinfectiouslaryngotracheitisvirusrecombinantsexpressingthehemagglutinin(H5)gene,2001,Vaccine,19:4249_59)；腺病毒(FrancoisΑ.等，AvianadenovirusCELOrecombinantsexpressingVP2ofinfectiousbursaldiseasevirusinduceprotectionagainstbursaldiseaseinchickens，2004，Vaccine,22:2351_60；GaoW.等，ProtectionofmiceandpoultryfromlethalH5N1avianinfluenzavirusthroughadenovirus-basedimmunization，2006，JVirol.,801959-64；ToroH.等，Protectiveavianinfluenzainovovaccinationwithnon-replicatinghumanadenovirusvector,2007，Vaccine,25:2886_91)；冠狀病毒(Cavanagh,2007,VetRes.38:281_97；Eriksson,2006，Clin.Dev.Immunol.13:353_60)，但優(yōu)選使用痘病毒用于免疫母雞，特別是牛痘病毒，NYVAC(缺失牛痘病毒)，牛痘病毒MVA株，特別是禽痘(avipoxes)，尤其是金絲雀痘，ALVAC(減毒金絲雀痘)，鴿子痘，鵪鶉痘，火雞痘，麻雀痘和最特別地家禽痘(fowlpox),TROVAC(減毒的家禽痘)，其特別地被描述于AU701599B,AU701781B和US5，756，103中。如果需要，減毒的病毒載體僅表達(dá)所關(guān)心的HA特別地，其是含有表達(dá)H5N8流感病毒株(A/火雞/愛爾蘭/1378/83)的HA的TROVAC家禽痘載體的疫苗。在其他的情況中，減毒的病毒載體同時(shí)表達(dá)所關(guān)心的HA和所關(guān)心的NA的組合，例如描述于2003，AvianPathology,3225-32的重組痘病毒，其同時(shí)表達(dá)來源于H5m流感病毒株的HA和NA。所關(guān)心的NA是這樣的NA，其通常與尋求免疫并保護(hù)母雞抵抗的病毒株的NA具有相同的亞型。在其他情況中，減毒的載體表達(dá)多種屬于不同亞型的所關(guān)心的HA，正如在MingXiaoM.等，2006，Vaccine，24:4304-4311所描述的重組痘病毒的情況中，其同時(shí)表達(dá)H5和H7亞型。通過向其引入編碼發(fā)揮免疫刺激能力的細(xì)胞因子和/或趨化因子(如IL-1，IFN，CSF，GM-CSF，IL_2，IL-12，IL-18或者TNF5)的基因可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些載體的免疫原性能力(Vaccine，(2006),244304-4311)。基于編碼流感病毒HA的疫苗還可以被輔助(adjm^s)以提高它們的免疫原性。特別地，根據(jù)載體，可以通過各種途徑給藥含有病毒載體的疫苗組合物例如借助或不借助針通過肌內(nèi)、皮下或者透皮路線刺穿翅基膜(痘病毒載體)(任何載體)，通過卵內(nèi)路線(在17-19天含胚雞蛋中；例如HVT/Marek與腺病毒載體)，通過眼睛或者口鼻路線，通過噴霧，或者在飲用水中(副粘病毒、冠狀病毒、腺病毒載體)，通過一次注射或者間隔至少15天的分開兩次注射。對(duì)于家禽痘載體而言，所給藥的疫苗劑量是大約17個(gè)log1(150%感染單位，其中優(yōu)選24個(gè)Iogltl的劑量。與使用滅活或者減毒完整流感病毒的傳統(tǒng)免疫相比，基于病毒載體的免疫的優(yōu)點(diǎn)存在于這樣的事實(shí)，即可以將所免疫的動(dòng)物與受到感染的動(dòng)物區(qū)分開。此外，利用病毒載體的免疫促進(jìn)了細(xì)胞免疫的產(chǎn)生，這能夠增強(qiáng)對(duì)動(dòng)物的保護(hù)。正如在AvianDis.，(2007)，51:325_331和AvianDis.，(2007)，51:498_500中所述的，在母雞中所獲得的保護(hù)程度以及在家禽農(nóng)場(chǎng)中病毒擴(kuò)散的降低與利用含有滅活流感病毒的傳統(tǒng)疫苗所觀察到的大致相等。如果對(duì)母雞的免疫包括多次注射，則在首次給藥中使用的疫苗可以與在第二次注射或者后續(xù)注射中所使用的疫苗不同。可以使用兩種不同的減毒病毒載體，例如在第一次免疫中使用表達(dá)所關(guān)心的HA的重組ALVAC載體，以及在后續(xù)免疫中使用表達(dá)所關(guān)心的相同HA的重組TROVAC或者NYVAC載體，以便針對(duì)ALVAC載體的抗體應(yīng)答不阻止用重組TROVAC或者NYVAC的載體感染母雞細(xì)胞并因此阻止在感染的細(xì)胞中HA的表達(dá)。還可以使用“初始-增強(qiáng)(prime-boost)”方法，其包括在首次注射中使用表達(dá)HA的減毒的病毒載體，在所述一次或多次增強(qiáng)注射中使用含有例如一種或者更多種滅活疫苗株的疫苗，所述滅活疫苗株與在首次免疫中所使用的HA屬于相同的亞型，或者，以相反的順序進(jìn)行。最后，可以在首次注射中使用表達(dá)所關(guān)心的HA的質(zhì)粒進(jìn)行DNA免疫，隨后使用含有滅活疫苗株和/或減毒病毒載體的疫苗進(jìn)行增強(qiáng)注射，其中所述滅活疫苗株和/或減毒病毒載體表達(dá)與在首次免疫中所使用的HA屬于相同亞型的HA，或者與首次免疫中所使用HA相同的HA。無論給藥何種類型的疫苗或者采用何種免疫方案，通常在給藥疫苗劑量后718天的時(shí)間內(nèi)都可以相當(dāng)快速地為母雞提供抵抗禽流感的保護(hù)。然而，為了確保在它們整個(gè)產(chǎn)卵活性期(大約持續(xù)1年)內(nèi)保護(hù)母雞抵抗禽流感，推薦在首次疫苗給藥后，在316周的期間內(nèi)進(jìn)行一次或者兩次增強(qiáng)接種。許多利用滅活疫苗的接種方案可以用于產(chǎn)卵的母雞中例如2次注射，首次在36周大時(shí)進(jìn)行第一次，在剛好在開始產(chǎn)卵之前1619周大時(shí)進(jìn)行第二次；或者3次注射，在大約24周時(shí)進(jìn)行第一次，34周之后進(jìn)行第二次，以及剛好在開始產(chǎn)卵之前1619周大時(shí)進(jìn)行第三次。在產(chǎn)卵過程中給藥增強(qiáng)劑。在使用兩種不同的疫苗的“初始-增強(qiáng)”方案中，可以在第一天大時(shí)用基于禽痘載體的疫苗對(duì)小雞進(jìn)行免疫；隨后它們接受用含有滅活流感病毒進(jìn)行的一次免疫(在正好在開始產(chǎn)卵之前的1619周大時(shí))，或者兩次免疫(在第36周大時(shí)，以及在正好在開始產(chǎn)卵之前的1619周大時(shí))在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，優(yōu)選從這些母雞獲取雞蛋一次，確保保護(hù)母雞抵抗禽流感，所述保護(hù)通常在給藥疫苗后718天的期間內(nèi)發(fā)生(BublotM.