專利名稱：引起針對大流行性流感病毒的免疫應答的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的免疫應答 的方法，并且更具體地涉及在受試者體內引起或誘導免疫應答的方法，該免疫應答保護該 受試者對抗隨后的甲型流感的致病性的、大流行性亞型(如，已經在人體內造成感染的甲 型禽流感(H5N1))的攻擊。
背景技術：
流行性感冒是人類疾病的主要病因，并且在世界范圍內是顯著的發(fā)病率和死亡率 的來源，每年有大量的人類群體受到影響。流感病毒可以被細分為甲型、乙型和丙型。在人 類群體中傳播的病毒主要是甲型流感和乙型流感。每年接種疫苗是預防感染的主要策略。甲型流感菌株基于血細胞凝集素(HA)和 神經氨酸苷酶(NA)這兩種病毒表面跨膜蛋白的抗原性差異可進行進一步的分型。到目前 為止，已鑒定出甲型流感病毒的16種HA(HA1-16)和9種ΝΑ(ΝΑ1-9)的糖蛋白亞型。目前， 兩種甲型流感的亞型在人類中傳播(Hmi和H3N2) [1]。有時，當一種新型流感病毒出現而人類對其的免疫力很低或沒有免疫力時可發(fā)生 流感大流行。在上世紀，三種甲型流感菌株大流行的爆發(fā)造成了人類大量的與流感相關的 死亡(1918, HlNl ； 1957，H2N2 ； 1968,H3N2) [2]。1997 年在香港，一種高致病性 H5m 禽流感 病毒直接從雞傳給人類，造成18例確認的感染中的6例死亡[3 ；4]。從那時起，對流感大 流行的關注經由致病性H5W病毒的零星爆發(fā)得到加強。這些爆發(fā)導致了 258個病例、其中 導致153例死亡，帶來在從亞洲橫貫歐洲遍及六個國家的爆發(fā)(柬埔寨、中國、印度尼西亞、 泰國、土耳其以及越南)[5]。自從1997年以來，幾種其它亞型的病毒(包括H2N2、H9N2、H7N7、H7N3以及H10N7) 也已牽涉到人類的感染，并且因此這些亞型也代表著重大的大流行性威脅。由于不可能預 測哪種亞型的流感病毒會造成下一次大流行，所以一種理想的疫苗將通過引起免疫應答來 保護宿主免受嚴重疾病或死亡，這種免疫應答保護該宿主針對寬范圍的流感病毒(來自相 同亞型或不同亞型)。然而，由于以下所列原因，依靠誘導中和抗體應答(主要對抗HA和 NA)的可供使用的疫苗是流感菌株高度特異的。流感病毒的HA和NA糖蛋白經歷抗原變異作為逃避宿主的免疫應答的手段[6]。在全身位點或黏膜位點上存在對HA糖蛋白特異的病毒中和抗體保護不受病毒的感染。然而， 由于抗原的變異性，針對HA的抗體應答是菌株高度特異的，并且從不同亞型的流感病毒中 并未識別出這種HA，或甚至在相同的亞型中也未識別出高度相異的菌株[7]。另一方面，細 胞介導的免疫，特別是CD8+細胞毒性T細胞(CD8+CTL)主要負責清除病毒感染的細胞，并且 由此限制了感染的嚴重程度，并促進感染恢復[8]。與HA相反，細胞介導的免疫應答的內部 蛋白靶-關鍵的是PB2、PA、核蛋白(NP)以及基質蛋白(M)-并不傾向于抗原性漂移，并因 此是高度保守的。例如，H5N1甲型菌株/印度尼西亞/5/05和甲型/越南/1194/04的NP 和M蛋白與甲型/波多黎各/8/34共享了大概94%的氨基酸同一性(如在圖1中所示)。甲型/波多黎各/8/34是1934年分離的一種Hmi病毒，并且是工程疫苗菌株的結構蛋白 的來源，這些工程疫苗菌株傳統(tǒng)上通過重配(reassortment)進行制備，而最近更多通過反 向遺傳學進行制備。此外，在這些不同的流感亞型之間還存在著高度保守的CTL表位。這 種分析延伸至包括同樣構成潛在的大流行性威脅的其它病毒亞型(包括H7N7和H9N2)，它 證實在所有甲型菌株病毒中都具有高度保守的CTL表位。因此，與高度菌株特異的HA抗體 應答不同，不論甲型流感菌株的亞型，CTL應答都具有廣泛有效的潛力[9]。因此，誘導有力 的CTL應答對大流行性流感疫苗而言是高度希望的特性。誘導⑶8+CTL，特別在人類中進行誘導，到目前已證明是疫苗研制的重要障礙。多 種遞送系統(tǒng)(如DNA和病毒載體)提供了一些希望，但卻具有潛在的安全性顧慮，并且就 DNA而言，通常引起不良的細胞應答，特別是CD8+CTL應答。另外，病毒載體具有誘導對于該 載體的中和抗體的問題，這限制了重復性使用。目前正在對DNA以及活的病毒載體遞送的 初免_加強組合進行評價，并且盡管結果在動物模型中是有希望的，但它們仍然有待在人 類中證實。ISC0M 疫苗在許多動物模型中已顯示是T-輔助細胞(⑶4+)和CTL (⑶8+)的有 力的誘導劑。T細胞對多種抗原發(fā)生應答，包括自然發(fā)生的免疫原以及重組蛋白[10]。