專利名稱：一種甲型h1n1流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于免疫層析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
流行性感冒(Influenza)簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。該病潛伏期短，傳染性強(qiáng)，迅速傳播。流感病毒分甲型、乙型、丙型三型，甲型流感威脅最大。甲型Hmi流感病毒(豬流感，swine infuenza)，屬于正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒屬(Influenza virus Α)。典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80nm-120nm，有囊膜。其基因?yàn)閱喂韶?fù)鏈RNA病毒，基因組約為13.6kb，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成，共編碼10種蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2)。流感病毒核心的外面覆蓋著一層基質(zhì)蛋白膜，基質(zhì)蛋白膜外面又覆蓋著一層脂膜。有2種重要的跨膜蛋白穿過脂膜突出來，一是紅細(xì)胞凝集素(Hemagglutinin，HA)，一是神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase, ΝΑ)。它們分別在病毒識(shí)別靶細(xì)胞表面受體以及穿膜、成熟病毒粒子的釋放過程中具有重要作用。它們也是流感病毒亞型分型的依據(jù)。H有1 15個(gè)亞型，N有1 9個(gè)亞型(在甲型病毒的情況下)。由于H和N的組合不同，病毒的毒性和傳播速度也不相同。人為主要傳染源，主要通過飛沫或氣溶膠經(jīng)呼吸道傳播，也可通過口腔、鼻腔、眼睛等處黏膜直接或間接接觸傳播。接觸患者的呼吸道分泌物、體液和被病毒污染的物品亦可能造成傳播。自從二十世紀(jì)八十年代，側(cè)向免疫層析技術(shù)發(fā)展之初，這項(xiàng)技術(shù)就被廣泛的接受。 主要是因?yàn)槠鋵?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)便性側(cè)向免疫層析產(chǎn)品具有小而便于攜帶的優(yōu)勢(shì)，而且大多數(shù)產(chǎn)品不需要額外的試劑去實(shí)現(xiàn)結(jié)果，還有液態(tài)樣品直接可以用于測(cè)試，測(cè)試結(jié)果也能快速簡(jiǎn)便的讀取，而且經(jīng)常不需要任何儀器的輔助。其強(qiáng)大的功能在于可以將多個(gè)樣品同時(shí)在同一個(gè)產(chǎn)品上測(cè)量。其容易和其他技術(shù)結(jié)合起來綜合分析，如警察可以再路邊上用一個(gè)小型儀器同時(shí)測(cè)量藥物和酒精超標(biāo)情況。免疫層析試紙條的制作相對(duì)容易且成本低、材料成分的改進(jìn)，加工儀器的改進(jìn)，更加注意生產(chǎn)質(zhì)量等都可以增加可信度，精確性。然而，不斷涌現(xiàn)的對(duì)定量的結(jié)果和敏感性的要求對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的提出了更大的挑戰(zhàn)。磁性納米顆粒的出現(xiàn)使得這一技術(shù)得到了快速的發(fā)展，借助小型儀器對(duì)試紙條上免疫磁珠微量磁信號(hào)的檢測(cè)從而對(duì)樣品實(shí)行定量檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，使得這一技術(shù)得到認(rèn)可。納米磁珠免疫層析檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的基本原理如下利用納米磁珠標(biāo)記一種抗原或抗體，成為免疫磁珠，在NC膜上包被相應(yīng)的配對(duì)的抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的抗體或抗原時(shí)，免疫磁珠會(huì)和樣品中的抗原或抗體結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被捕獲線上的抗體或抗原捕獲，聚集在檢測(cè)線上，數(shù)分鐘后，再通過MICT磁信號(hào)檢測(cè)儀測(cè)定檢測(cè)線上捕獲磁珠的含量實(shí)現(xiàn)結(jié)果的判定。磁珠免疫層析試紙條的最大特點(diǎn)是可以通過MICT磁信號(hào)檢測(cè)儀讀取磁珠含量，定量檢測(cè)樣本中分析物的含量，而不只是像傳統(tǒng)的膠體金一樣只能通過肉眼觀察或評(píng)價(jià)其顏色深淺，因此使得結(jié)果更精確靈敏，數(shù)據(jù)客觀，易于讀取、保存記錄