等(2006，AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciencesl081:193-201)；VanderGoot等(2005,Proc.Natl.Acad.Sc.，102:18141-6)；Ellis等(AvianPathol.2004，33，405-412))。盡管在來自經(jīng)免疫母雞的雞蛋中存在流感病毒，尤其是針對(duì)HA的抗體，特別是存在抑制血凝的抗體(IHA)(其阻斷流感病毒滲入敏感細(xì)胞中)，但用于從來源于經(jīng)免疫抵抗流感的母雞的含胚雞蛋生產(chǎn)流感病毒的方法是常規(guī)的。使用來自優(yōu)選已經(jīng)在可控環(huán)境中喂養(yǎng)9天14天的經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋。以下列方式控制胚胎發(fā)生過程使用已經(jīng)在1020°C之間，優(yōu)選1618°C之間的溫度下通常不超過產(chǎn)卵后一周時(shí)間保存的雞蛋。通過在潮濕室中在37.5°C士1°C的溫度下孵化雞蛋914天而觸發(fā)胚胎發(fā)生過程，其中所述潮濕室具有70士10%的相對(duì)濕度。通過透照驗(yàn)蛋來挑選含胚雞蛋，并且利用在小體積(大約0.10.2ml)的通常為27個(gè)IogltlTCID5ci的病毒劑量感染它們的尿囊腔。在溫度下(其也可以根據(jù)病毒株的表型以及它們的冷適應(yīng)或者熱適應(yīng)的程度而變化)使病毒擴(kuò)增一段時(shí)間(通常為14天，這取決于病毒株的毒力)。用于流感病毒擴(kuò)增的溫度通常在28390C的范圍內(nèi)，并且通常為在3339°C的溫度范圍內(nèi)。隨后收獲感染性尿囊液，并且根據(jù)期望進(jìn)行的的用途而進(jìn)行處理。這種方法可以用于生產(chǎn)流感病毒，其HA亞型與在用于免疫母雞的疫苗中所包含的HA的亞型不同。例如其為這樣一種情況利用滅活病毒H5N9對(duì)母雞進(jìn)行免疫以保護(hù)母雞抵抗H5禽流感的情況，而來自這些母雞的雞蛋被感染Hmi或者H3N2流感病毒，或者甚至B型流感病毒，以制備抵抗目前人類流感流行形式的疫苗。根據(jù)本發(fā)明方法的變型，通過使用來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋而生產(chǎn)的流感病毒的HA亞型具有與用于免疫母雞的HA不同的亞型，但另一方面，所生產(chǎn)的流感病毒的NA與疫苗中所使用病毒的NA具有相同的亞型。例如其為這樣一種情況用滅活H5W病毒株或表達(dá)H5和附的重組痘病毒免疫母雞以保護(hù)母雞抗禽流感，而來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋被感染Hmi病毒株。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)模式，在來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋上生產(chǎn)的流感病毒的HA具有與在用于免疫母雞的疫苗中所含有的HA相同的亞型。例如其為這樣的情況利用滅活H5W病毒或表達(dá)H5的重組痘病毒免疫母雞，而來自經(jīng)免疫母雞的雞蛋被感染H5W或者H5N9流感病毒。盡管在雞蛋中存在“亞型”特異性交叉反應(yīng)性的抗HA抗體(當(dāng)在疫苗組合物中含有的HA具有與感染來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋的流感病毒株的HA相同的亞型時(shí)，其為這樣情況)，其對(duì)病毒的復(fù)制沒有負(fù)面影響。更加令人吃驚地，在用于感染來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋的流感病毒與用于免疫這些母雞的流感病毒之間存在完全同一性的情況中，這種復(fù)制未受到影響。在這種情況中，這一點(diǎn)表現(xiàn)為在雞蛋中存在更寬的一系列抗HA抗體，因?yàn)橥瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)亞型特異性交叉反應(yīng)性抗HA抗體和該株的非常特異性的抗HA抗體(也成為株特異性抗體)(參見實(shí)施例3)。因此，與廣泛建立的觀點(diǎn)不同，抗流感抗體在雞蛋中的存在，特別是抗HA抗體的存在不影響流感病毒的復(fù)制。在來源于雞蛋(該雞蛋來自于已經(jīng)針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞)的被感染的尿囊液中收獲的病毒和/或血凝抗原的量與在來源于產(chǎn)自未經(jīng)免疫母雞的雞蛋的被感染的尿囊液中收獲的量大致相同(參見實(shí)施例1和2)。還可以利用本發(fā)明的方法用于制造重配病毒株。在這種情況中，在第一步驟中，用野生型病毒株和主體病毒株共感染來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋，其中所述主體病毒株在含胚雞蛋中復(fù)制良好，例如A/PR/8/34株。在第二步驟中，收集被感染的尿囊液，其基本上含有重配株和主體株的混合物，而較差復(fù)制能力的野生型株通常是非常少量的。隨后通過連續(xù)克隆步驟(在每個(gè)克隆步驟中混合根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法收獲的具有對(duì)A/PR/8/34特異性的抗-HA和抗-NA抗體的感染性尿囊液)，進(jìn)行選擇同時(shí)表達(dá)A/PR/8/34株的表型特征(即它在含胚雞蛋中良好的復(fù)制能力)以及野生型株的HA和NA的重配株。為了獲得減毒活病毒疫苗，還可以制造冷適應(yīng)和熱敏感重配株。在這種情況中，在第一步驟中，用野生型病毒株和主體株(其具有冷適應(yīng)和熱敏感的表型特征)共感染來自經(jīng)免疫母雞的含胚雞蛋。在這種情況中，用于孵化被感染雞蛋的溫度比正常溫度低(該溫度通常低于35°C，或者甚至低于30°C)。在第二步驟中，收集基本上含有重配株和主體株的混合物的被感染的尿囊液，因?yàn)槔涿舾行缘囊吧晡幢粡?fù)制。隨后通過連續(xù)克隆步驟(在每個(gè)克隆步驟中混合根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法收獲具有對(duì)主體株特異性抗-HA和抗-NA抗體的感染性尿囊液)，進(jìn)行選擇同時(shí)表達(dá)主體株表型特征(尤其是冷適應(yīng)和/或其熱敏感性)和野生型株的HA以及NA的重配株。最重要的，進(jìn)行本發(fā)明的方法用于制備疫苗，所述疫苗用于保護(hù)飼養(yǎng)的母雞，以及更通常地飼養(yǎng)的家禽(鴨、火雞、鵝等等)抵抗禽流感。在禽流感的無癥狀或溫和形式中所牽連的病毒株可以是任何亞型的，特別是H9N2、H6N2、H7N2、H7N3或H7W亞型。它們?cè)陲曫B(yǎng)群體中不引起大的死亡率，但是可以是產(chǎn)蛋暫時(shí)減少的原因。在引起在飼養(yǎng)群體中大的死亡率的禽流感嚴(yán)重形式中所牽連的高病原性病毒株通常屬于H5和H7亞型，特別是H5W、H5N2、H5N8、H5N9、H7NUH7N3,H7N4或H7N7。通常，包含于在本發(fā)明方法步驟a)中用來使免疫母雞抵抗禽流感的疫苗組合物中的流感病毒的血凝素，與用于在方法的步驟c)中感染含胚雞蛋的病毒的血凝素具有相同的亞型，并特別地選自H5、H6、H7和H9亞型，因?yàn)樗鼈兪侵饕卦谝鹎萘鞲械牟《局曛邪l(fā)現(xiàn)的那些。在具體的方面中，包含于在本發(fā)明方法步驟a)中用來免疫母雞抵抗禽流感的疫苗組合物中的流感病毒的血凝素，與在方法的步驟c)中用于感染含胚雞蛋的病毒的血凝素具有相同的亞型，并選自H5和H7亞型，因?yàn)樗鼈兪窃谝鹎萘鞲泻腿肆鞲袊?yán)重形式的病毒株中發(fā)現(xiàn)的那些。已經(jīng)被表征的引起禽流感和/或人流感的嚴(yán)重形式的病毒株通常屬于H5N1、H5N2、H7N1、H7N3或H7N7亞型。如此，非常具體地，本發(fā)明的主題是用于生產(chǎn)流感病毒的方法，根據(jù)該方法a.利用滅活的完整流感病毒免疫母雞，其中病毒的血凝素具有H5或H7亞型，b.從經(jīng)免疫的母雞獲得雞蛋，c.觸發(fā)胚胎發(fā)生過程，d.通過將與用于免疫的流感病毒一致的流感病毒引入含胚雞蛋的尿囊腔中來感染所述含胚雞蛋，e.在允許病毒復(fù)制的溫度和濕度的條件下孵化感染的含胚雞蛋，和f.收獲包含病毒的尿囊液。當(dāng)母雞免疫方案考慮兩次注射時(shí)，可以利用疫苗組合物(其包含載體(通常為痘病毒)代替滅活的完整的流感病毒，其中所述載體包含編碼H5或H7亞型流感病毒的血凝素的基因)進(jìn)行第一次注射.當(dāng)感染的尿囊液用于生產(chǎn)流感疫苗時(shí)，本發(fā)明的方法通常包括額外的凈化病毒株步驟，以及任選地在其之后或之前有病毒滅活步驟，該滅活步驟使用如在FR2201079或在FR1538322中所描述的那些本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。純化可以是簡(jiǎn)化的并且可以限定為在通常已經(jīng)澄清感染的尿囊液后通過離心濃縮病毒的步驟。純化可以被補(bǔ)充有區(qū)帶離心步驟，其例如借助蔗糖密度梯度進(jìn)行(EP07760362)。也可以進(jìn)行層析法以純化病毒。如此獲得包括在滅活的完整疫苗或減毒疫苗組合物中的純化的完整病毒的懸浮液。通過傳統(tǒng)的方式進(jìn)行病毒懸浮液的滅活，其使用β-丙醇酸內(nèi)酯(E.Budowsky等1991，Vaccine,9:319_325；1991，Vaccine,9:398_402；1993，Vaccine,11:343_348)、吖丙啶或者衍生物(D.King1991，AvianDis.35:505-514)或者甲酸(EP07760362).可以利用一種或者更多種佐劑配制基于滅活的完整病毒的疫苗組合物。雖然通常這些疫苗可以利用鋁鹽或在油包水或水包油乳劑中進(jìn)行配制(在禽流感疫苗的情況中)，但通常使用由液體石蠟、親水表面活性劑例如聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯83或聚山梨酸酯85以及親脂表面活性劑例如脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇倍半油酸酯或脫水山梨糖醇三油酸酯組成的油包水乳劑?？梢允褂萌魏文茉黾俞槍?duì)流感的體液和/或細(xì)胞應(yīng)答的佐齊IJ。作為佐劑配方的非限制性例子，可以提到的是MF59乳劑，基于脂質(zhì)體的制劑、基于MPL的制劑、基于小棒狀桿菌的制劑、基于皂角苷的制劑、基于溶血卵磷脂的制劑、基于泊洛沙姆衍生物的制劑、或者他們的組合。純化的病毒懸浮液還可以經(jīng)歷后續(xù)處理。因此，獲得了流感病毒衍生的產(chǎn)品。例如，可以使用去污劑或者脂類溶劑根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法對(duì)病毒懸浮液進(jìn)行片段化以制造例如含有流感病毒的血凝素的基于片段化或分裂的病毒的疫苗、病毒體或者亞單位疫苗。從純化的病毒獲得的片段化或者分裂的病毒、含有流感病毒的血凝素的病毒體和含有流感病毒的血凝素的亞單位疫苗被認(rèn)為是流感病毒衍生的產(chǎn)品。類似地，可以利用一種或者更多種佐劑配制含有這些衍生產(chǎn)品的疫苗。通過本發(fā)明方法獲得的疫苗用于保護(hù)人類和動(dòng)物抵抗流感。在獸醫(yī)領(lǐng)域，疫苗主要用于禽流感防治領(lǐng)域，但其也可以用于防止或者減少流感癥狀和/或在馬科成員特別是馬、犬科成員特別是狗、貓科成員特別是貓、豬科成員特別是豬、貂科成員特別是貂和雪貂和禽類物種特別是母雞、鴨、火雞、鵪鶉、珠雞、鵝和鴕鳥中的病毒排泄物。當(dāng)疫苗組合物包含滅活完整病毒株或衍生產(chǎn)品時(shí)，它通常被皮下或肌內(nèi)或任選地以噴霧材料(n0bulis&0的形式在飼養(yǎng)家禽群體中給藥。當(dāng)疫苗以減毒活病毒的形式時(shí)，則其通常通過口鼻、通過噴霧、在飲用水中或者作為眼睛的滴液進(jìn)行給藥。免疫方案通?？紤]用于注射或者在注射后進(jìn)行增強(qiáng)。所給藥的疫苗劑量取決于動(dòng)物的尺寸和年齡。通常含有20200μ1尿囊液，其在滅活之前具有IO8IOiqEID5qAiI的滴度，以0.05Iml之間的體積進(jìn)行注射。在人類中，疫苗用于流行性流感和大流行性流感預(yù)防領(lǐng)域。雖然流行性流感影響已經(jīng)通過接觸(通過感染)或者免疫接種一種或者更多種流感病毒株而敏化的人類群體(對(duì)于所述流感病毒，與引起流行的病毒株的HA存在抗原性聯(lián)系(parentSantigSnique)，并在所述流感病毒中，存在某些免疫性)，但大流行性流感影響未被新病毒株敏化的人類群體(即使其僅僅是部分有效的)，因?yàn)檫@種新株的HA與現(xiàn)有循環(huán)的病毒株沒有或幾乎沒有抗原性聯(lián)系。流行性流感疫苗是用于保護(hù)人類群體以抵抗季節(jié)性流感形式，這些季節(jié)性流感形式是由季節(jié)性循環(huán)流感病毒株引起的，所述季節(jié)性循環(huán)流感病毒株與現(xiàn)有已經(jīng)循環(huán)的病毒株具有抗原性聯(lián)系。目前，引起流行性流感的流感病毒株(其為流行性流感病毒株)是A型的，并且屬于Hmi或者H3N2亞型，或者是B型的。大流行性流感疫苗是用于保護(hù)人類群體抵抗大流行性流感病毒株的感染，其中所述大流行性流感病毒株是新型的流感病毒株，就HA而言，其沒有與現(xiàn)有循環(huán)的病毒株的抗原性聯(lián)系。流行性或者大流行性流感病毒可以是減毒活疫苗或者滅活疫苗的形式，盡管優(yōu)選滅活疫苗用于預(yù)防大流行性流感。疫苗可以為單價(jià)疫苗(從單種流感病毒株制備的疫苗)，或者是多價(jià)疫苗(從多種流感病毒株制備的疫苗)形式。流行性流感疫苗的組合物目前是三價(jià)疫苗形式的，其是從H3N2和Hmi株和從B型病毒株制備的。通常，滅活疫苗通常是完整病毒、片段化病毒(分裂病毒)或者病毒體或者含有HA的亞單位形式，以及任選地含有一種或者更多種佐劑(如上面所提到的那些)。