一 種Hmi流感ISC0M 疫苗已顯示在小鼠中給予交叉保護來針對異源病毒(包括H2N2、H3N2、 H5N1以及H9N2病毒)的致死性攻擊[11]。此外，還顯示保護依賴于⑶8+T細胞和抗體[11]。普遍接受的是ISC0M 疫苗誘導有力的⑶8+CTL應答的能力大部分是由于事實上 抗原被結合到ISC0M 顆粒之中[12]，這導致了有效的細胞攝取以及隨后抗原進入MHC I類 處理機制[13]。然而，ISC0M 疫苗的制造是很復雜的，難以按比例放大，并且存在著與生產 控制以及一致性相關的顯著問題。因此，ISC0M 疫苗(盡管在多種動物物種中證實了針對 一系列病原的保護)具有有限的產品潛力，特別是對于大批量的產品，如大流行性流感疫 苗，這將要求在短時間內生產出數億劑量。在引起本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人已研制出一種疫苗制品，其中預先形成的 ISC0MATRIX 佐劑(它是“無免疫原的”，原因是它實質上具有與ISC0M 疫苗相同的組成和 結構，但卻沒有結合的抗原[12 ；14])，與流感免疫原(例如，如以下所說明的標準的三價季 節(jié)性流感疫苗)相組合或混合。因此，與ISC0M 疫苗相反，本發(fā)明的疫苗制品中的流感免 疫原沒有結合到ISC0MATRIX 佐劑結構中。因此，本發(fā)明的疫苗制品的生產是簡單、穩(wěn)健并 且可重現的，并且可以大規(guī)模進行。此外，引起本發(fā)明的工作使用雪貂作為動物模型，證實了疫苗制品(包括標準的 地方性流感免疫原)保護以對抗甲型流感病毒的高致病性大流行性(H5N1)亞型的致死性 攻擊的能力。貫穿本說明書及其跟隨的權利要求，除非上下文另有要求，否則詞語“包括(comprise) ”以及變體如“包括(comprises) ”和“包括(comprising) ”應當被理解成是指 包含了提及的元素或步驟或者元素或步驟的組，但不排除任何其它元素或步驟或者元素或 步驟的組。本說明書中提及任何在先公開文件(或從其中所獲得的信息)或者提及任何已知 事物不是、并且不應該被當成是承認或準許或以任何形式建議該在先公開文件(或從其中 獲得的信息)或已知的事物形成在本說明書所涉及的研究領域內共同的一般知識的一部 分。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保 護性免疫應答的方法，該方法包括給予該受試者一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物在制備用于給予受試者以便在該受試者體 內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保護性免疫應答的藥物中的用途，該組合物 包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。在又另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物用于在受試者體內引起或誘導針對流感 病毒的大流行性亞型的保護性免疫應答的用途，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。在又一方面，本發(fā)明提供了用于在受試者體內弓丨起或誘導針對流感病毒的大流行 性亞型的保護性免疫應答的藥劑，其中所述藥劑是一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。


圖1是來自甲型/波多黎各/8/34 (Hmi)、甲型/印度尼西亞/5/05 (H5m)以及甲 型/越南/1194/04(H5N1)的(A)核蛋白(NP)、以及(B)基質蛋白(M)的氨基酸序列比較。 粗體字母是所說明的人類CTL表位(改編自Suzanne L. Epstein、Jonathan W. Yewdel 1, Jack R. Bennink, http: //www, flu, lanl. Rov/review/epitopes, html)。甲型 / 印度尼西亞 /5/05和甲型/越南/1194/04的NP和M蛋白與甲型/波多黎各/8/34共享了大概93 %的 氨基酸同一性。圖2顯示了來自雪貂的血清的HI抗體(A)以及病毒中和滴度(B)，這些雪貂接種 了(i)三價季節(jié)性流感疫苗(包含15 μ g的甲型/新喀里多尼亞群島/20/99、甲型/威斯康 辛州/67/2005以及乙型/馬來西亞/2506/2004)結合ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g) ； (ii)甲 型 / 越南/1194/2004 結合 ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g)；或(iii)單獨的 ISC0MATRIX 佐劑 (佐劑對照)。