專利名稱：一種用于快速檢測新型h1n1流感病毒的雙抗體夾心法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法。
背景技術(shù)：
甲型Hmi流感病毒(H1N1 hfluenza A (HlNl) virus)是一種具有高度傳染性的 呼吸道病毒，已被列入生物恐怖武器。2009年流感大流行的病毒為新型Hmi病毒，此次流 感引起了世界范圍內(nèi)的大流行，為人類健康造成重大危害，建立快速的檢測方法以預(yù)防流 感病的發(fā)生迫在眉睫。目前檢測新型Hmi流感病毒的方法主要有病毒分離培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄 多聚酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)、血清學(xué)診斷和抗原檢測。但是，流感病毒分離鑒定所需的時(shí)間長、 成本高，且需要在生物安全實(shí)驗(yàn)室或國家指定研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行，而RT-PCR則依賴于特定的設(shè) 備、良好的實(shí)驗(yàn)室條件和高素質(zhì)的技術(shù)人員，難以在邊境口岸推廣應(yīng)用，因此，亟待研究建 立一種新型Hmi流感病毒快速、有效的抗原診斷技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便、檢測準(zhǔn)確的用 于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法， 具體為1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增表達(dá)新型Hmi流感病毒HAlN端球形亞基引物；2)新型Hmi流感病毒血凝素HAlN端球形亞基蛋白的PCR擴(kuò)增；3)將目的片段與載體pETlOO/D-TOPO連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒；4)轉(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)胞；5) IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)；6)采用間接ELISA和^festern blottin免疫印跡分析純化產(chǎn)物的抗原性；
7)重組蛋白免疫兔制備兔血清；8)制備的兔血清用于ELISA包被，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗Hmi流感血凝素蛋 白作為二抗；9)建立雙抗體夾心檢測新甲型Hmi流感病毒抗原的方法。進(jìn)一步，所述步驟1)中引物序列為HA-F 5 ‘ -caccatgtatcatgcgaacaattcaacagacact-3‘HA-R -ttatccggcttgaacttcttgctgtatctt_30進(jìn)一步，所述步驟幻中PCR擴(kuò)增具體為用Trizol RNA提取試劑盒提取新型Hmi 流感病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄步驟如下RNA 5ul，隨機(jī)引物lul，無核酸酶水2ul混勻后，在 PCR儀上進(jìn)行預(yù)變性后加入反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件為42°C、90min，72°C、IOmin ；接著以cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系包括200ymol/LdNTPS 1.5ul，0. 4ul高保真聚合酶，10 μ mo 1引 物 HA-F，HA-R 各 1. 5ul，IOXbuffer 10ul，cDNA 2ul，補(bǔ)足體系為 50ul，反應(yīng)條件為-MVM變性3min，接著35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性30s，52°C退火30s，72°C聚合40s，最后72°C 延伸lOmin。IOul產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進(jìn)一步，所述步驟幻中重組質(zhì)粒具體為取一只無菌的2mlEP管，分別加入水 2ul，膠條回收純化產(chǎn)物2ul，Salt solution lul，pET-lOO/D-TOPO載體lul，混勻，室溫靜 置5min，無菌操作臺上取3ul該體系到一瓶toplO細(xì)胞中，靜止30min后42°C熱擊40s，立 即放在冰上anin后在無菌操作臺上加入250ul的soc培養(yǎng)基。半蓋緊蓋子，37°C，225rpm， 2h，吸取200ul涂布于含有終濃度為50ug/ml氨芐抗生素的固體平板上，37°C培養(yǎng)箱倒置培 養(yǎng) 16h。進(jìn)一步，所述步驟5)中具體步驟為將經(jīng)過菌落PCR鑒定為陽性的單克隆接種于 5ml終濃度為50ug/ml氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 °C，225rpm,培養(yǎng)12h，吸取3ml接種于 200ml的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用單光束紫外可見分光光度計(jì)測定0D600為0. 6時(shí)，加 入終濃度為1. Ommol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)乩。進(jìn)一步，所述步驟6)中間接ELISA檢測具體為用PH9. 0碳酸鹽稀釋純化蛋白并 進(jìn)行梯度包被，PBS梯度稀釋的兔抗Hmi流感病毒血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為 二抗，進(jìn)行ELISA檢測，并設(shè)空白對照和免疫前兔血清為陰性對照，待測樣本OD值大于陰性 對照OD值2倍以上為陽性。進(jìn)一步，所述步驟9)中具體步驟為①兔血清包被將制備的兔血清用PH9. 6的 碳酸鹽緩沖液稀釋為10_3、10_4、10_53個(gè)濃度，IOOul/孔，置于4°C冰箱孵育12-1 ；②洗滌 每孔加入300ul的Wash buffer洗滌3次，每次2min，然后拍干；③封閉用含2%牛血清 白蛋白的Wash buffer加滿孔，37°C孵育封閉池，洗滌同步驟2 ；④加檢測樣品-新型Hmi 流感病毒將新型Hmi流感病毒用樣品稀釋液稀釋為10_2超聲15分鐘，10倍梯度稀釋為 io-2、io-3、io-4、io-5、io-6，iooui/孔。每個(gè)稀釋度重復(fù)一次；采集正常人咽拭子后將咽拭子 在裝有Iml的0. OlM PBS中充分洗滌，IOOul每孔，作為陰性對照，重復(fù)3次；37°C孵育2h， 洗滌同步驟②；另留3孔作為試劑空白對照；⑤加二抗用PH7. 4的樣品稀釋液將辣根過氧 化物酶標(biāo)記的兔抗Hmi血凝素蛋白稀釋為如g/ul，每孔IOOul/孔。37°C孵育1.證，洗滌 同步驟②；⑥顯色每孔加入IOOul的TMB，37°C顯色20min ；⑦終止反應(yīng)每孔加入50ul的 TMB,自動(dòng)酶聯(lián)檢測儀0D450讀數(shù)。本發(fā)明一種用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，能夠進(jìn)行快速、有 效的抗原診斷，使用方便、檢測準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適合邊境口岸等地區(qū)推廣應(yīng)用。


圖1為HAlN端球形蛋白的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定電泳圖；圖3為重組蛋白表達(dá)電泳圖；圖4為SDS-PAGE鑒定純化蛋白電泳圖；圖5為western blot雜交鑒定純化蛋白電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一種用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，關(guān)鍵技術(shù)之處在于用基因工程方法制備新型Hmi流感病毒血凝素蛋白HAlN端亞基特異性重組抗原，以該 抗原免疫兔，制備的兔血清用于ELISA包被，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗Hmi血凝素蛋白 作為檢測抗體，建立了雙抗體夾心檢測新型Hmi流感病毒的方法。本發(fā)明的技術(shù)路線如下設(shè)計(jì)擴(kuò)增表達(dá)新型Hmi流感病毒HAlN端球形亞基引物一PCR擴(kuò)增一目的片 段與載體pETlOO/D-TOPO連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒一轉(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)胞(大腸桿菌BL21) — IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)一間接ELISA和Wfesternblottin免疫印跡分析純化產(chǎn)物的抗原性 —HisTrapTMHp (組氨酸)親和吸附柱純化系統(tǒng)對重組蛋白進(jìn)行純化一重組蛋白免疫兔制備 兔血清一制備的兔血清用于ELISA包被，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗Hmi流感血凝素蛋白 作為二抗，建立雙抗體夾心檢測新甲型Hmi流感病毒抗原的方法。具體步驟如下一、材料與方法1.材料甲型Hmi流感病毒；HlNl (亞甲型，Al) ；H3N2 (香港型，A3)；乙型維多利亞系 (Victoria) :B/江西修水/32/2009 ；乙型亞馬它達(dá)系(yamagata) :B/廣東新興/134/2009 流感病毒。牛血清白蛋白(BSA)，Trizol RNA提取試劑盒，小量膠條回收純化試劑盒 (QIAGEN)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，高保真酶試劑盒，質(zhì)粒小量提取試劑盒，Directional Topo Cloning kit試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。2.方法2. 1新型Hmi流感病毒HAlN端球形亞基引物設(shè)計(jì)位于病毒表面的血凝素蛋白由三個(gè)非共價(jià)結(jié)合的HA蛋白單體組成，每個(gè)HA單體 分成兩部分，一部分由HAl構(gòu)成的N端球形頭部，含有受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇；另一部 分由HAl的一部分和整個(gè)HA2組成的柄，插入囊膜。HAl具有HA的主要抗原性與宿主細(xì)胞 受體結(jié)合的特性，其球形頭部的受體結(jié)合位點(diǎn)(Rec印tor binding site, RBS)是病毒識別 并結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體的部位，而HA的變異頻率較高，通過突變使其逃脫宿主免疫引起 新的流感病毒大流行，因此本研究的出發(fā)點(diǎn)為HAlN端球形亞基蛋白。具體實(shí)施如下(1)從 GenBank 中調(diào)出(A/California/04/2009 (HlNl)株血凝素蛋白 HAl 的基因 序列(52-1032bp)。gacacatta tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact
agaaaagaatgtaacagtaacacactctgttaaccttctagaagacaagcataacgggaa
actatgcaaactaagaggggtagccccattgcatttgggtaaatgtaacattgctggctg
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2. 4菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒隨機(jī)挑選5個(gè)菌落，每個(gè)菌落一半用于PCR鑒定，另一半挑取接種于5ml含氨芐抗 生素的LB培養(yǎng)基中，37°C，225rpm，培養(yǎng)12h。菌落PCR鑒定體系包括，IOxbuffer 3ul,2. 4ul 的dNTPs，DNA聚合酶0. 4ul, IOumol的引物HA_F，HA-R各2. 5ul，反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 IOmin 后接著；35 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 40s，最后 72°C延伸 lOmin。瓊脂糖鑒 定。結(jié)果都為陽性。表明目的基因也成功亞克隆至pET-100/D載體。2. 5重組質(zhì)粒的鑒定與轉(zhuǎn)化取3ml菌落PCR鑒定為陽性的菌液，用質(zhì)粒小量提取試劑盒取重組質(zhì)粒，送往上海 生工測序，測序結(jié)果BLAST比對，_80°C取出一瓶BL21細(xì)胞，冰上解凍，加入質(zhì)粒2ul，混勻， 室溫靜止5min后，42°C熱擊40s，步驟同2. 3，鑒定是否轉(zhuǎn)化成功步驟同2.4。2. 6重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)過菌落PCR鑒定為陽性的單克隆接種于5ml終濃度為50ug/ml氨芐抗生素的 LB培養(yǎng)基中，37°C，225rpm，培養(yǎng)12h，吸取3ml接種于200ml的LB培養(yǎng)基中(氨芐終濃度 為50ug/ml)。繼續(xù)培養(yǎng)池，用單光束紫外可見分光光度計(jì)測定0D600為0. 6時(shí)，加入終濃 度為1. Ommol/L的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)他。 2. 7重組蛋白的提取純化吸取2ml誘導(dǎo)表達(dá)Mi的菌液做SDS-PAGE，初步確定蛋白是否表達(dá)及表達(dá)量，4°C， 12000r/min離心30min，收集細(xì)胞沉淀，用0. OlM PH7. 4的PBS洗滌三次，加入PH8. 0裂解液 (Tris-Nacl)懸浮，超聲，離心后分別取IOul上清和沉淀做SDS-PAGE，電泳后用考馬斯亮藍(lán) R-250進(jìn)行凝膠染色，脫色液進(jìn)行脫色后檢查特異性目的蛋白條帶。結(jié)果表明種重組蛋白以 包涵體的形式表達(dá)，收集超聲離心后的細(xì)胞沉淀(主要含有一些細(xì)胞碎片和包涵體)，加入 PH8. 0的尿素懸浮，置于冰上搖2h溶解包涵體，12000r/min,離心30min，上清經(jīng)0. 22um的 濾膜過濾后用HisTrapTMHP (組氨酸)親和吸附柱純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，SDS-PAGE鑒定純度， 最后將純化的蛋白透析到0. 01M, PH7. 4的PBS中，PEG-20000濃縮。取2mg純化的蛋白送 往北京京天成公司制備多抗。2. 8純化產(chǎn)物抗原性鑒定間接ELISA和^festern blotting免疫印跡分析間接ELISA檢測用PH9. 0碳酸鹽稀釋純化蛋白并進(jìn)行梯度包被，PBS梯度稀釋的 兔抗Hmi流感病毒血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行ELISA檢測，并設(shè)空 白對照和免疫前兔血清為陰性對照，待測樣本OD值大于陰性對照OD值2倍以上為陽性。Western blot檢測純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，使用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀將蛋 白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡(參考文獻(xiàn)劉進(jìn)元.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).第 2版.北京高等教育出版社，2006，76-8；3) —抗為抗組氨酸的鼠單克隆抗體(his-tag monoclonalantibody (Novagen) )，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG， ADB顯色。2. 9雙抗體夾心ELISA檢測新型Hmi流感病毒步驟如下(1)兔血清包被將制備的兔血清用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋為10-3、10-4、10_53個(gè)濃度，IOOul/ 孔，置于4°C冰箱孵育12-16h。(2)洗滌
每孔加入300ul的Wash buffer洗滌3次，每次2min，然后拍干。(3)封閉用含2%牛血清白蛋白的Wash buffer加滿孔，37°C孵育封閉池，洗滌同步驟2。(4)加檢測樣品-新型Hmi流感病毒將新型Hmi流感病毒用樣品稀釋液稀釋為10_2超聲15分鐘，10倍梯度稀釋為 10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，100ul/孔。每個(gè)稀釋度重復(fù)一次。采集正常人咽拭子后將咽拭子 在裝有Irnl的0. OlM PBS中充分洗滌，IOOul每孔，作為陰性對照，重復(fù)3次。37°C孵育2h， 洗滌同步驟2。另留3孔作為試劑空白對照。(5)加二抗用PH7. 4的樣品稀釋液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗Hmi血凝素蛋白稀釋為 4ug/ul，每孔IOOul/孔。37°C孵育1.5h，洗滌同步驟2。

(6)顯色
每孔加入IOOul的TMB，37°C顯色20min。
(7)終止反應(yīng)
每孔加入50ul的TMB，自動(dòng)酶聯(lián)檢測儀0D450讀數(shù)。
(8)檢測結(jié)果如下
表1雙抗體夾心ELISA檢測甲流病毒Hmi抗原及其OD值
兔血清包被稀釋度
HlNl稀釋比1: IO31:IO41: IO5陰性令白1: IO22. 4652.4352. 400. 2070. 042.420 .2.4022. 320. 210. 0421: IO32. 1131.7460. 400. 2070. 0422. 021.770. 3291: IO40. 6160.520. 2240. 7100.4810. 2581: IO50. 2590.1620. 1460. 2470.1610. 1141: IO60. 1670. 1610. 1140. 1520.150. 103. 0雙抗體夾心檢測流感病毒抗原的特異性對Hmi (亞甲型，Al)，H3N2(香港型，A3)，乙型維多利亞系(Victoria) :B/江西 修水/32/2009，乙型亞馬它達(dá)系(yamagata) =B/廣東新興/134/2009。等四株毒株進(jìn)行檢 測，HlNl病毒作為陽性對照。在特異性試驗(yàn)中，四株病毒不顯色，為陰性反應(yīng)。表2ELISA檢測流感病毒抗原的特異性
權(quán)利要求
1. 一種用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征在于，該方法具體為1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增表達(dá)新型Hmi流感病毒HAlN端球形亞基引物；2)新型Hmi流感病毒血凝素HAlN端球形亞基蛋白的PCR擴(kuò)增；3)將目的片段與載體pETlOO/D-TOPO連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒；4)轉(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)胞；5)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)；6)采用間接ELISA和Wfesternblottin免疫印跡分析純化產(chǎn)物的抗原性；7)重組蛋白免疫兔制備兔血清；8)制備的兔血清用于ELISA包被，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗Hmi流感血凝素蛋白作 為二抗；9)建立雙抗體夾心檢測新甲型Hmi流感病毒抗原的方法。
2.如權(quán)利要求1所述的用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征在 于，所述步驟1)中引物序列為HA-F :5‘ -caccatgtatcatgcgaacaattcaacagacact-3‘HA-R -ttatccggcttgaacttcttgctgtatctt-3‘ 0
3.如權(quán)利要求1所述的用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征在 于，所述步驟幻中PCR擴(kuò)增具體為用Trizol RNA提取試劑盒提取新型Hmi流感病毒的 總RNA，反轉(zhuǎn)錄步驟如下RNA5ul，隨機(jī)引物lul，無核酸酶水2ul混勻后，在PCR儀上進(jìn)行 預(yù)變性后加入反轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件為42°C、90min，72°C、IOmin ；接著以cDNA為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，體系包括 200 μ mo 1/LdNTPS 1. 5ul，0. 4ul 高保真聚合酶，10 μ mol 引物 HA-FjHA-R 各1.5ul。IOXbuffer 10ul，cDNA 2ul，補(bǔ)足體系為50ul，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，接 著；35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94°C變性30s，52°C退火30s，72°C聚合40s，最后72°C延伸lOmin。 IOul產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
4.如權(quán)利要求1所述的用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征在 于，所述步驟；3)中重組質(zhì)粒具體為取一只無菌的aiilEP管，分別加入水2ul，膠條回收純 化產(chǎn)物2ul，Salt solutionlul, pET-100/D-T0P0載體lul，混勻，室溫靜置5min，無菌操作 臺上取3ul該體系到一瓶toplO細(xì)胞中，靜止30min后42°C熱擊40s，立即放在冰上^iin 后在無菌操作臺上加入250ul的soc培養(yǎng)基。半蓋緊蓋子，37°C，225rpm，ai，吸取200ul涂 布于含有終濃度為50ug/ml氨芐抗生素的固體平板上，37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16h。
5.如權(quán)利要求1所述的用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征在 于，所述步驟5)中具體步驟為將經(jīng)過菌落PCR鑒定為陽性的單克隆接種于5ml終濃度為 50ug/ml氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C，225rpm，培養(yǎng)12h，吸取3ml接種于200ml的LB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用單光束紫外可見分光光度計(jì)測定0D600為0. 6時(shí)，加入終濃度為 1. Ommol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)6h。
6.如權(quán)利要求1所述的用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征在 于，所述步驟6)中間接ELISA檢測具體為用PH9.0碳酸鹽稀釋純化蛋白并進(jìn)行梯度包 被，PBS梯度稀釋的兔抗Hmi流感病毒血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行 ELISA檢測，并設(shè)空白對照和免疫前兔血清為陰性對照，待測樣本OD值大于陰性對照OD值2倍以上為陽性。
7.如權(quán)利要求1所述的用于快速檢測新型Hmi流感病毒的雙抗體夾心法，其特征 在于，所述步驟9)中具體步驟為①兔血清包被將制備的兔血清用PH9. 6的碳酸鹽緩沖 液稀釋為10-3、10-4、10_53個(gè)濃度，IOOul/孔，置于4°C冰箱孵育12_16h ；②洗滌每孔加入 300ul的Wash buffer洗滌3次，每次aiiin，然后拍干；③封閉用含2 %牛血清白蛋白的 Wash buffer加滿孔，37 °C孵育封閉池，洗滌同步驟2 ；④加檢測樣品-新型Hmi流感病毒 將新型Hmi流感病毒用樣品稀釋液稀釋為10_2超聲15分鐘，10倍梯度稀釋為10_2、10_3、 10-4、10_5、10-6，IOOul/孔。每個(gè)稀釋度重復(fù)一次；采集正常人咽拭子后將咽拭子在裝有Iml 的0. OlM PBS中充分洗滌，IOOul每孔，作為陰性對照，重復(fù)3次；37°C孵育池，洗滌同步驟 2 ；另留3孔作為試劑空白對照；⑤加二抗用PH7. 4的樣品稀釋液將辣根過氧化物酶標(biāo)記 的兔抗Hmi血凝素蛋白稀釋為如g/ul，每孔IOOul/孔。37°C孵育1.證，洗滌同步驟②；⑥ 顯色每孔加入IOOul的TMB，37°C顯色20min ；⑦終止反應(yīng)每孔加入50ul的TMB，自動(dòng)酶 聯(lián)檢測儀0D450讀數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于快速檢測新型H1N1流感病毒的雙抗體夾心法，具體為設(shè)計(jì)擴(kuò)增表達(dá)新型H1N1流感病毒HA1N端球形亞基引物→PCR擴(kuò)增→目的片段與載體pET100/D-TOPO連接，構(gòu)建重組質(zhì)?！D(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)胞(大腸桿菌BL21)→IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)→間接ELISA和Western blottin免疫印跡分析純化產(chǎn)物的抗原性→HisTrapTMHP(組氨酸)親和吸附柱純化系統(tǒng)對重組蛋白進(jìn)行純化→重組蛋白免疫兔制備兔血清→制備的兔血清用于ELISA包被，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗H1N1流感血凝素蛋白作為二抗，建立雙抗體夾心檢測新甲型H1N1流感病毒抗原的方法。本方法能夠進(jìn)行快速、有效的抗原診斷，具有使用方便、檢測準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適合邊境口岸等地區(qū)推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/44GK102095852SQ20101056200
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者楊宇, 王靜, 胡健萍 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院