雖然，通常通過口腔或者鼻途徑給藥減毒活疫苗，以促進(jìn)粘膜免疫性的產(chǎn)生，但還可以腸胃外(肌內(nèi)或者皮下)、皮內(nèi)或者甚至經(jīng)粘膜(甚至鼻內(nèi))或者甚至通過組合兩種不同的給藥路線(如在W001/22992中所描述的)而給藥。免疫方案通常考慮注射或者在注射后進(jìn)行增強(qiáng)。所給藥的疫苗劑量依賴于個(gè)體的年齡，依賴于存在或者不存在佐劑。通常，疫苗劑量含有15μg包含于疫苗中的各種疫苗株的HA的等同物。在對(duì)疫苗進(jìn)行佐劑化時(shí)，該劑量可以降低到大約12μgHA，或者在患有免疫缺陷的或年長(zhǎng)的個(gè)體中提高至30μgHA或者甚至更多。最后，本發(fā)明的主題是來自針對(duì)流感經(jīng)免疫的母雞的雞蛋用于生產(chǎn)流感病毒或者用于制造流感疫苗的用途。與廣泛建立的觀點(diǎn)相反，在來自經(jīng)免疫母雞的雞蛋中存在針對(duì)流感病毒的血凝素的抗體不影響在感染它們的尿囊腔之后產(chǎn)生的流感病毒量。下面的實(shí)施例以非限制性方式描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方式。圖1表示了供體質(zhì)粒pJY1394.1的完整核苷酸序列。圖2表示在供體質(zhì)粒pJY1394.1中插入的核苷酸序列，其包含側(cè)翼插入基因座F8的臂，以及H6牛痘啟動(dòng)子，之后為在編碼A/小雞/印度尼西亞/7/03株的HA的切割位點(diǎn)被修飾的合成基因。這些序列的各個(gè)起點(diǎn)如下1-53克隆質(zhì)粒的部分序列，其包含M13F引物的序列(下劃線)。54-1483側(cè)翼TROVAC家禽痘載體基因組中F8插入基因座的〃左臂〃序列1484-1568左臂和H6啟動(dòng)子之間的連接序列。1569-1692牛痘病毒H6啟動(dòng)子的序列。1693-3387=A/小雞/印度尼西亞/7/03株的經(jīng)修飾的合成HA基因序列；氨基酸序列是使用每個(gè)氨基酸一個(gè)字母代碼在核苷酸序列上面所顯示的。3388-3414:HA基因和右臂之間的連接序列，其含有禽痘早期基因的TTTTTAT轉(zhuǎn)錄終止序列。3415-4790側(cè)翼TROVAC家禽痘載體基因組中F8插入基因座的〃左臂〃的序列。4791-4885克隆質(zhì)粒的部分序列，其包含M13F引物的序列(下劃線)。t··1力fe，這力客g/20/99(HlNl)禾ΠΑ/紐約/55/04(H3N2)，1；用干#用來自母雞的含胚雞蛋制各抵,杭人類箭聽翩減戸斤側(cè)■尸麵i寸碰髓鋪*流嘛餓A//丨、·/MlkM/22A/98(H5N9)的滅活疫苗而被免疫，或者通過注射編碼H5m株的HA的重組禽痘病毒隨后再Il二？欠灃射含有禽流感病毒株A//NXl/意大禾U/22A/98(H5N9)的滅活疫龍而被免疫1.1)操作規(guī)程1.1.1)重組載體VFP2211的構(gòu)建VFP2211是重組家禽痘病毒，在其基因組中已經(jīng)插入了編碼A/小雞/印度尼西亞/7/03H5m株的血凝素(HA)的合成基因。合成HA基因以便獲得開放閱讀框，其編碼與GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中以參考號(hào)EF473080(或者Genp印t蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)以參考號(hào)AB030346)描述的A/小雞/印度尼西亞/7/03株的天然序列(除了切割位點(diǎn)之外)一致的氨基酸序列。利用RE――TRG序列置換位于位點(diǎn)339和347之間的RERRRKKRG氨基酸序列(對(duì)應(yīng)于高病原性株的切割位點(diǎn))。如此所修飾的該切割位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于亞型H5的低病原性株的切割位點(diǎn)。在第一步驟中，構(gòu)建了包含合成HA基因的供體質(zhì)粒，該合成HA基因在H6牛痘啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行修飾(TaylorJ.等，Vaccine，1988，6:504_508；GuoP.等，J.Virol.，1989,634189-4198；PerkusM.等，J.Virol.，1989，63:3829_3836)并且由F8插入基因座的側(cè)翼臂圍繞以允許將HA基因插入到禽痘載體基因組的F8插入基因座中。F8插入基因座對(duì)應(yīng)于Srinivasan禾口Tripathy(2005，VeterinaryMicrobiology108:215—223)所描述的編碼光解酶的禽痘基因；該基因還以名稱FPV158描述于禽痘基因組的完整序列中(GenBank,參考號(hào)AF198100)。將HA基因和H6啟動(dòng)子插入到F8基因座中結(jié)果是從重組禽痘病毒基因組缺失FPV158基因。質(zhì)粒pJY1394.1的完整核苷酸序列以及一系列圍繞HA基因的核苷酸序列(其也存在于質(zhì)粒的完整序列中)被分別描述在圖1和2中。隨后通過質(zhì)粒pJY1394.1的側(cè)翼臂和禽痘基因組之間的雙重組(doublerecombinaison)而獲得重組病毒vFP2211。為此，使用利用NotI線性化的質(zhì)粒pJY1394.1轉(zhuǎn)染原代小雞胚原始細(xì)胞，并用親代禽痘株(TROVAC載體)感染(感染強(qiáng)度為10)。TROVAC載體衍生自由Merial生產(chǎn)的在小雞中抵抗禽痘的Diftosec的疫苗株。通過在裂解斑上用檢測(cè)所插入HA基因的探針的特異性雜交來選擇重組病毒。進(jìn)而在旋轉(zhuǎn)的瓶子中，在小雞胚細(xì)胞上產(chǎn)生了分離的VFP2211。1.1.2)滅活H5N9疫苗的制備根據(jù)等同于H.Stone(1987，AvianDis.31=483-490)所描述的方法，制備了滅活的H5N9疫苗，其由低病原性A/小雞/意大禾Ij/22A/98H5N9株(IlariaCapua實(shí)驗(yàn)室(IstitutoZooprofilatticoSperimentaledelIeVenezie,LaboratorioVirologia,padova,意大利)提供)和油包水乳劑構(gòu)成，其中所述低病原性A/小雞/意大利/22A/98H5N9株是在含胚雞蛋上生產(chǎn)的并且用β-丙酸醇內(nèi)酯(BPL)滅活，所述油包水乳劑由液體石蠟、脫水山梨糖醇油酸酯和聚山梨酸酯80構(gòu)成。乳劑的表面活性劑混合物的HLB(親脂親水平衡)具有5.3的數(shù)值。疫苗劑量等同于在滅火之前具有IO89EID5ciAil滴度的60μ1尿囊液。1.1.3)使產(chǎn)卵的母雞免疫形成兩組(Gl和G2)l天(O天)Leghorn類型小雞，其具有“無特異病原組織”(EOPS)狀態(tài)。隨后將下面的免疫方案應(yīng)用于組Gl:1天(O天)小雞在頸部的底部皮下接受(使用胰島素注射器)0.2mlVFP2211病毒懸浮液(其具有3.Olog10CCID50A).2ml滴度)。在8周大(S8)時(shí)，使小雞交配。將大約25只小母雞和16只公雞飼養(yǎng)并集合在一起。在17周大(S17)時(shí)，它們接受增強(qiáng)注射在0.5ml的單價(jià)滅活H5N9疫苗體積中的疫苗劑量。將下面的免疫方案應(yīng)用于組G2使用胰島素注射器通過在胸骨中IM途徑，3周大的EOPS小雞接受在0.3ml單價(jià)滅活H5N9疫苗體積中的疫苗劑量。在8周大(S8)時(shí)，使小雞交配。將大約25只小母雞和16只公雞飼養(yǎng)并集合在一起。在17周大(S17)時(shí)，它們接受增強(qiáng)注射0.5ml體積的單價(jià)滅活H5N9疫苗體積的疫苗劑量。1.1.4)利用A/新喀里多尼亞/20/99IVR-116(HlNl)或者A/紐約/55/04X-157(H3N2)病毒株感染來自組Gl和G2的母雞的雞蛋以及來自未免疫母雞的雞蛋的規(guī)程在來自組Gl的母雞的雞蛋(其是在4041周(測(cè)試2)和4950周(測(cè)試3)大時(shí)產(chǎn)下的)中在來自組G2的母雞的雞蛋(其是在2627(測(cè)試1)、4041(測(cè)試2)和4950周(測(cè)試3)大時(shí)產(chǎn)下的)中，評(píng)估了重配疫苗株A/新喀里多尼亞/20/99(xPR8)(稱為A/新喀里多尼亞/20/99IVR-116(HlNl))和A/紐約/55/04(xPR8)(稱為A/紐約/55/04X-157(H3N2))復(fù)制的能力。平行地，以相同的方式在來自未免疫SPE母雞(對(duì)照組)的對(duì)照雞蛋中評(píng)估病毒株A/新喀里多尼亞/20/99(xPR8)(HlNl)和A/紐約/55/04(xPR8)(H3N2)復(fù)制的能力。將在該星期內(nèi)產(chǎn)下的所有雞蛋都保存在控制溫度的室內(nèi)(1215°C)。將來自相同動(dòng)物組和相同測(cè)試的雞蛋合并在一起，隨后在3738°C以每在相對(duì)濕度為大約7080%的室內(nèi)孵化雞蛋10天而觸發(fā)胚胎發(fā)生過程。在孵化10天后，借助透照驗(yàn)蛋裝置確認(rèn)各個(gè)雞蛋中胚胎的成活力，并且用十字叉標(biāo)出尿囊腔。將來自相同動(dòng)物組的相同測(cè)試的含胚雞蛋通過8個(gè)雞蛋組合(poolsde8oeuf)進(jìn)行合并。在對(duì)蛋殼消毒和穿孔之后，而使用在十字叉的位置以200μ1體積注射的相同感染劑量的流感病毒感染相同組合的含胚雞蛋。對(duì)102，103和IO4EID5tl(50%雞蛋感染劑量)的A/新喀里多尼亞/20/99(xPR8)(HlNl)和A/紐約/55/04(xPR8)(H3N2)病毒的感染劑量進(jìn)行測(cè)試。在測(cè)試1和2的雞蛋中測(cè)試每個(gè)雞蛋IO3和IO4EID5tl的感染劑量。在測(cè)試3的雞蛋中測(cè)試每個(gè)雞蛋IO2和IO3EID5tl的感染劑量。隨后，在相對(duì)濕度為80%的室內(nèi)，將被感染的含胚雞蛋在34°C下孵化48小時(shí)，隨后置于+4°C過夜。隨后，從各個(gè)雞蛋提取被感染的尿囊液。通過測(cè)量UHA(血凝單位)滴度而對(duì)所提取的各尿囊液評(píng)估感染滴度。為了測(cè)量被A/紐約/55/04(xPR8)(H3N2)株感染的尿囊液的UHA滴度，使用了火雞紅細(xì)胞。為了測(cè)量被A/新喀里多尼亞/20/99(xPR8)(HlNl)感染的尿囊液的UHA滴度，使用了母雞紅細(xì)胞。UHA滴度是由被感染的尿囊液的最終稀釋度的倒數(shù)表達(dá)的，其在母雞或火雞紅細(xì)胞在0.5%磷酸鹽緩沖液中的懸浮液中存在時(shí)顯示出可見的血凝。1.2)結(jié)果在表I和II中給出了從雞蛋中獲得的UHA滴度的平均值，所述雞蛋來自于各個(gè)經(jīng)免疫和未免疫母雞組，所述UHA滴度的平均值是作為注射入雞蛋中病毒感染劑量以及對(duì)取出雞蛋的時(shí)間的函數(shù)。表I在尿囊液中獲得的血凝滴度，其作為所使用A/新喀里多尼亞/20/99(xPR8)的感染劑量、雞蛋來源(G1，G2，未免疫的對(duì)照)以及產(chǎn)蛋的時(shí)刻(測(cè)試1，測(cè)試2，測(cè)試3)的函數(shù)。感染劑量(EID5。/雞蛋)100100010000M_測(cè)試3測(cè)試1測(cè)試2測(cè)試3測(cè)試1測(cè)試2未免疫對(duì)照_640*1050166012808611522Gl(vFP2211/Vac.Inact,1140NA1974830NA1974H5N9)_______G2(Vac.Inact.H5N9/Va806905166011599051974c.Inact.H5N9)______*使用在各個(gè)條件中所包含的8個(gè)雞蛋的尿囊腔所獲得的8個(gè)UHA滴度/50μ1的幾何平均值的形式表達(dá)血凝滴度。NA:不可應(yīng)用表II在尿囊液中獲得的血凝滴度，其作為所使用的A/紐約/55/04(xPR8)(Η3Ν2)的感染劑量，雞蛋來源(Gl，G2，未免疫對(duì)照)以及產(chǎn)蛋時(shí)間(測(cè)試1，測(cè)試2，測(cè)試3)的函數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*使用在各個(gè)條件中所包含的8個(gè)雞蛋的尿囊腔所獲得的8個(gè)UHA滴度/50μ1的幾何平均值的形式表達(dá)血凝滴度。NA:不可應(yīng)用在表I和II中獲得的結(jié)果顯示來自于經(jīng)免疫的母雞(Gl和G2)的雞蛋的尿囊液的UHA滴度的平均值等同于來自于未免疫母雞的雞蛋的尿囊液的UHA滴度的平均值。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以研究免疫與劑量因素。將UHA的各個(gè)數(shù)值轉(zhuǎn)化為1ο&，隨后使用方差模型進(jìn)行分析。使用該減小范圍Qtenduereduite)的測(cè)試來檢驗(yàn)方差的非齊次性(heterogeneitedesvariances)，其使用模型余數(shù)進(jìn)行(SASv8.2軟件)。對(duì)UHA滴度的各個(gè)數(shù)值進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析顯示沒有免疫效應(yīng)。也沒有任何與用于感染雞蛋的病毒劑量有關(guān)的效應(yīng)。在所研究的產(chǎn)蛋期間(26周(測(cè)試1)50周(測(cè)試3))，UHA滴度基本上不會(huì)變動(dòng)。實(shí)施例2用于生產(chǎn)兩種大流行性疫苗株A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)和A/越南/1194/04NIBRG14(H5N1)的方法，其使用來自母雞的含胚雞蛋，其中所述母雞已經(jīng)利用欠灃射含有禽流感病毒株A//NXl/意大禾U/22A/98(H5N9)的滅活疫龍，或者禾U用灃射編碼H5m株的HA的重組禽痘病毒隨后第二次注射含有禽流感病毒株的滅活H5N9疫苗而進(jìn)行免疫2.1.1)免疫母雞用于免疫母雞的規(guī)程與實(shí)施例1中所使用的規(guī)程一致。