一種流感病毒分離檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，包括試劑盒本體，試劑盒本體內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶、平衡鹽溶液洗液瓶、病毒維持液溶液瓶和小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。小瓶離心法試劑瓶為含200μL細(xì)胞休眠液的狗腎細(xì)胞的小瓶離心法試劑瓶。平衡鹽溶液洗液瓶為含質(zhì)量體積比為0.0625%的胰蛋白酶的平衡鹽溶液洗液瓶。病毒維持液溶液瓶為含甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理的胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、兩性霉素-B的MEM病毒維持液溶液瓶。本實(shí)用新型的試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)低溫保存相比較，細(xì)胞復(fù)蘇率高，操作簡(jiǎn)單；保存無需程序降溫儀和液氮；運(yùn)輸安全方便。
【專利說明】一種流感病毒分離檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及低溫生物學(xué)、病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種可低溫保存及長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)男∑侩x心法流感病毒分離檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒檢測(cè)方法包括病毒分離、病毒抗原、核酸和抗體檢測(cè)。病毒分離為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”;病毒的抗原和核酸檢測(cè)可以用于早期診斷；抗體檢測(cè)可以用于回顧性分析。近年來研發(fā)機(jī)構(gòu)集中精力在免疫學(xué)和分子診斷技術(shù)方面開展了卓有成效的工作，無疑這些都是有益的。但是，作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的病毒分離培養(yǎng)卻由于要求投入比較高、技術(shù)較為復(fù)雜、見效比較慢而沒有受到同等的重視。利用細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)是唯一能夠獲得活病毒的方法，這對(duì)相關(guān)病毒的后續(xù)研究如病毒的遺傳與變異的研究、致病機(jī)理的探索、藥物敏感性的檢測(cè)、相應(yīng)疫苗的研制等等都是不可缺少的前提條件。同時(shí)也應(yīng)該是上述免疫學(xué)和分子診斷技術(shù)方法賴以比較的基礎(chǔ)。但是細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)耗時(shí)的過程，其步驟需要完成復(fù)蘇、傳代、接種、孵育、分離。該技術(shù)無法滿足病毒樣品快速分離檢測(cè)的需求，從而影響病毒分離檢測(cè)的效率。適合臨床實(shí)驗(yàn)室的敏感和穩(wěn)定的細(xì)胞產(chǎn)品供應(yīng)是保證醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室開展常規(guī)化病毒檢測(cè)的關(guān)鍵，但是目前市面上十分缺乏一種有效期長(zhǎng)、可用于產(chǎn)業(yè)化的預(yù)制備細(xì)胞產(chǎn)品(低溫保存的單層貼壁細(xì)胞產(chǎn)品)，所以研發(fā)一種單層貼壁培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)制備低溫保存方法是十分必要。
[0003]單層貼壁細(xì)胞預(yù)制備技術(shù)又叫單層貼壁細(xì)胞低溫休眠技術(shù)，其目的是利用低溫低代謝或零代謝技術(shù)，讓單層貼壁細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，需要使用時(shí)能立即復(fù)蘇，無需接種和傳代，可運(yùn)用于臨床病毒檢測(cè)分離、抗病毒藥物篩選、微量中和試驗(yàn)等等。
[0004]要做到單層貼壁細(xì)胞低溫休眠，目前現(xiàn)有的方法主要有超低溫細(xì)胞休眠及非冷凍液態(tài)低溫休眠。
[0005]超低溫細(xì)胞休眠是指利用低溫冷凍技術(shù)將細(xì)胞保存在_80°C或_80°C以下，其方法主要包括程控降溫法和玻璃化法。
[0006]程控降溫法:利用程序降溫儀程序控制降溫使細(xì)胞處于超低溫冷凍休眠狀態(tài)。其原理是從室溫以-1°C /min降至-10°c，之后在以_10°C /min速度降至_80°C。程控降溫采用慢速冷凍，讓細(xì)胞有充足時(shí)間脫去水分，避免胞內(nèi)冰晶形成，從而保護(hù)細(xì)胞。程控降溫還需使用冷凍保護(hù)劑共同保護(hù)細(xì)胞，主要包括乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亞砜(DMSO)等，作用原理是利用保護(hù)劑的超強(qiáng)滲透性，使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓保持平衡，當(dāng)胞外冰晶形成后，胞外溶液隨著冰晶的形成，溶劑相對(duì)減少，而溶質(zhì)濃度相對(duì)增大，胞內(nèi)溶劑隨滲透壓流出胞外，細(xì)胞進(jìn)一步脫水，保護(hù)細(xì)胞免受冰晶刺破等物理損傷。
