一種蘋果褪綠葉斑病毒檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物檢測領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明設(shè)及一種蘋果稱綠葉斑病毒檢測 試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果屬菩微科蘋果屬，多年生落葉果樹，原產(chǎn)于亞洲中部、歐洲東南及新疆西部。 蘋果病毒是導(dǎo)致蘋果果樹傳染病的主要因素，大多通過嫁接、修剪等傳染。若病毒在植株體 內(nèi)長年積累，將會引發(fā)嚴重后果。由于病毒是專性寄生，當(dāng)其大量繁殖時，會干擾果樹正常 繁殖代謝，引起樹體長勢減弱、葉片萎縮翻卷和果實崎形、風(fēng)味變劣，果樹提早枯死，甚至絕 產(chǎn)，嚴重影響蘋果的產(chǎn)量。因此，早期對蘋果果樹進行病毒檢測W及時采取防控措施，已迫 在眉睫。
[0003] 蘋果稱綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是果樹傳染病的 最主要病原體之一，又名蘋果潛隱病毒1，屬于纖毛病毒屬(Trichovirus)，主要侵染蘋果、 梨、核果類果樹及菩藻科觀賞品種等。被蘋果稱綠葉斑病毒侵染的果樹植株，樹體長勢日趨 衰退，葉片上會出現(xiàn)稱綠色如黃色斑點或條狀斑，卷縮變小或向?qū)?cè)彎曲，嚴重影響葉片的 光合作用面積。
[0004] 蘋果稱綠葉斑病毒是一種正義單鏈RNA病毒，為彎曲柔軟的纖維狀條形，無銷膜， 其堿基長度約為7.化b，核酸分子量大概是2500kDa，外殼蛋白由多膚組裝而成，分子量約為 22kDa。目前對蘋果稱綠葉斑病毒的檢測，多采用傳統(tǒng)的肉眼觀察、血清學(xué)法W及分子生物 學(xué)檢測方法，如RT-PCR。然而，傳統(tǒng)方法耗時長，靈敏度不高，特異性差，對檢測人員的水平 要求相對較高;血清學(xué)方法費用昂貴，操作步驟多，耗時較長，且樣品中可能存在與抗體發(fā) 生非特異性反應(yīng)的雜質(zhì)，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此只適合于初篩;而常規(guī)RT-PCR的特異性和 靈敏度也不高。為了適應(yīng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，有必要開發(fā)一種能夠更加快速、準(zhǔn)確地對蘋果稱綠 葉斑病毒進行檢測的方法。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些 年發(fā)展起來的一種新型的核酸擴增方法（見文獻Notomi T，0kayama H，Masubuchi Η, Yonekawa T,Watanabe Κ,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)。與常規(guī)PCR相比，LAMP無需模板的 熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，短時間內(nèi)即可實現(xiàn)大量拷貝數(shù)的核酸擴增，且 無需高端的儀器設(shè)備，具有特異性強、靈敏度高、易于判讀、可定性定量等優(yōu)勢。
[0006] 逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA檢測技術(shù)，其靈敏 度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP擴增原理與LAMP相同，但在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶， 使RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的LAMP擴增在同一試管中一步完成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種蘋果稱綠葉斑病毒檢測試劑盒及檢測方法。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個方面中，本發(fā)明提供了一種蘋果稱綠葉斑病毒檢 測試劑盒，其特征在于包括4條特異性引物:外引物F3,其序列如SEQ ID NO: 1所示;外引物 63，其序列如56〇10^:2所示；內(nèi)引物尸1口，其序列如56〇10^:3所示；內(nèi)引物81口，其序列 如SEQ ID N0:4所示。引物序列具體如下：
[0009] 外引物F3:ATGGAGGATCAGAAAGTGAT(沈Q ID N0:1)
[0010] 外引物B3:TGGTTGTAAAGAGGTTTGTGA(SEQ ID N0:2)
[0011] 內(nèi)引物FIP:TGGGTCCGAAGATGTAGTCTTGA-GTCATACAATCTGAAGGAGGT(沈Q ID N0:3)
[0012] 內(nèi)引物BIP:TCAGCAACATGACTTTCCGTCAG-CCTTTATACTTCAATTTCACCAAC(沈Q ID NO: 4)。
[0013] 優(yōu)選所述外引物F3和B3的濃度均為SpmolAU，所述內(nèi)引物FIP和BIP的濃度均為 40ρηιο1/μ1。
[0014] 進一步地，本發(fā)明的試劑盒還可W包括反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶 和核酸染料，其中所述反應(yīng)緩沖液由lOmM dNTP、10X化ermoPol反應(yīng)緩沖液、5mM甜菜堿和 50mM MgS〇4組成。
[0015] 優(yōu)選所述核酸染料為SYBR Green I。
[0016] 進一步地，本發(fā)明的試劑盒還可W包括RNA提取試劑W及陽性對照和陰性對照。
[0017] 在另一個方面中，本發(fā)明還提供了一種蘋果稱綠葉斑病毒檢測方法，其利用RT- LAMP技術(shù)，包括W下步驟：
[001引（1)提取待測樣品RNA;
[0019] (2)設(shè)計并合成引物；
[0020] (3)建立25μ1的RT-LAMP反應(yīng)體系，其包括5ρπιο1/μ1的外引物F3化l、5pmolAU的 外引物B3化1、40ρπιο1/μ1的內(nèi)引物FIP化1、40ρπιο1/μ1的內(nèi)引物BIP化1、反應(yīng)緩沖液2.化 1、2U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶化1、洲Bst DNA聚合酶化1、模板DNA化1，加水補充至25μ1，并W蘋果稱 綠葉斑病毒基因組DNA作為陽性對照，WlOOmM化is-HCl pH 8.0和50mM抓ΤΑ作為陰性對 照；
[0021] (4)LAMP反應(yīng):將步驟(3)中PCR管于63°C恒溫反應(yīng)60min;
[0022] (5)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果:在(4)中所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入化1核酸染料，根據(jù)反應(yīng) 液的顏色判斷是否存在蘋果稱綠葉斑病毒。
[0023] 在本發(fā)明的檢測方法中，所述外引物F3的序列如SEQ ID NO: 1所示，外引物B3的序 列如SEQ ID N0:2所示，內(nèi)引物FIP的序列如SEQ ID N0:3所示，內(nèi)引物BIP的序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0024] 優(yōu)選所述反應(yīng)緩沖液由lOmM dNTP、10X化ermoPol反應(yīng)緩沖液、5mM甜菜堿和50mM MgS〇4組成。
[0025] 優(yōu)選所述核酸染料為SYBR Green I，如反應(yīng)液顏色為澄色，表示結(jié)果為陰性，待測 樣品中不含ACLSV;如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽性，待測樣品中含有ACLSV。
[00%] 本發(fā)明的蘋果稱綠葉斑病毒檢測試劑盒和檢測方法利用RT-LAMP技術(shù)，針對M：LSV 保守區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，其識別A化SV的6個特定區(qū)域，特異性和靈敏度更高。反應(yīng)在 等溫(63°C)條件下進行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器，一步完成逆轉(zhuǎn)錄和擴增步驟，假陽性 率低、快速、高效，且通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，無需電泳和紫外觀察等步驟，鑒 定簡便，較傳統(tǒng)的檢測方法優(yōu)勢顯著，適合基層實驗室的快速診斷，易于大范圍推