在第二次接種疫苗后的第28天收集血清，并且針對甲型/越南/1203/2004 以及甲型/印度尼西亞/5/2005進行滴定。數據顯示為每組四只動物的平均值。指明了標 準差。圖3顯示了在用(i)三價季節(jié)性流感疫苗(包含15 μ g的甲型/新喀里多尼亞群島 /20/99、甲型/威斯康辛州/67/2005以及乙型/馬來西亞/2506/2004)結合ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g) ； (ii)甲型 / 越南/1194/2004 結合 ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g)；或(iii)單 獨的ISC0MATRIX 佐劑(佐劑對照)免疫之后，用IO6個半數雞胚感染量(EID5tl)的甲型/ 越南/1203/2004攻擊的雪貂的存活率(A)、體溫變化(B)以及體重變化(C)，如所顯示。數 據是每組四只動物的代表性數值。在圖3A中，對病毒攻擊后的雪貂進行稱重，并且每天進行身體檢查。出于倫理原因，對損失超過10%體重或顯示出痛苦跡象(如震顫或腹部不適) 的雪貂進行安樂死。在圖3B中，使用可植入皮下的溫度轉發(fā)器每天監(jiān)測雪貂的溫度。垂直 線代表攻擊的時間。未感染的雪貂的平均體溫是38. 8°C。數據是每組四只動物的代表性數 值。在圖3C中，雪貂的體重被表示為在攻擊時該動物體重的百分數。數據是每組四只動物 的代表性數值。圖4顯示了用以下任一物質進行免疫的雪貂的發(fā)病率得分(i)三價季節(jié)性流感 疫苗(包含15 μ g的甲型/新喀里多尼亞群島/20/99、甲型/威斯康辛州/67/2005以及乙 型 / 馬來西亞/2506/2004)結合 ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g) ； (ii)甲型 / 越南/1194/2004 結合ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g)；或(iii)單獨的ISC0MATRIX 佐劑(佐劑對照)，如所顯 示。在用IO6個半數雞胚感染量(EID5tl)的甲型/越南/1203/2004攻擊之后，監(jiān)測了雪貂 的行為，并且基于以下尺度給出發(fā)病率得分(0 =愛動且警覺，1 =警覺但只有在 誘導活動 時才愛動，2 =警覺但當刺激時不愛動，3 =既不警覺也不愛動，4 =顯示出有必要進行安樂 死的身體癥狀)，如材料與方法所說明。
具體實施例方式一方面，本發(fā)明提供了用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞 型的保護性免疫應答的方法，該方法包括給予該受試者一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。優(yōu)選地，受試者是人。然而，本發(fā)明的方法也擴展至在非人類的動物或鳥類受試者 (如家畜動物或鳥，實驗室試驗用的動物或鳥、寵物或鳥，或者野生的動物或鳥)體內引起 或誘導保護性免疫應答。根據本發(fā)明，給予受試者的組合物包括地方性流感亞型的至少一種免疫原。如以 上所指出，這種目前在人類中傳播的“地方性”甲型流感亞型是Hmi和H3N2亞型。因此，本 發(fā)明的組合物優(yōu)選地包括這些亞型中的一種或兩種的免疫原。在本發(fā)明的一個具體的實施 方式中，組合物可包括標準的三價流感疫苗，該疫苗包括滅活的地方性甲型流感病毒(H1N1 和H3N2)以及乙型流感病毒，如Fluvax 分裂病毒體、滅活的流感疫苗(CSL Limited, Melbourne, Australia)。如在此所使用的，提及流感病毒的“大流行性”亞型應當被理解為提及這樣的亞 型，即受試者群體(特別是人類群體)被認為對這些亞型是首次接觸的，也就是說沒有或很 少由作為先前的疫苗接種或先前的暴露的結果而帶來的抵抗力。如以上所指出，此類大流 行性亞型具體包括H5N1、H2N2、H9N2、H7N7、H7N3和H10N7的亞型。給予根據本發(fā)明的包括地方性流感亞型的免疫原的組合物已顯示引起或誘導針 對流感病毒的大流行性亞型的異源性的保護性免疫應答。如在此所使用，提及“免疫應答”應當被理解為泛指體液應答(如誘導病毒中和抗 體)以及細胞介導的免疫應答(如誘導CD8+細胞毒性T細胞)。在此提及“保護性免疫應 答”包括這樣的免疫應答，一旦攻擊或暴露于流感病毒的大流行性亞型，該應答保護受試者 免受隨后的感染、或降低隨后感染的可能性，并且包括緩解任何隨后感染的癥狀連同減輕 任何隨后感染的嚴重性。
根據本發(fā)明給予至受試者的組合物包括無免疫原的免疫刺激復合物作為佐劑，它與流感免疫原相組合或混合。如在此所使用，術語“無免疫原”是指形成這種免疫刺激 復合物但沒有任何免疫原或抗原被結合至該復合物的結構之中。優(yōu)選地，這種佐劑是基 于皂苷的無免疫原的免疫刺激復合物，包括皂苷、留醇(如膽固醇)，以及可選地包括磷脂 (如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿)，該復合物被形成為典型是堅硬、中空、球狀、類似籠子的 顆粒，直徑測量為大約40nm，并且被稱為“空ISCOM”、ISCOM基質、或者最近更多地被稱為 ISC0MATRIX 佐劑[23]。最優(yōu)選地，無免疫原的免疫刺激復合物是ISC0MATRIX 佐劑。常規(guī)的藥學上可接受的載體、賦形劑、緩沖劑或稀釋劑，可包含在本發(fā)明的組合物 之中。通常，根據本發(fā)明的組合物將包括與該佐劑相混合的免疫有效量的流感免疫原，連同 一種或多種常規(guī)的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。如在此所使用，“藥學上可接受的載 體和/或稀釋劑”包括任何以及所有溶劑、分散介質、水性溶液、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等 滲劑和吸收延遲劑以及類似物。此類針對藥學活性物質的介質和試劑的使用在本領域內是 熟知的，并且在 Remington' sPharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, U. S. A.中通過舉例進行了說明。包含在本發(fā)明的組合物之中的流感免疫原是以有效量給予的?！坝行Я俊笔侵钢?少部分地達到所希望的免疫應答(特別是所希望的保護性免疫應答)必要的量。該量值依 據以下因素而變化有待治療的個體的年齡、健康以及身體情況、有待治療的個體的種族背 景、所希望的保護程度、組合物的配方、醫(yī)療狀況的評價、以及其它相關因素。預期的是該量 值會落在可通過例行試驗確定的一個相對寬的范圍之內。若有必要，可一次或多次重復給 予有效量。所給予的實際量值將由所希望的保護性免疫應答的性質并且由給予活性免疫原 的速率來確定。根據本發(fā)明，該組合物優(yōu)選通過胃腸外給藥途徑給予受試者。胃腸外給藥包括不 通過消化道(即不是腸道)的任何給藥方式，包括通過注射、輸注等方式進行給藥。通過注 射進行給藥包括，例如進入靜脈(靜脈內)、動脈(動脈內)、肌肉(肌內)以及皮膚以下 (皮下)。組合物優(yōu)選以足以獲得所希望的免疫應答的劑量進行皮下、皮內或肌內給藥。適合胃腸外給藥的組合物方便地包括優(yōu)選地與接受者的血液等滲的活性組分的 無菌水性制劑。這種水性制劑可使用適宜的分散劑或潤濕劑以及助懸劑根據已知的方法進 行配制。這種無菌可注射的制劑也可以是處于無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無 菌可注射的溶液或混懸液，例如作為處于聚乙二醇和乳酸中的溶液。在可被采用的可接受 的運載體(vehicle)和溶劑之中的是水、林格氏溶液、適宜的碳水化合物(例如，蔗糖、麥芽 糖、海藻糖、葡萄糖)、以及等滲的氯化鈉溶液。此外，方便地采用無菌的、非揮發(fā)油類作為溶 劑或懸浮介質。出于這一目的，可采用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二 酯。此外，脂肪酸(如油酸)可用于注射的制劑中。本發(fā)明還提供了一種組合物在制備用于給予受試者以便在該受試者體內引起或 誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保護性免疫應答的藥物中的用途，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。本發(fā)明還提供了一種組合物用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流 行性亞型的保護性免疫應答的用途，該組合物包括