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型解決的技術(shù)問題在于提供一種甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，將超順磁性納米顆粒作為標(biāo)記物，提高了篩查的工作效率，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，既可以定性又可以定量，特別適合大規(guī)爆發(fā)流行性傳染病時(shí)進(jìn)行快速篩查。本實(shí)用新型是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，包括底板，底板上設(shè)有免疫層析分離墊，在免疫層析分離墊的一端順次搭接有免疫磁珠結(jié)合墊和樣品墊，在免疫層析分離墊的另一端設(shè)有吸水墊；所述的免疫磁珠結(jié)合墊是在玻璃纖維素膜或無紡布上附著與抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HAl相偶聯(lián)的納米磁珠；所述的免疫層析分離墊是在硝酸纖維素膜上間隔5 8mm設(shè)置檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線；T線上吸附有抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HA2，C線上吸附有羊抗鼠的二抗。所述的免疫層析分離墊上還覆蓋有一層保護(hù)膜或標(biāo)志膜。所述的免疫磁珠結(jié)合墊和樣品墊搭接在靠近檢測(cè)線的一端，吸水墊搭接在靠近質(zhì)控線的一端。所述的底板為PVC板，樣品墊為玻璃纖維素膜或無紡布，納米磁珠為超順磁性納米磁珠。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型具有以下有益的技術(shù)效果1)本實(shí)用新型設(shè)計(jì)的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，通過免疫磁珠結(jié)合墊和免疫層析分離墊的設(shè)計(jì)，在進(jìn)行免疫層析時(shí)，待檢樣本中包含的病毒偶聯(lián)于免疫磁珠并進(jìn)行夾心式抗體的識(shí)別捕捉，提高了篩查的工作效率，大大提高了檢測(cè)的靈敏度， 是一種對(duì)甲型Hmi流感病毒快速檢測(cè)的試劑盒。2)本實(shí)用新型設(shè)計(jì)的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，既可以通過肉眼觀測(cè)條帶顏色的深淺，從而判斷是否感染了甲型Hmi流感病毒，也可以通過磁力檢測(cè)儀(MICT)檢測(cè)試紙條特定位置上的磁信號(hào)，根據(jù)磁信號(hào)得出待測(cè)樣品中病毒蛋白的含量， 尤其適合大規(guī)爆發(fā)流行性傳染病時(shí)進(jìn)行快速篩查。3)本實(shí)用新型所使用的免疫磁珠為超順磁性納米磁珠，不受其他有色雜質(zhì)干擾， 通過高靈敏度磁性檢測(cè)儀測(cè)量結(jié)合在免疫磁性復(fù)合物上的微粒所產(chǎn)生的局部磁場(chǎng)效應(yīng)，進(jìn)而得出所測(cè)分析物的定量結(jié)果，并使檢測(cè)下限高于同類目測(cè)法10 1000倍。4)本實(shí)用新型提供的快速檢測(cè)試劑盒，克服了主觀觀察顏色的缺點(diǎn)，使得判斷結(jié)果具有客觀，準(zhǔn)確，更值得信賴；而且其檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以保存數(shù)月至數(shù)年，有利于提供復(fù)檢的機(jī)會(huì)并易于保存原始數(shù)據(jù)。

圖1為本實(shí)用新型的側(cè)視圖；圖2為本實(shí)用新型的俯視圖。[0022]其中1為樣品墊；2為免疫磁珠結(jié)合墊；3為免疫層析分離墊；4為檢測(cè)線T線；5 質(zhì)控線C線；6為吸水墊；7為底板。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是對(duì)本實(shí)用新型的解釋而不是限定。參見圖1、圖2，一種甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，包括底板7，底板7上設(shè)有免疫層析分離墊3，在免疫層析分離墊3的一端順次搭接有免疫磁珠結(jié)合墊2和樣品墊1，在免疫層析分離墊3的另一端設(shè)有吸水墊6 ；并且免疫磁珠結(jié)合墊2和樣品墊1 搭接在靠近檢測(cè)線的一端，吸水墊6搭接在靠近質(zhì)控線的一端。免疫層析分離墊3上還覆蓋有一層保護(hù)膜或標(biāo)志膜，以起到保護(hù)作用；所述的免疫磁珠結(jié)合墊2是在玻璃纖維素膜或無紡布上附著與抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HAl相偶聯(lián)的納米磁珠；所述的免疫層析分離墊3是在硝酸纖維素膜上間隔5 8mm設(shè)置檢測(cè)線T線4和質(zhì)控線C線5 ;T線上吸附有抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HA2，C線上吸附有羊抗鼠的二抗；anti-HAl和anti_HA2是兩種針對(duì)抗原血凝素HA的抗體。下面說明各個(gè)組件部分的制備及磁珠免疫層析試劑盒的組裝1、樣品墊的處理將玻璃纖維膜用作樣品墊，在樣品墊處理液中浸泡30min后取出在室溫下干燥后放入自封袋里保存?zhèn)溆谩悠穳|處理液的triton X100, 0. 1-1 %的PVP，0. 02M、PH7-9的磷酸鹽緩沖液。 2、以超順磁性納米磁珠作為納米磁珠，取2mg磁珠，用500 μ 1 PH 4-6的MES緩沖液洗滌3次并重懸于485 μ IMES緩沖液中，加入2. 