2.1.2)用于感染來自于組Gl和G2的母雞的雞蛋和利用A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)和A/越南1194/04NIBRG14(H5N1)病毒株免疫的母雞的雞蛋的規(guī)程除了下列修改，感染規(guī)程與實(shí)施例1所使用的感染規(guī)程相同將來自于LaboratoireIstitutoZooprofilatticoSperimentaledelleVenezie,LaboratorioVirologia,padova,意大利的低病原性A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)禽流感株(soucheaviaire)與減毒流行性重配疫苗株A/越南/1194/04NIBRG14(H5N1)用于感染雞蛋。其中后者病毒株是由NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl(NIBSC)實(shí)驗(yàn)室，SouthMimms，PottersBar,HertsEN63QG,UK提供的，并且通過反向遺傳學(xué)獲得，正如C.Nicolson等，GenerationofinfluenzavaccinevirusesonVerocellsbyreversegenetics:anH5N1candidatevaccinestrainproducedunderaqualitysystem,2005,Vaccine,23:2943_2952所描述的。對(duì)于這兩株測(cè)試102，IO3,IO4和IO5EID5tl(50%雞蛋感染劑量)。在測(cè)試1的雞蛋中，測(cè)試了每個(gè)雞蛋103，104和IO5EID5tl的感染劑量。在測(cè)試2的雞蛋中，測(cè)試了每個(gè)雞蛋IO4和IO5EID5tl的感染劑量。在測(cè)試3中，測(cè)試了每個(gè)雞蛋IO2和IO3EID5tl的感染劑量。使用母雞紅細(xì)胞以測(cè)量被A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)或者A/越南/1194/04NIBRG14(H5N1)感染的尿囊液的UHA滴度。2.2)結(jié)果表III和IV中匯集了在來自于不同組的經(jīng)免疫和未免疫母雞的雞蛋中獲得的UHA滴度(作為注射入雞蛋的病毒的劑量的函數(shù)以及作為獲得雞蛋的時(shí)間的函數(shù))。表III在尿囊液中獲得的血凝滴度，其作為所使用A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)的感染劑量、雞蛋來源(Gl，G2，未免疫對(duì)照)以及產(chǎn)蛋時(shí)間(測(cè)試1，測(cè)試2，測(cè)試3)的函數(shù)感染劑量(EID5。/雞蛋)100100010000100000Ja_測(cè)試3測(cè)試1測(cè)試3測(cè)試1測(cè)試2測(cè)試1測(cè)試2未免疫對(duì)照_35*53_32_53_64_54_S3_Gl(vFP221l/Vac.Inact.H5N9)64_NA54_NA59_NA86_G2(Vac.Inact.H5N9/Vac.Inact.1026457597010259H5N9)________*使用在各個(gè)條件中所包含的8個(gè)雞蛋的尿囊液所獲得的8個(gè)UHA滴度/50μ1的幾何平均值的形式表達(dá)血凝滴度。NA:不可應(yīng)用表IV:在尿囊液中獲得的血凝滴度，其作為所使用A/越南/1194/04(H5N1)RG14的感染劑量、雞蛋來源(Gl，G2，未免疫對(duì)照)以及產(chǎn)蛋時(shí)間(測(cè)試1，測(cè)試2，測(cè)試3)的函數(shù)感染劑量(EID5g/雞蛋)100010000100000_測(cè)試1測(cè)試1測(cè)試2測(cè)試1測(cè)試2未免疫對(duì)照_194*232197172181Gl(vFP221l/Vac.Inact.H5N9)NANA197NA166G2(Vac.Inact.H5N9/Vac.Inact.152279215181235H5N9)______*使用在各個(gè)條件中所包含的8個(gè)雞蛋的尿囊液所獲得的8個(gè)UHA滴度/50μ1的幾何平均值的形式表達(dá)血凝滴度。NA:不可應(yīng)用在表III和表IV中給出的結(jié)果以及統(tǒng)計(jì)分析顯示來自于經(jīng)免疫的母雞(Gl和G2)的雞蛋的尿囊液的UHA滴度與來自于未免疫母雞的尿囊液的UHA滴度相似，即使在這樣的情況下，即與用于感染來自于這些母雞的含胚雞蛋(在用A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)株免疫的組Gl和G2情況中)相同的株進(jìn)行免疫這些母雞。沒有任何與用于感染雞蛋的病毒劑量有關(guān)的效應(yīng)。在所研究的產(chǎn)蛋期間(26周(測(cè)試1)50周(測(cè)試3))，UHA滴度基本上不會(huì)變動(dòng)。如同實(shí)施例1地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。_仿丨丨3俯艦-Η5聽秘離財(cái)戸斤自〒尸肩A/械/意大利/22Α/98(Η5Ν9)疫苗株講行免疫3.1)操作規(guī)程測(cè)量Gl和G2組的母雞的雞蛋中所存在的抗-Η5抗體，其中所述母雞已經(jīng)根據(jù)段1.1.1)中所描述的規(guī)程用A/小雞/意大利/22Α/98(Η5Ν9)株免疫。平行地，還在來自于未免疫母雞(對(duì)照組)的卵黃中分析抗-Η5應(yīng)答在雞蛋黃(或者卵黃體)中分析抗-Η5應(yīng)答，其中所述雞蛋在測(cè)試l(S26-27)，2(S40-41)和3(S49-50)的時(shí)間獲得。在胚胎發(fā)生之前(0天)和胚胎發(fā)生之后(第10天)(即在37°C孵化10天之后的階段)進(jìn)行測(cè)試1的雞蛋的卵黃中抗-H5應(yīng)答的分析。僅在胚胎發(fā)生之后(第10天)，進(jìn)行在測(cè)試2和3的雞蛋的卵黃中抗H5應(yīng)答的分析。還利用來源于未免疫母雞的雞蛋進(jìn)行相同的分析(參見3.2.2))。還在胚胎發(fā)生后(第10天)測(cè)試2的雞蛋的尿囊液中研究了抗H5應(yīng)答。使用一次性套管的移液器的吸取出雞蛋黃。除了測(cè)試1(其中雞蛋黃保持冷凍而未被預(yù)稀釋)之外，將測(cè)試2和3的雞蛋黃和尿囊液在冷凍前在磷酸鹽緩沖液中預(yù)稀釋至1/5。將稀釋的雞蛋黃和尿囊液冷凍保存，直到抗H5抗體的定量時(shí)間，其中所述定量通過使用通過抑制母雞紅細(xì)胞血凝(IHA)的定量方法來進(jìn)行，其中所述血凝在存在A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)株時(shí)發(fā)生。所述定量基于特異性針對(duì)并對(duì)HA的中和抗體抑制病毒“血凝”活性的能力。在該測(cè)試中，使用NISBC提供的抗-A/越南/1194/04綿羊血清作為陽(yáng)性對(duì)照，并且使用天然小鼠血清作為陰性對(duì)照。在圓錐底微孔板中進(jìn)行連續(xù)兩倍稀釋提取物(稀釋的雞蛋黃或者尿囊液)，以獲得每孔50μ1的各種稀釋度。將50μ1病毒懸浮液加入到各個(gè)孔中，其中所述病毒懸浮液具有4個(gè)血凝單位(4HAU)的滴度，并且來自于澄清的尿囊液，所述尿囊液由IlariaCapua實(shí)驗(yàn)室(IstitutoZooprofiIatticoSperimentaledelleVenezie,LaboratorioVirologia,padova，意大利)提供的A/小雞/意大利/22A/98(H5N9)株感染。將其在實(shí)驗(yàn)室溫度下溫育1小時(shí)，之后加入50μ1在磷酸鹽緩沖液中0.5%母雞紅細(xì)胞溶液。在+4°C下保持1小時(shí)后，讀取測(cè)試結(jié)果。抑制血凝的存在表現(xiàn)為在微孔底部出現(xiàn)紅斑點(diǎn)，而血凝的出現(xiàn)則表現(xiàn)為微孔中出現(xiàn)桃紅色的暈(halo)。IHA抗體滴度通過最后一個(gè)稀釋度(其中在微孔中沒有觀察到血凝)的倒數(shù)表示。3.2)結(jié)果3.2.1)測(cè)試1的雞蛋黃中抗-H5應(yīng)答的分析在O天，8個(gè)分析的未免疫組的雞蛋黃中的8個(gè)在IHA測(cè)試中是陰性的，而來源于組2的8個(gè)雞蛋黃中的6個(gè)在IHA測(cè)試中是陽(yáng)性的，這說明存在抗H5抗體。在第10天，4個(gè)分析的未免疫組的雞蛋黃中的4個(gè)在IHA測(cè)試中是陰性的，而來源于組2的4個(gè)雞蛋黃中的4個(gè)在IHA測(cè)試中是陽(yáng)性的。3.2.2)測(cè)試2的雞蛋黃和尿囊液中抗_H5應(yīng)答的分析在第10天，5個(gè)分析的未免疫組的雞蛋黃中的5個(gè)在IHA測(cè)試中是陰性的，而來源于組1的5個(gè)雞蛋黃中的4個(gè)和來源于組2的5個(gè)雞蛋黃中的4個(gè)在IHA測(cè)試中是陽(yáng)性的，這說明在這些組中存在抗-H5抗體。在表V中給出了所獲得的IHA滴度的各個(gè)數(shù)值。表V:胚胎發(fā)生后提取的雞蛋黃的IHA滴度(第10天)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*在第10天，來源于不同雞蛋黃的滴度另一方面，來源于組1和2的全部尿囊液在IHA測(cè)試中都是陰性的，這意味著在尿囊液中沒有可檢測(cè)出的抑制H5N9流感病毒血凝的抗體。3.2.3)測(cè)試3的雞蛋黃中抗-H5應(yīng)答的分析在第10天，5個(gè)分析的未免疫組的雞蛋黃中的5個(gè)在IHA測(cè)試中是陰性的，而來源于組1的5個(gè)雞蛋黃中的5個(gè)在IHA測(cè)試中是陽(yáng)性的。在表VI中給出了IHA滴度的各個(gè)數(shù)值。表VI胚胎發(fā)生后提取的雞蛋黃的IHA滴度(第10天)，其作為雞蛋來源的函數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>總之，在實(shí)施例2和3結(jié)果的基礎(chǔ)上，母體的抗H5N9抗體的存在(在3個(gè)測(cè)試的雞蛋黃中得到顯示)對(duì)用H5m或H5N9株感染的尿囊液病毒生產(chǎn)力沒有關(guān)聯(lián)(incidence)。t施例4-Mk/小雞/意大利/22A/98(H5N9)瘡苗株免,瘡的母雞以及在來自這勝辦白細(xì)雄-H5秘白_青靴■俯在第28和36周大時(shí)，從組1和2的經(jīng)免疫母雞提取血液樣品。在第27周和37周收集這些母雞產(chǎn)下的雞蛋，以評(píng)估母體抗體轉(zhuǎn)移入雞蛋黃中的重要性。借助血凝抑制測(cè)試評(píng)估抗-H5抗體應(yīng)答，其使用于滅活疫苗株同源的A/小雞/意大利/22A/98H5N9株作為抗原。在表VII中以Iogltl表達(dá)了結(jié)果。表VII在經(jīng)免疫產(chǎn)卵母雞的血清中以及在這些母雞所產(chǎn)雞蛋的卵黃體中抑制血凝的抗體比率(A/小雞/意大利/22A/98H5N9抗原)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*抑制血凝的抗體滴度的幾何平均值，其表達(dá)為Iogltl士標(biāo)準(zhǔn)偏差(每組所測(cè)試樣品的數(shù)目)“對(duì)卵黃體所測(cè)試的最低稀釋度是l/10(llog1(l)；為了計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，將在1/10稀釋度為陰性的雞蛋的數(shù)值置于0.71og10O表VIII在組1和組2的經(jīng)免疫雞所產(chǎn)下雞蛋的卵黃體中的抑制血凝的抗體比率(A/火雞/威斯康星/68H5N9抗原)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*抑制血凝的抗體滴度的幾何平均值，其表達(dá)為Iogltl士標(biāo)準(zhǔn)差(每組所測(cè)試樣品的數(shù)目)；所測(cè)試的最低稀釋度是1/10(Ilogltl)；為了計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，將在1/10稀釋度為陰性的雞蛋的數(shù)值置于0.71og10O這些結(jié)果確認(rèn)母體抗體傳遞到組1和2的經(jīng)免疫母雞所產(chǎn)下雞蛋的雞蛋黃中。在卵黃體中同源性抗-H5N9抗體比率(表VII)大于異源抗-H5N9滴度(表VIII)，盡管該差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不是顯著的。t施仿I丨5^^卜.牛產(chǎn)A/火雞/威其斤康星/68H5N9株，1；中所沭雞蛋由禾丨用會(huì)目2經(jīng)滅活的H5N9(A/小雞//22A/98株)免,瘡的母雞產(chǎn)下5.1.操作規(guī)程在第28和29周，從組2的母雞提取雞蛋(大約220-230)，所述母雞被滅活的H5N9疫苗(A/小雞/意大利/22A/98株)在3和17周齡時(shí)免疫兩次。在控制的溫度下(1215°C)存儲(chǔ)后，將這些雞蛋在37°C下孵化11天。在透照驗(yàn)蛋以確定胚胎具有良好生活力之后，將這些雞蛋在尿囊腔中接種0.2mlA/火雞/威斯康星/68H5N9存儲(chǔ)病毒溶液的稀釋液，其具有9.681og1(1EID5(1/ml的滴度(接種體)。形成七個(gè)大約30個(gè)雞蛋的組。將四個(gè)組(GlG4)接種下列接種體的稀釋度IO-5UO-4UO-3和ΙΟ"20另外三個(gè)組(G5G7)接種10_3的接種體的稀釋度。在接種后，將雞蛋在37°C士1.5°C溫度、70%士10%濕度下孵化。孵化20小時(shí)后，對(duì)雞蛋進(jìn)行透照驗(yàn)蛋以除去由于接種而產(chǎn)生的死蛋，隨后將他們?cè)谙嗤臈l件下重新孵化。在接種后42小時(shí)，將雞蛋冷卻，之后收集尿囊腔。匯集組14的雞蛋的尿囊液(每個(gè)組，一個(gè)液體池(pool))。將4個(gè)雞蛋組的尿囊液在-70°C下保存，之后以血凝單位和50%雞蛋感染劑量(EID5tl)進(jìn)行滴定。5.2.表在表IX中給出了結(jié)果。