(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。此外，本發(fā)明提供了用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型 的保護性免疫應答的藥劑，其中所述藥劑是一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。根據本發(fā)明，已顯示用標準的三價季節(jié)性流感疫苗(含有甲型/新喀里多尼亞群 島/20/99 (HlNl)、甲型/威斯康辛州/67/2005 (H3N2)以及乙型/馬來西亞/2506/2004，與 無免疫原的ISC0MATRIX 佐劑相混合)(在此稱為“流感ISC0MATRIX 疫苗”)進行免疫接 種提供了針對野生型甲型/越南/1203/04(H5N1)的致死性攻擊的保護。流感ISC0M 疫苗已顯示在多個物種(包括人類)中誘導⑶8+CTL應答[10 ;15 ； 16]。然而，到目前還沒有關于包含ISC0MATRIX 的疫苗在任何一種動物模型中針對致死性 攻擊提供保護的報道。因為在ISC0MATRIX 疫苗中抗原簡單地與ISC0MATRIX 佐劑結構相 混合并且沒有結合到其中，所以誘導CD8+CTL應答通常被認為有效性小于使用包含相同量 的結合抗原的ISC0M 疫苗[12 ； 17-20]。出于這一原因，已研究出一系列的策略以便將蛋白質與預先配制的ISC0MATRIX 佐劑相關聯以產生關聯的ISC0MATRIX 疫苗。這些策略包括利用這種ISC0MATRIX 佐劑的 物理特性的方法，如靜電作用，其中帶正電荷的蛋白質將與帶負電荷的佐劑相關聯。還研究 出用于修飾蛋白質或佐劑以便使這類關聯最大化的程序[21]。其它用于獲得關聯的方法 包括修飾ISC0MATRIX 佐劑的組分，以便能夠將蛋白質偶聯至不同的暴露的化學基團上。 這類修飾的一個例子被稱為螯合ISC0MATRIX 佐劑，其中金屬螯合基團被摻入到該結構之 中，然后該結構可結合包含金屬親和標簽(如六組氨酸標簽)的蛋白質[18]。因此，由于對抗原結合到ISC0MATRIX 佐劑(如，在ISC0M 疫苗中)之中用于 細胞免疫應答的最佳誘導的預期要求，高度出乎意料的是用流感ISC0MATRIX 疫苗(標準 的三價季節(jié)性流感疫苗，含有甲型/新喀里多尼亞群島/20/99 (HlNl)、甲型/威斯康辛州 /67/2005 (H3N2)以及乙型/馬來西亞/2506/2004，與無免疫原的ISC0MATRIX 佐劑簡單混 合)對雪貂進行免疫接種，保護免受野生型甲型/越南/1203/04(H5N1)的致死性攻擊。此 夕卜，在不存在可檢測的針對H5W的中和抗體應答的條件下觀察到這種保護，這表明由流感 ISC0MATRIX 疫苗所誘導的細胞免疫應答(最可能是CD8+CTL)能夠保護首次接觸的動物在 用高致病性H5W流感病毒進行致死性攻擊之后抵抗嚴重的疾病和死亡。對于許多喜歡研究人類流感的病毒學家來說，雪貂是試驗用動物的選擇。雪貂對 以下研究特別有用⑴流感(包括H5m分離物)的發(fā)病機理；(ii)接種疫苗之后對攻擊 性感染的應答；(iii)抗病毒物質的療效；(iv)抗病毒的藥物抗性突變體的傳播性；(V)病 毒的脫離以及(vi)對流感的發(fā)熱反應。替代模型是小鼠，并且不同的遺傳學改良的小鼠品 系以及大量的用于分析免疫應答的容易獲得的試劑的豐富資源使其成為一種令人信服的 模型，并且從其使用中已獲得大量信息。然而，小鼠自然情況下不感染人類流感病毒，并且 不存在已知的小鼠流感病毒。這種天然的抵抗力可能是由于Mx基因存在的緣故，這種基因 提供了 1型干擾素依賴的保護來抵抗流感(在小鼠而非人類中)，并且還由于在鼠類分泌物 中獨特的病毒抑制劑的存在[22]。適宜在小鼠體內生長的流感病毒是有限的，并且那些常規(guī)使用的流感病毒已經在這種宿主中通過盲傳而變得“小鼠適應”。相反，雪貂自然情況下 易感染人類流感，所以對可進行研究的病毒菌株不存在限制。本發(fā)明的其它特點在以下實施例中進行更為徹底的說明。然而，應當理解的是，這 種詳細的說明僅僅是出于對本發(fā)明進行例證的目的而包括在此，并且不應當以任何方式將 其理解為是對如以上給出的本發(fā)明的廣闊范圍的限制。實施例A.材料與方法雪貂幼年的雌性或雄性雪貂(3至5個月大)，體重大概是700至1500g，來源于 IMVS(SA)。雪貂對目前正在傳播的流感(Hmi、H3N2，乙型病毒)血清反應呈陰性。在緊臨 每次接種疫苗之前以及病毒攻擊之前收集血液樣品。在暴露至病毒之后14天或者在安樂 死時再次采集血液樣品以檢查對攻擊的抗體響應。在麻醉過的(氯胺酮/美托咪定50 50 0. lml/kg，用Apitemazole逆轉)動物上從頸靜脈或腋靜脈的4個位置使用19號至23號 計量注射針(取決于雪貂的大小)進行抽血，每個位置lml。臨床上受到影響的動物在體重 損失10%或顯示出符合涉及到其它器官系統(tǒng)的跡象(例如震顫或腹部不適)之后立即進行 安樂死。疫苗用于注射的季節(jié)性流感抗原的混合物包括等量(15yg)的甲型/新喀 里多尼亞群島/20/99 (HlNl)、甲型/威斯康辛州/67/2005 (H3N2)以及乙型/馬來西亞 /2506/2004 (CSL Limited,Melbourne, Australia)。對于大流行性菌株，通過與季節(jié)性菌株 相同的方式制備單價抗原(甲型/越南/1194/2004)。簡言之，在雞胚中繁殖病毒，用β-丙 內酯(ICNPharmaceuticals Inc.，Costa Mesa, CA)滅活，經受蔗糖梯度的區(qū)帶離心，并且用 ?；敲撗跄懰徕c(Sigma，St. Louis, MI)進行處理以得到純凈、滅活并破壞的抗原制備物。 病毒抗原的濃度用血細胞凝集素(HA)蛋白來表示，它是由標準的單向輻射免疫擴散確定 并與已知的相關菌株的標準進行比較。緊臨給藥之前將PBS(pH 6. 2)中的ISC0MATRIX 佐 劑[23]加到流感抗原之中。疫苗給藥使用帶有27號計量注射針的Iml注射器經肌內將兩個0. 5mL劑量(間 隔21天)遞送到后腿的四頭肌或后部肌肉之中。病毒H5m人類流感病毒甲型/越南/1203/04(野生型)、甲型/越南 /1194/04(經反向工程處理的疫苗菌株)以及甲型/印度尼西亞/5/2005 (野生型)獲自世 界衛(wèi)生組織流感合作實驗室。將儲存病毒在35°C在10天大的雞胚的尿囊腔中繁殖24至 36小時，并將其保存在-70°C。所有使用高致病性病毒的實驗都在BSL 3+防護裝置中進行 (AAHL, CSIRO Geelong)。病毒攻擊在第2劑之后三周，將這些雪貂鼻內(兩個鼻孔)接種IO6個半數雞胚感染量(EID5tl)的野生型攻擊病毒(甲型/越南/1203Λ004)，如Govorkova等人所描述 [24]。免疫原性測試使用兩倍稀釋的血清以及HA抗原的單一儲存源通過血細胞凝集抑制(HI)、以及病毒中和(VN)對免疫原性進行評估(如WHO流感協作實驗室標準操作步驟 中所描述)。確定幾何平均滴度，并且血清保護定義為抗體滴度高出接種疫苗之前的滴度4 倍或更高。使用雙尾配對Student’ s t檢驗來確定病毒滴度和發(fā)病率數據的統(tǒng)計學顯著 性。通過卡方分析來確定死亡率數據的統(tǒng)計學顯著性。
臨床評價觀察在整個研究中每天對動物講行目測,并且若這些動物在攻擊之后表現出疾 病的跡象則每天目測兩次。一般的臨床觀察是在攻擊之前進行的，其中保存了任何呼吸癥 狀(如咳嗽或噴嚏)的具體記錄。在每次接種疫苗之后2、24和48hr時記錄反應位點的觀 察(即，紅斑、水腫)。攻擊之后，每天監(jiān)測活動得分。體重在給藥和攻擊時(第0天)以及攻擊后第3、5、7以及14天在鎮(zhèn)靜狀態(tài)下對 動物進行稱重。在病毒攻擊之前大概十天，在鎮(zhèn)靜狀態(tài)下使用數字溫度計、并且連續(xù)使用插 入皮下的溫度轉發(fā)器在22號計量注射針的協助下手動確定溫度。牛物樣品在攻擊少后第3、5以及7天采集鼻拭子、口拭子用于病毒分離。B.結果流感ISC0MATRIX 疫苗抗體應答在雪貂免疫原性以及攻擊研究開始之前，從這些雪貂收集血漿，并且使用標準方 法用酶聯免疫測定(ELISA)測試甲型/新喀里多尼亞群島/20/99 (Hmi)、甲型/威斯康辛 州/67/2005 (Η3Ν2)以及乙型/馬來西亞/2506/2004的抗體的存在。測試的所有雪貂對于 針對全部3種菌株的抗體是陰性的，并且因此對被認為是首次接觸流感。對于免疫原性以及攻擊的研究，使用3.75yg或15yg的來自甲型/越南 /1194/2004的HA與ISC0MATRIX 佐劑(60 μ g)相混合、或者目前的季節(jié)性三價流感疫 苗(包含15 μ g來自以下各項之一的HA 甲型/新喀里多尼亞群島Λ0/1999 (HlNl)、甲 型/威斯康辛州/67/2005 (H3N2)以及乙型/馬來西亞Λ506/2004)與ISC0MATRIX 佐劑 (60 μ g)相混合(稱為流感ISC0MATRIX 疫苗)免疫雪貂兩次(第0、21天)。類似地單 獨將ISC0MATRIX 佐劑給予一組對照動物。使用血細胞凝集抑制(HI)(圖1A)以及病毒 中和(VN)(圖1B)測定法來評價在第二次給藥之后28天所收集的血清的流感特異性抗體 的存在。