[0007]玻璃化休眠:通過高濃度非滲透性溶質(zhì)(蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮PVP等)及高濃度滲透性保護(hù)液，讓細(xì)胞迅速脫水，之后直接投入液氮中，使之快速冷凍，在I分鐘(-2500°c /min)之內(nèi)，達(dá)到冷凍保存液的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)，最后整個(gè)溶液體系形成透明的玻璃態(tài)，無冰晶存在，繼而保護(hù)了細(xì)胞。[0008]非冷凍液態(tài)低溫休眠:一般臨床學(xué)術(shù)認(rèn)為在冰點(diǎn)之上，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溫度控制在細(xì)胞冰晶形成溫度之上至細(xì)胞休眠的溫度之下范圍內(nèi)(學(xué)術(shù)屆認(rèn)為_5°C以上，27°C以下)。不同的動(dòng)物、不同的器官、不同的細(xì)胞類型，其最佳休眠溫度也不同，所以筆者認(rèn)為只要掌握冰晶形成溫度之上選擇一個(gè)適合的休眠溫度，就可以讓多種類的細(xì)胞休眠起來。如腫瘤細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞難以忍受10°C以下的低溫，而在20°C卻不容易出現(xiàn)細(xì)胞損傷。絕大多數(shù)細(xì)胞(上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)能長(zhǎng)時(shí)間承受15°C的低溫壓力，所以選擇一個(gè)大眾低溫休眠溫度，能有效的抑制多種細(xì)胞增值，使之處于休眠狀態(tài)。
[0009]程控降溫法缺陷:當(dāng)在慢速降溫時(shí)，細(xì)胞雖能脫水避免胞內(nèi)冰晶損傷，對(duì)懸浮細(xì)胞來說能起到很好的保護(hù)作用，但對(duì)單層貼壁細(xì)胞，其細(xì)胞間質(zhì)(貼壁細(xì)胞及組織細(xì)胞的間隙仍然存在著組織液)一樣會(huì)形成冰晶，刺破細(xì)胞膜，所以使用程序降溫法對(duì)單層貼壁細(xì)胞來說，存在著諸多的不確定性，還有程控降溫儀成本昂貴，冷凍量不多(一次冷凍兩三塊96孔板)，且相當(dāng)耗時(shí)。所以對(duì)單層貼壁細(xì)胞預(yù)制備的推廣得不到有效的幫助，研發(fā)意義不大。
[0010]玻璃化休眠缺陷，主要有四點(diǎn):
[0011]1、當(dāng)單層貼壁細(xì)胞在高濃度溶質(zhì)的冷凍保護(hù)液中，因極度脫水而收縮，這使單層貼壁細(xì)胞非常容易脫落。
[0012]2、玻璃化冷凍保護(hù)液的毒性也很高，通常玻璃化冷凍使用20%的DMSO保護(hù)液，DMSO本身有毒，能破壞細(xì)胞骨架。
[0013]3、玻璃化冷凍還存在反玻璃化現(xiàn)象，如當(dāng)溫度高于玻璃化轉(zhuǎn)化溫度Tg時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)大量的冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。也意味著玻璃化法必須長(zhǎng)期保存在液氮中。產(chǎn)品運(yùn)輸無法得到安全保證。
[0014]4、玻璃化冷凍操作危險(xiǎn)，我們制備單層貼壁細(xì)胞通常使用多孔培養(yǎng)板和玻璃小瓶。溫差巨大的情況下，這些器皿容易爆裂，可能傷害到實(shí)驗(yàn)操作者。
[0015]非冷凍液態(tài)低溫休眠缺陷:保存期受到限制(無保護(hù)液情況下，最長(zhǎng)2周)。主要原因細(xì)胞在非冷凍液態(tài)低溫休眠過程中，仍然有少量的代謝，其代謝產(chǎn)物主要有氧自由基等過氧化物，這些物質(zhì)長(zhǎng)期存在細(xì)胞內(nèi)能使細(xì)胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等發(fā)生脂質(zhì)過氧化，同時(shí)這些過氧化物還能破壞DNA、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等。其次，細(xì)胞長(zhǎng)期處于低溫液體體系中，Na+-K+-ATP酶活性受到影響，Ca2+離子內(nèi)流等，這些都會(huì)引起高濃度溶質(zhì)損傷。此外，低溫效應(yīng)也延遲粘附分子L-選擇素(L-selectin)、β 2-整合素(β 2-1ntegrin)等的表達(dá)。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0016]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于利用細(xì)胞休眠保護(hù)液及非冷凍間斷性低溫休眠保護(hù)方法共同結(jié)合，有效抑制非冷凍低溫?fù)p傷，提供一種可低溫保存且長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)男∑侩x心法流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，使小瓶離心法技術(shù)產(chǎn)品化，并在有效期內(nèi)能立即運(yùn)用于臨床病毒分離檢測(cè)，無需傳代，無需接種細(xì)胞，有效提高臨床病毒分離檢測(cè)速率。
