一種流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種流感病毒滅活驗(yàn)證的檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是應(yīng)用Vero細(xì)胞法檢測(cè)流感病毒的滅活驗(yàn)證，將待檢樣品稀釋至原倍、10-1、10-2，每個(gè)稀釋度接種6瓶細(xì)胞。每瓶細(xì)胞接種樣品1ml，33℃吸附60min后倒掉，加入病毒培養(yǎng)液5ml。33℃培養(yǎng)72小時(shí)后分別收獲培養(yǎng)液做血凝。將同一稀釋度收獲液按1∶1混合，按上述方法再盲傳2代，收獲樣品做血凝，第三代血凝結(jié)果為陰性判為合格，否則不合格。本發(fā)明解決了一旦禽流感爆發(fā)，雞胚的來(lái)源問(wèn)題，采用Vero細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，具有方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈活性好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物制劑的檢測(cè)方法，特別是涉及一種流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證的檢測(cè)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證的檢測(cè)方法應(yīng)用的是雞胚法。將病毒滅活后的尿囊液樣品做10倍系列稀釋，取原倍、KT1及10_2倍稀釋的病毒液分別接種雞胚尿囊腔，每組接種10枚9~11日齡雞胚，每胚接種0.2ml，置33~35°C培養(yǎng)72小時(shí)。24小時(shí)內(nèi)死亡的不計(jì)數(shù)，每組雞胚須至少存活80%，自存活的雞胚中每胚取0.5ml尿囊液，按組混合后，再盲傳一代，每組各接種10枚胚，每胚接種0.2ml，經(jīng)33~35°C培養(yǎng)72小時(shí)后，取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)血凝反應(yīng)。
[0003]現(xiàn)有“流感滅活試驗(yàn)驗(yàn)證”是《藥典三部》針對(duì)雞胚流感疫苗“滅活試驗(yàn)驗(yàn)證”的方法，是在雞胚盲傳2代血凝結(jié)果為陰性判為合格。此方法適合檢驗(yàn)雞胚流感疫苗。流感病毒在Vero細(xì)胞上經(jīng)過(guò)十幾代的適應(yīng)后,對(duì)Vero細(xì)胞適應(yīng)能力增強(qiáng),對(duì)雞胚適應(yīng)能力相對(duì)減弱，敏感性降低。再用雞胚做為宿主來(lái)檢驗(yàn)病毒是否滅活徹底，結(jié)果的準(zhǔn)確性有待論證。一但禽流感爆發(fā)，雞胚的來(lái)源更是個(gè)問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，公開了一種采用Veix)細(xì)胞檢測(cè)流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證的方法。本發(fā)明給出的這種新的流感病毒滅活驗(yàn)證的方法采用Vero細(xì)胞作為病毒的培養(yǎng)基質(zhì)，通過(guò)對(duì)靈敏度的考察，和對(duì)比試驗(yàn)，證明用VeiO細(xì)胞做流感病毒“滅活試驗(yàn)驗(yàn)證”方法是可行的。
[0005]本發(fā)明給出的技術(shù)方案是:這種流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證的檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是應(yīng)用VeiO細(xì)胞法檢測(cè)流感病毒的滅活驗(yàn)證，有以下步驟:
[0006](I)將H3N2型流感病毒(批號(hào)為20090731-5)稀釋至每孔出1_5個(gè)斑，即稀釋至10_7、0.5X10_7，用此稀釋度分別接種雞胚、方瓶、6孔板:
[0007]雞胚:10-7、0.5Χ 10-7 各 6 枚胚，0.2ml/ 胚；
[0008]方瓶:1(T7、0.5 X ΙΟ—7 各 6 孔，0.5ml/瓶;
[0009]6 孔板:10-7、0.5Χ 10-7 各 6 孔，0.5ml/ 孔；
[0010]雞胚一對(duì)一傳2代，并分別檢測(cè)血凝滴度，判定結(jié)果；方瓶一對(duì)一傳2代，并分別檢測(cè)血凝滴度，判定結(jié)果；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板傳I代，空斑形成，判定結(jié)果；
[0011 ] (2)利用Veo細(xì)胞法檢測(cè)流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證:
[0012]T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后備用；
[0013]將待檢樣品稀釋至原倍、10'10_2，每個(gè)稀釋度接種6瓶細(xì)胞；
[0014]每瓶細(xì)胞接種樣品lml，33°C吸附60min后倒掉，加入病毒培養(yǎng)液5ml ；
[0015]33°C培養(yǎng)72小時(shí)后分別收獲培養(yǎng)液做血凝；[0016]將同一稀釋度收獲液按1:1混合，按上述方法再盲傳2代，收獲樣品做血凝；
[0017]結(jié)果:第三代血凝結(jié)果為陰性判為合格，否則不合格。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:提供了一種流感病毒滅活驗(yàn)證的檢測(cè)方法(細(xì)胞法)，采用Vero細(xì)胞作為病毒的培養(yǎng)基質(zhì)，通過(guò)靈敏度的考察和對(duì)比試驗(yàn)，證明建立VeiO細(xì)胞法作為流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證方法是可行的。將待檢樣品稀釋至原倍、10'10_2，每個(gè)稀釋度接種6瓶細(xì)胞。每瓶細(xì)胞接種樣品lml，33°C吸附60min后倒掉，加入病毒培養(yǎng)液5ml。33°C培養(yǎng)72小時(shí)后分別收獲培養(yǎng)液做血凝。將同一稀釋度收獲液按1:1混合，按上述方法再盲傳2代。收獲樣品做血凝。第三代血凝結(jié)果為陰性判為合格，否則不合格。本試驗(yàn)方法解決了一旦禽流感爆發(fā),雞胚的來(lái)源問(wèn)題。采用Vero細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，具有方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈活性好等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
[0020]將H3N2型流感病毒(批號(hào)為20090731-5)稀釋至每孔出1_5個(gè)斑，即稀釋至10_7、0.5X10'用此稀釋度分別接種雞胚、方瓶、6孔板。雞胚:10_7、0.5X10—7各6枚胚，0.2ml/胚；方瓶:10-7、0.5Χ10-7 各 6 孔，0.5ml/瓶；6 孔板:10-7、0.5Χ10-7 各 6 孔，0.5ml/ 孔。雞胚一對(duì)一傳2代，并分別檢測(cè)血凝滴度，判定結(jié)果。方瓶一對(duì)一傳2代，并分別檢測(cè)血凝滴度，判定結(jié)果。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板傳I代，空斑形成，判定結(jié)果。
[0021]結(jié)果見下表:
【權(quán)利要求】
1.一種流感病毒滅活驗(yàn)證的檢測(cè)方法，其特征在于:應(yīng)用Vero細(xì)胞法檢測(cè)流感病毒的滅活驗(yàn)證，有以下步驟: (1)將H3N2型流感病毒(批號(hào)為20090731-5)稀釋至每孔出1_5個(gè)斑，即稀釋至10_7、.0.5 X 10-7，用此稀釋度分別接種雞胚、方瓶、6孔板:
雞胚:10_7、0.5 X IO-7 各 6 枚胚，0.2ml/ 胚；
方瓶:10-7、0.5Χ 10-7 各 6 孔，0.5ml/ 瓶； .6 孔板:10-7、0.5Χ10-7 各 6 孔，0.5ml/孔； 雞胚一對(duì)一傳2代，并分別檢測(cè)血凝滴度，判定結(jié)果；方瓶一對(duì)一傳2代，并分別檢測(cè)血凝滴度，判定結(jié)果；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板傳I代，空斑形成，判定結(jié)果； (2)利用Veo細(xì)胞法檢測(cè)流感病毒滅活試驗(yàn)驗(yàn)證: T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后備用； 將待檢樣品稀釋至原倍、10'10_2，每個(gè)稀釋度接種6瓶細(xì)胞； 每瓶細(xì)胞接種樣品lml，33°C吸附60min后倒掉，加入病毒培養(yǎng)液5ml ； .33°C培養(yǎng)72小時(shí)后分別收獲培養(yǎng)液做血凝； 將同一稀釋度收獲液按1:1混合，按上述方法再盲傳2代，收獲樣品做血凝； 結(jié)果:第三代血凝結(jié)果為陰性判為合格，否則不合格。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103924005SQ201310016065
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月16日
【發(fā)明者】周荔葆, 廖輝, 劉苗苗, 趙新, 吳瓊, 曲格霆, 李璇 申請(qǐng)人:遼寧成大生物股份有限公司