如在圖2中所示，用甲型/越南/1194/2004 ISC0MATRIX 疫苗以兩種抗原劑量 (3. 75yg和15yg)所免疫的雪貂引起了針對甲型/越南/1194/2004(H5N1，分化枝1)以 及甲型/印度尼西亞/5/2005 (H5m，分化枝2) 二者的有力的抗體應答，證明盡管來自不同 的H5W分化枝，但是甲型/越南/1203/2004和甲型/印度尼西亞/5/2005在抗原和血清 學方面是緊密關聯的。相反，通過針對甲型/越南/1203/2004和甲型/印度尼西亞/5/2005的HI和VN， 用流感ISC0MATRIX 疫苗所免疫的雪貂的血清是陰性的。如所預期，單獨接受了 2個劑量 的JSCOMATRIX 佐劑的對照雪貂在兩個測定中也是陰性的。流感ISC0MATRIX 疫苗抗致死性攻擊的保護在第2次疫苗給藥之后四周，雪貂在鼻內(兩個鼻孔)接種IO6個半數雞胚感染 量(EID5tl)的攻擊病毒(甲型/越南/1203/2004)，如Govorkova等人所描述[24]。然后， 連續(xù)監(jiān)測這些雪貂的溫度，并且每天監(jiān)測體重、身體外表以及發(fā)病率。如在圖3A中所顯示，用甲型/越南/1994/2004ISC0MATRIX 疫苗以兩個HA抗原 水平(3. 75 μ g和15 μ g)所免疫的動物中所有動物用野生型(甲型/越南/1203/2004)病 毒進行致死性攻擊后都存活下來。這一結果并不出乎意料，因為這些動物已形成響應于這 些疫苗的高滴度的甲型/越南/1203/2004特異性抗體，如在圖2中所示。然而，出乎意料的是，用流感ISCOMATRIX 疫苗所免疫的雪貂在致死性攻擊后也存活，盡管不存在可檢測的中和抗體。如所預期，對照雪貂全部屈服于病毒攻擊，并且出于倫理原因已被安樂死，因 為它們已經損失了超過10%的體重或顯示出痛苦的跡象，如震顫或腹部不適。在攻擊之前，使用皮下溫度轉發(fā)器連續(xù)監(jiān)測這些雪貂的溫度持續(xù)3天以建立基 線，并接著在攻擊之后再監(jiān)測7天。如在圖3B中所顯示，對照雪貂的溫度在攻擊之后12至 24小時急劇上升2. 5至3. 0°C，并且保持在這種升高的水平直到出于倫理原因將它們安樂 死。類似地，用流感ISCOMATRIX 疫苗所免疫的雪貂的溫度在攻擊之后12至24小時急劇 上升2. 5至3. 0°C，然而這種增加是短暫的并且24小時后溫度回到基線。在這組中有一只 動物經歷了第二次稍微降低的短暫溫度峰值，溫度在24小時后又再次回到基線。相反，在 高抗原劑量組中除了一只動物之外，用甲型/越南/1994/2004ISC0MATRIX 疫苗所免疫的 所有雪貂在攻擊后溫度在任何階段并未超出攻擊前的基線水平。在整個研究期間每天監(jiān)測雪貂的重量(圖3C)。在對照組中所有動物的重量在攻 擊3天之內下降大概10%。與用甲型/越南/1994/2004ISC0MATRIX 疫苗所免疫的雪貂 的靜態(tài)溫度曲線相一致，在攻擊之后這些動物的體重穩(wěn)定增加。相反，用流感ISCOMATRIX 疫苗所免疫的雪貂的溫度在攻擊之后的整個7天觀察期內保持不變。與體重和溫度的數據相一致，用甲型/越南/1994/2004ISC0MATRIX 疫苗以兩個 抗原水平(3. 75 μ g或15 μ g HA)免疫或用流感ISCOMATRIX 疫苗所免疫的全部雪貂在用 野生型H5W病毒(甲型/越南/1203/2004)進行致死性攻擊之后依然愛動并且警覺。相 反，單獨接受ISCOMATRIX 佐劑的對照動物顯示出發(fā)病的跡象，并且到攻擊后第3天既不愛 動也不警覺，并且到第5至7天它們的身體狀況已惡化到必須進行安樂死的水平(圖4)。C.討論在研究期間所做的關鍵性且出乎意料的觀察是流感ISCOMATRIX 疫苗(包含 15 μ g的來自以下各項中之一的HA 甲型/新喀里多尼亞群島/20/1999 (HlNl)、甲型/威 斯康辛州/67/2005 (H3N2)以及乙型/馬來西亞/2506/2004與ISCOMATRIX 佐劑相結合) 在不存在響應于甲型/越南/1203/2004 (HI和VN)的可檢測的中和抗體的情況下保護雪貂 免受高致病性H5m病毒(甲型/越南/1203/2004)的致死性攻擊。在流感ISCOMATRIX 疫苗組中的雪貂溫度的短暫提高提示，在攻擊之后這些動物被感染，但病毒感染的程度被 非中和抗體介導的免疫機制所限制，由此導致病毒的快速清除并且從感染中恢復。這些動物沒有損失體重并且在攻擊之后依然活躍且警覺的這種觀察支持這項結 論。相反，單獨接受2個劑量的ISCOMATRIX 佐劑的對照動物經歷了快速、延長的溫度提 高，并且它們的健康狀況快速惡化至必須進行安樂死的程度。