表IX在雞蛋上生產(chǎn)A/火雞/威斯康星/68H5N9株后獲得的血凝和感染滴度，其中所述雞蛋來自于用滅活疫苗免疫的母雞，所述疫苗含有A/小雞/意大利/22A/98H5N9株<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這些結(jié)果顯示在這些組之間存在很相似的滴度，因此接種體的稀釋度沒有影響。此外，所獲得的滴度非常高，可以與在沒有母體抗-H5N9抗體的雞蛋上獲得的滴度(歷史實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))相當(dāng)。因此，這些結(jié)果證實(shí)在所測(cè)試的條件下，母體抗體在雞蛋中的存在不會(huì)干擾相同亞型的流感病毒的生產(chǎn)。權(quán)利要求生產(chǎn)流感病毒的方法，根據(jù)該方法a.向母雞給藥流感疫苗，b.從經(jīng)免疫的母雞獲得雞蛋，c.觸發(fā)胚胎發(fā)生過程，d.通過將流感病毒接種入尿囊腔中來感染所述含胚雞蛋，e.在允許病毒復(fù)制的溫度和濕度條件下孵化所述感染的含胚雞蛋，和f.收獲包含病毒的尿囊液。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中疫苗保護(hù)母雞抵抗禽流感。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中流感疫苗在它的組合物中包含呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中流感疫苗的組合物包含滅活的完整流感病5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中流感疫苗的組合物包含來源于完整流感病毒的產(chǎn)品。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中疫苗的組合物還包含佐劑。7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中流感疫苗的組合物包含減毒的流感病毒。8.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中流感疫苗包含載體，所述載體包含編碼流感病毒的血凝素的基因。9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述載體是痘病毒。10.權(quán)利要求8或9所述的方法，其中載體還包含編碼流感病毒神經(jīng)氨酸酶的基因。11.權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)所述的方法，其中疫苗的組合物還包含佐劑。12.權(quán)利要求3-11任一項(xiàng)所述的方法，其中包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有不同的亞型。13.權(quán)利要求3-11任一項(xiàng)所述的方法，其中包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有相同的亞型。14.權(quán)利要求3-11任一項(xiàng)所述的方法，其中包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素是一致的。15.權(quán)利要求4，6或者7所述的方法，其中，包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的流感病毒與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒是一致的。16.權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)所述的方法，其中包含在給藥于母雞的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5、H6、H7或者H9亞型。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中包含在用于使母雞免疫抗流感的疫苗組合物中的呈蛋白質(zhì)和/或編碼該蛋白質(zhì)的基因形式的流感病毒的血凝素，與用來感染來自經(jīng)免疫的母雞的含胚雞蛋的尿囊腔的流感病毒的血凝素具有H5或者H7亞型。18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的方法，其包含純化病毒的附加步驟。19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的方法，其包含滅活病毒的附加步驟。20.使用權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法獲得的流感疫苗。21.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止流感。22.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止人類的大流行性流感。23.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止人類的流行性流感。24.用于防止流感病毒流行株或者流感病毒大流行株在人類中感染的方法，所述方法包括向人類給藥有效量的權(quán)利要求20中所述的抗流感疫苗。25.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法用于制造疫苗的用途，其中所述疫苗用于防止在馬科、豬科、犬科、貓科、鼬科和禽類物種中的流感。26.用于防止在選自馬科、豬科、犬科、貓科、鼬科和禽類物種的動(dòng)物中的流感的方法，其中所述方法包括向動(dòng)物給藥有效量的權(quán)利要求20中所述的流感疫苗。27.來自針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋用于生產(chǎn)流感病毒的用途。28.來自己針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋用于制造流感疫苗的用途。29.權(quán)利要求27或28所述的來自針對(duì)流感進(jìn)行免疫的母雞的雞蛋的用途，其中所述雞蛋含有針對(duì)流感病毒的血凝素的抗體。30.權(quán)利要求29所述的用途，其中所述抗體針對(duì)具有H5、H6、H7或者H9亞型的流感病毒的血凝素。全文摘要本發(fā)明涉及生產(chǎn)流感病毒的方法，其包括a)向母雞給藥流感疫苗；b)收集接種疫苗的母雞的雞蛋；c)觸發(fā)胚胎發(fā)生過程；d)通過在尿囊腔內(nèi)接種流感病毒而感染含胚雞蛋；e)在允許病毒復(fù)制的溫度和濕度條件下孵化感染的含胚雞蛋；和f)收集含有病毒的尿囊液。文檔編號(hào)A61P31/16GK101809144SQ200880108968公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者C·格迪爾,C·莫斯特,F·-X·勒格羅斯,I·勒加斯特洛伊斯,M·巴布洛特申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德有限公司;默里爾有限公司