[0017]本實(shí)用新型的一種流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，包括試劑盒本體，在所述試劑盒本體內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶、平衡鹽溶液洗液瓶、病毒維持液溶液瓶和小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
[0018]所述小瓶離心法試劑瓶為含200 μ L細(xì)胞休眠保護(hù)液的單層貼壁狀態(tài)的狗腎細(xì)胞的小瓶離心法試劑瓶。[0019]所述小瓶離心法試劑瓶有40個(gè)。
[0020]所述平衡鹽溶液Hanks洗液瓶為含質(zhì)量體積比為0.0625%的胰蛋白酶的平衡鹽溶液洗液瓶。
[0021]所述病毒維持液溶液瓶為含5 μ g/ml的TPCK處理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10 μ g/ml兩性霉素-B的MEM病毒維持液溶液瓶。
[0022]所述小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶為經(jīng)多聚甲醛滅活處理的小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
[0023]本實(shí)用新型的試劑盒的使用方法如下:
[0024]含0.0625%胰蛋白酶洗液為A液，含5 μ g/ml的TPCK處理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10 μ g/ml兩性霉素B的MEM病毒維持液為B液。
[0025]1、將低溫保存的MDCK細(xì)胞小瓶離心法小瓶置37°C培養(yǎng)箱復(fù)溫30分鐘，除去細(xì)胞低溫休眠液，加A液靜置I分鐘。
[0026]2、B液與標(biāo)本(床鼻、咽拭子)震蕩混合。去A液加含標(biāo)本B液，之后，用離心機(jī)3000轉(zhuǎn)60分鐘離心小瓶離心法小瓶后(實(shí)驗(yàn)條件限制可不離心)，至37°C恒溫培養(yǎng)箱。
[0027]使用離心技術(shù)，24小時(shí)內(nèi)可觀察細(xì)胞病變。并結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測(cè)病毒。
[0028]本實(shí)用新型的最大優(yōu)勢(shì)是可分離活的流感病毒。這是PCR和免疫熒光無法代替的。
[0029]本實(shí)用新型的小瓶離心法試劑瓶中的細(xì)胞休眠液配方是根據(jù)非冷凍低溫?fù)p傷機(jī)制的基礎(chǔ)上研制出來的，配方中分別含有80 μ M/L維生素Ε、3.7 μ M/L番茄紅素兩種抗氧化齊U，能有效抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜不破損。以及含有30mM/L海藻糖，海藻糖能保護(hù)細(xì)胞膜上及膜內(nèi)蛋白與核酸的結(jié)構(gòu)，維持蛋白和核酸功能。配方中還含有1.5%明膠和
0.5%海藻酸，組成溫敏凝膠(低于15°C凝固，反之融化)，能使細(xì)胞在運(yùn)輸途中得以固定，保證細(xì)胞及小瓶離心法小瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞載玻片不脫落。
[0030]非冷凍間斷性低溫休眠技術(shù):黃鼠冬眠習(xí)性觀察得出，原理是讓小瓶離心法MDCK細(xì)胞處于4°C?10°C低溫保存7-10天，37°C復(fù)溫30分鐘再繼續(xù)處于4°C?10°C低溫保存7-10天再37°C復(fù)溫，組成的一個(gè)非冷凍間斷性低溫休眠模式，此法用于shell vial流感病毒分離試劑盒，能有效抑制MDCK細(xì)胞的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化。有效延遲單層貼壁細(xì)胞的保存時(shí)間。保存有效期為I個(gè)月。
[0031]本實(shí)用新型的試劑盒與現(xiàn)有單層貼壁細(xì)胞低溫保存相比較，具有操作簡(jiǎn)單，無需程序降溫儀，無需液氮，運(yùn)輸方便。
[0032]操作方面，與現(xiàn)有程序降溫和玻璃化比較，這兩種現(xiàn)有低溫保存方法需要嚴(yán)格遵從低溫冷凍步驟，及快速復(fù)溫程序，而本實(shí)用新型復(fù)溫和冷凍速度沒有限制，適合廣大技術(shù)員操作。
[0033]運(yùn)輸方面，與現(xiàn)有程序降溫和玻璃化比較，無需液氮與干冰，不會(huì)出現(xiàn)反玻璃化現(xiàn)象。本發(fā)明使用低溫水凝膠技術(shù)，能有效固定細(xì)胞在運(yùn)輸過程不受振動(dòng)而脫落。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1本實(shí)用新型流感病毒分離檢測(cè)試劑盒組成的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例?！揪唧w實(shí)施方式】
[0035]為使本實(shí)用新型更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本實(shí)用新型。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本實(shí)用新型而不用于限制本實(shí)用新型的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0036]實(shí)施例1:本實(shí)用新型的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的流感病毒分離檢測(cè)試劑盒組成
[0037]該優(yōu)選實(shí)施例的試劑盒組成見圖1，由圖1可見，本優(yōu)選實(shí)施例的試劑盒含試劑盒本體1，在所述試劑盒本體I內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶2、平衡鹽溶液Hanks洗液瓶3、病毒維持液溶液瓶4和小瓶離心法陽性樣品瓶5。所述小瓶離心法試劑瓶2為含200 μ L細(xì)胞休眠液的狗腎細(xì)胞MDCK細(xì)胞的小瓶離心法試劑瓶。所述小瓶離心法試劑瓶2有40個(gè)。所述平衡鹽溶液HBSS洗液瓶3為含質(zhì)量體積比為0.0625%的胰蛋白酶的平衡鹽溶液HBSS洗液瓶。所述病毒維持液溶液瓶4為含5 μ g/ml的TPCK處理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10 μ g/ml兩性霉素-B的MEM病毒維持液溶液瓶。所述小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶5為經(jīng)多聚甲醛滅活處理的小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
[0038]實(shí)施例2:實(shí)施例1的試劑盒的使用方法
[0039]含0.0625%胰蛋白酶平衡鹽洗液為A液,含5 μ g/ml的甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)處理的胰蛋白酶及常用青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的MEM病毒維持液為B液。
[0040]該試劑盒的使用方法如下:
[0041]1、將低溫保存的MDCK細(xì)胞小瓶離心法小瓶置37°C培養(yǎng)箱復(fù)溫30分鐘，除去細(xì)胞低溫休眠液，加A液靜置I分鐘后,再用A液洗一遍。
[0042]2、B液與 標(biāo) 本(床鼻、咽拭子)震蕩混合。去A液加含標(biāo)本B液，之后，離心機(jī)3000轉(zhuǎn)60分鐘離心小瓶離心法小瓶后(實(shí)驗(yàn)條件限制可不離心)，至37°C恒溫培養(yǎng)箱。
[0043]使用離心技術(shù)，24小時(shí)內(nèi)可觀察細(xì)胞病變。并結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測(cè)病毒。
[0044]實(shí)施例3:使用實(shí)施例1的試劑盒的多種流感病毒檢測(cè)效果
[0045]接種滴度為1.0TCID5(i/0.1ml多種常見流感病毒，48小時(shí)觀察細(xì)胞病變(CPE)，比較低溫保存一個(gè)月的本實(shí)用新型與程控降溫法、玻璃化法的檢測(cè)效果，見表一。
[0046]表一
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，包括試劑盒本體，其特征在于，在所述試劑盒本體內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶、平衡鹽溶液洗液瓶、病毒維持液溶液瓶和小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述小瓶離心法試劑瓶為含200 μ L細(xì)胞休眠液的狗腎細(xì)胞的小瓶離心法試劑瓶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述小瓶離心法試劑瓶有40個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒分離檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶為經(jīng)多聚甲醛滅活處理流感病毒的小瓶離心法陽性樣品瓶。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK203474805SQ201320012548
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】楊子峰, 江海明, 伍時(shí)冠, 周榮 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣州呼吸疾病研究所, 廣州呼研所醫(yī)藥科技有限公司