5mg的EDC和NHS，25°C偶聯(lián)30min，然后用PH7-9的BST緩沖液洗滌磁珠2次并重懸于350 μ 1 BST緩沖液中，再加入50-500 μ g的 anti-HAl單抗。20_25°C偶聯(lián)過夜12小時(shí)，期間在垂直旋轉(zhuǎn)混合儀上不斷搖晃。然后用磁力架吸附磁珠洗滌，然后加入含有1-10% BSA的BST溶液中，封閉2-12h，最后洗滌后的磁珠重懸于保存液中。3、免疫結(jié)合墊的制備將偶聯(lián)好的納米磁珠用噴點(diǎn)儀均勻噴于玻璃纖維膜或無紡布上，在20-25°C干燥條件下干燥2-5小時(shí)，制成免疫結(jié)合墊。4、免疫層析分離墊的制備以0. OlM PH 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)分別將 anti-HA2單克隆抗體和羊抗鼠二抗配置成2mg/ml的溶液，并用噴膜儀在NC膜上以1 μ 1/ cm的量分別劃線作為T線和C線，兩條線間距為5-8mm，劃線后在37°C干燥30min。5、磁珠免疫層析試劑盒的組裝在干燥的室內(nèi)，溫度20_25°C，濕度小于30 %，將已包被好的NC膜放在PVC板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接免疫磁珠墊(2mm)粘貼，在免疫磁珠墊另一側(cè)搭接樣品墊 (3mm)，在NC膜的另一側(cè)搭接吸水墊(2mm)；最上面可貼一層標(biāo)志膜，用來保護(hù)試紙條，最后安裝在塑料支撐卡中即可。樣品的檢測(cè)及結(jié)果的顯示將被檢血清或尿液平衡至室溫，將試劑盒平放，在樣品墊上加入80-100 μ 1被檢樣品，溶液將溶解結(jié)合墊上的標(biāo)記好的磁珠，并在NC膜上發(fā)生層析，然后在5 IOmin內(nèi)用磁力檢測(cè)儀(MICT)檢測(cè)試紙條T線、C線上的磁信號(hào)，根據(jù)磁信號(hào)得出待測(cè)樣品中病毒蛋白的含量， 或直接用肉眼觀測(cè)條帶顏色的深淺，從而判斷是否感染了甲型Hmi流感病毒。
權(quán)利要求1.一種甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括底板(7)，底板 (7)上設(shè)有免疫層析分離墊(3)，在免疫層析分離墊(3)的一端順次搭接有免疫磁珠結(jié)合墊 (2)和樣品墊(1)，在免疫層析分離墊(3)的另一端設(shè)有吸水墊(6)；所述的免疫磁珠結(jié)合墊(2)是在玻璃纖維素膜或無紡布上附著與抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HAl相偶聯(lián)的納米磁珠；所述的免疫層析分離墊(3)是在硝酸纖維素膜上間隔5 8mm設(shè)置檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線；T線上吸附有抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HA2，C線上吸附有羊抗鼠的二抗。
2.如權(quán)利要求1所述的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的免疫層析分離墊(3)上還覆蓋有一層保護(hù)膜或標(biāo)志膜。
3.如權(quán)利要求1所述的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的免疫磁珠結(jié)合墊(2)和樣品墊(1)搭接在靠近檢測(cè)線的一端，吸水墊(6)搭接在靠近質(zhì)控線的一端。
4.如權(quán)利要求1所述的甲型Hmi流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的底板為PVC板，樣品墊為玻璃纖維素膜或無紡布，納米磁珠為超順磁性納米磁珠。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種甲型H1N1流感病毒免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒，包括底板，底板上設(shè)有免疫層析分離墊，在免疫層析分離墊的一端順次搭接有免疫磁珠結(jié)合墊和樣品墊，在免疫層析分離墊的另一端設(shè)有吸水墊；所述的免疫磁珠結(jié)合墊是在玻璃纖維素膜或無紡布上附著與抗原血凝素HA的鼠源性抗體anti-HA1相偶聯(lián)的納米磁珠；所述的免疫層析分離墊是在硝酸纖維素膜上間隔設(shè)置檢測(cè)線T線和質(zhì)控線C線。通過免疫磁珠結(jié)合墊和免疫層析分離墊的設(shè)計(jì)，在進(jìn)行免疫層析時(shí)，待檢樣本中包含的病毒偶聯(lián)于免疫磁珠并進(jìn)行夾心式抗體的識(shí)別捕捉，提高了篩查的工作效率，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，是一種對(duì)甲型H1N1流感病毒快速檢測(cè)的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/569GK202075280SQ20112003130
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者孫建斌, 梁平, 海春旭, 王偉, 趙錦榮, 郭晏海, 雷小英, 顏真 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)