目前，由于不存在評價雪貂細胞免疫應答(特別是CD8+CTL應答)的測定法，所以 不可能鑒定出由流感ISCOMATRIX 疫苗針對H5W病毒的致死性攻擊提供保護的免疫基礎。 流感ISC0M 疫苗已顯示在多個物種(包括人類)中誘導⑶8+CTL應答[10 ；15 ；16]。此外， HlNl ISC0M 疫苗在小鼠中已顯示出針對異源攻擊的保護，這部分地由于誘導交叉保護的 CDS+CTL應答的緣故。然而，如以上所提及，廣泛接受的是誘導最佳的CD8+CTL應答要求將 該抗原結合到ISC0M 或ISCOMATRIX 佐劑之中[17-19]。因此，出乎意料的是在本研究中 觀察到在不存在可檢測的中和抗體應答時，流感ISCOMATRIX 疫苗誘導細胞免疫應答(盡 管沒有正式地證實但最可能是CD8+CTL應答)，這種細胞免疫應答足夠有力地保護雪貂抵抗高致病性H5m病毒的致死性攻擊。此外，由于在所有甲型菌株流感病毒的內部蛋白質(包 括經鑒定的⑶8+CTL表位)之間高度的序列保守性，合理的是假設流感ISCOMATRIX 疫苗 會同樣地針對其它潛在的大流行性菌株(包括但不限于H7N7、H7N3、H9N2以及H10N7)進 行保護。參考文獻[l]Lin YPiGregory ViBennett Μ,Hay A. Recent changes amonghuman influenza viruses. Virus Res 2004 Jul ；103(1-2) :47_52.
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權利要求
一種用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保護性免疫應答的方法，該方法包括給予受試者一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中受試者是人。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中組合物包括地方性甲型流感Hmi和 /或H3N2亞型的免疫原。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中無免疫原的免疫刺激復合物包括皂 苷、甾醇和可選的磷脂。
5.根據權利要求4所述的方法，其中無免疫原的免疫刺激復合物包括ISCOMATRIX 佐劑。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中流感病毒的大流行性亞型選自甲型 流感的115附、!17町、!17吧、!19擬或!11(^7亞型。
7.根據權利要求6所述的方法，其中大流行性亞型是甲型流感H5W亞型。
8.一種組合物在制備用于給予受試者以便在該受試者體內引起或誘導針對流感病毒 的大流行性亞型的保護性免疫應答的藥物中的用途，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及 ( )作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。
9.一種組合物用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保護性 免疫應答的用途，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及 ( )作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。
10.一種用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保護性免疫應 答的藥劑，其中所述藥劑是一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及 ( )作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。
全文摘要
一種用于在受試者體內引起或誘導針對流感病毒的大流行性亞型的保護性免疫應答的方法，包括給予受試者一種組合物，該組合物包括(i)地方性流感亞型的至少一種免疫原，以及(ii)作為佐劑的無免疫原的免疫刺激復合物。
文檔編號A61P31/16GK101820904SQ200880111106
公開日2010年9月1日 申請日期2008年10月9日 優(yōu)先權日2007年10月12日
發(fā)明者D·瑞安, M·皮爾斯, S·羅克曼 申請人:Csl有限公司