鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征納米pcr檢測(cè)試劑盒及其檢驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 2014年11月份以來(lái)，我國(guó)江蘇、安徽、山東、江西、河南、河北等省份，商品肉鴨群 發(fā)生了不明原因的以雛鴨發(fā)育遲緩，上下喙萎縮，舌頭外伸、腫脹、向下彎曲為特征的疾病。 根據(jù)其臨床表現(xiàn)，該病暫定名為"鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征"。該病的發(fā)病率為10-30%，嚴(yán)重時(shí)可 達(dá)50%以上，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前已證實(shí)，該病的病原為新型鴨源細(xì) 小病毒，也稱(chēng)為鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒。
[0003] 鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征的檢測(cè)方法主要包括病毒分離、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)等，這些 方法在病毒檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。其中PCR檢測(cè)方法由于操作簡(jiǎn)單，靈敏性高、重復(fù)性好 等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中，PCR技術(shù)存在諸多局限性，例如對(duì)復(fù)雜體系的擴(kuò)增會(huì) 出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增以及擴(kuò)增效率不夠高等問(wèn)題。為解決以上問(wèn)題，尋找可以提高PCR 特異性和效率的添加劑顯得極其重要。
[0004] 納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù)，其原理是把粒徑為lnm~100nm的固相納 米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。由于納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性，因此在添加 了納米金顆粒的PCR循環(huán)體系中，PCR反應(yīng)會(huì)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少了在非目標(biāo)溫度的 停留時(shí)間，進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，減少非特性擴(kuò)增，提高特異性擴(kuò)增 產(chǎn)量。因此，目前亟需建立一種能夠快速、特異的檢測(cè)鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征的納米PCR檢測(cè)手 段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征檢測(cè)的納米 PCR試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒能夠快速、特異的檢測(cè)鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征檢測(cè)的納米PCR試劑 盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸鈉，飽和酚：氯仿：異戊醇，無(wú)水乙醇，無(wú)菌蒸餾水，其特征在 于所述試劑盒還包括2XNan〇PCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ IDNo. 1所示，所述下游引物的序列為SEQIDNo. 2所示。
[0007] 引物是根據(jù)GenBank公布的鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒序列，在其Rep與VP1基因保 守序列區(qū)域設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物。
[0008] 優(yōu)選的，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture組 成。
[0009] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括DNA提取試劑：蛋白酶K，裂解液，醋酸鈉，飽和酚：氯仿 :異戊醇，無(wú)水乙醇，無(wú)菌蒸餾水。
[0010] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照。
[0011] 其中，陽(yáng)性對(duì)照可為將鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒接種9-11日齡鴨胚后，收集96~ 144小時(shí)感染鴨胚的尿囊液。
[0012] 本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鴨短喙長(zhǎng)舌綜合 征病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013] 應(yīng)用所述試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒的方法，包括如 下步驟： 1、病毒DNA的提取 取300yL經(jīng)過(guò)預(yù)處理的待測(cè)樣品置于1.5mL離心管中，加入10mg/ml蛋白酶K10μL，裂解液300μL，50°C孵育2h后加入610μLtris飽和酚，充分震蕩5min，12000rpm 離心10min;將上清轉(zhuǎn)移至新1. 5mL離心管中加等體積酸：氯仿：異戊醇（1 :24 :25)，充分 混勾12000rpm離心10min;取上清，加酸：氯仿：異戊醇重復(fù)抽提一次；抽提后將上清轉(zhuǎn)移 至新1. 5mL離心管中，加入2倍體積冰浴后無(wú)水乙醇，1/10體積3mol/L醋酸鈉，-20°C沉 淀45min后12000rpm離心10min，棄上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL無(wú)菌蒸餾水 溶解沉淀，-20 °C貯存?zhèn)溆谩?br>[0014] 待測(cè)樣品可為鴨脾臟、肝臟等組織。其中，待測(cè)樣品預(yù)處理的方法為：將待測(cè)樣品 剪碎后，按照1:5的質(zhì)量體積比加入生理鹽水并研磨均勻，3000~5000rpm離心5~10 min后取上清，之后再進(jìn)行DNA的提取。
[0015] 2、納米PCR反應(yīng) 在反應(yīng)管中加入10yL2XNanoPCR Mix、lyL上述DNA溶液、0.5yL1〇μΜ的上游引 物（SEQIDNo.1)、0. 5yL1〇μΜ的下游引物（SEQIDNo.2)，最后加入無(wú)核酸酶水至總體 積為20μL。
[0016] 混勻后按如下反應(yīng)程序進(jìn)行：94°C3min，l個(gè)循環(huán)；94°C 10s，55°C 40 s，72°C 20 s，共30個(gè)循環(huán)；72°C 5min1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，若出現(xiàn)659 bp大小的條帶則待測(cè)樣品含有鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒。
[0017] 本發(fā)明提供了一對(duì)檢測(cè)鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒的特異性引物，利用其制成的納米 PCR試劑盒，能夠快速、特異的檢測(cè)鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒。本發(fā)明可使PCR反應(yīng)更快地達(dá) 到目標(biāo)溫度，減少了在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間，進(jìn)而縮短整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí) 間，大大提高了鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征的檢測(cè)效率，并有效提高了鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征病毒的特 異性擴(kuò)增產(chǎn)量，減少了非特異性擴(kuò)增，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征納米PCR檢測(cè)結(jié)果； M:DL2000Marker ;1:陽(yáng)性對(duì)照；2:陰性對(duì)照； 圖2為鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征納米PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果； M: DL2000 Marker ;1~6依次為10°~105倍比稀釋病毒核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物；7:陰性對(duì) 昭. ， 圖3為鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征納米PCR特異性檢測(cè)結(jié)果。
[0019] M:DL2000 Marker ;1:鴨短U彖長(zhǎng)舌綜合征病毒；2:鴨痕病毒；3:鴨肝炎病毒；4: 新城疫病毒；5 :禽流感病毒；6 :陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面參照附圖并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是本發(fā)明不限于所 給出的例子。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例 中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021] 實(shí)施例1一種檢測(cè)鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征的納米PCR試劑盒最佳實(shí)施例 本實(shí)施例試劑盒包括：（1)鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征DNA提取試劑：蛋白酶K，裂解液，醋酸 鈉，飽和酚：氯仿：異戊醇，無(wú)水乙醇，無(wú)菌蒸餾水。
[0022](2)納米PCR反應(yīng)試劑：2XNanoPCRMix、上游引物、下游引物；（4)其他：陽(yáng) 性對(duì)照和無(wú)核酸酶水。其中，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNan