一種流感病毒實時檢測試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及流感病毒檢測技術領域，具體涉及一種流感病毒實時檢測試劑盒及方 法。
【背景技術】
[0002] 流感是一種對公眾健康存在持續(xù)性和嚴重性威脅的疾病。隨著醫(yī)療科學的發(fā)展， 目前已有數(shù)種藥物用于治療或預防甲型和乙型流感。然而，有效預防控制或治療流感的前 提在于能夠在個體感染或大規(guī)模爆發(fā)的早期即實現(xiàn)對流感病毒的迅速、敏感和特異性檢 測 。
[0003] 流感病毒檢測的傳統(tǒng)方法通常首先需要對鼻腔沖洗劑、咽喉拭子樣本、氣道穿刺 吸引分泌物、支氣管灌洗液或肺部組織進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)后第2-5天時通過血細胞吸附試 驗對培養(yǎng)病毒進行檢測，并且一般情況下之后均會采用型特異性抗體進行免疫熒光試驗 (IFA)以繼續(xù)檢測。床邊檢測需要的是能夠在短時間（例如，少于30分鐘）內即得出檢測 結果的測試方法，盡管上述檢測具有可靠性，但并不適于作為床邊檢測的方法。
[0004] 因此，人們開發(fā)出了效率更高的流感病毒檢測方式以滿足床邊快速檢測的需要。 這類檢測可分為兩種類型。一種是采用特異性抗體對流感蛋白質或抗原進行的檢測，另一 種是對甲型與乙型流感病毒中存在的神經(jīng)氨酸酶的活性進行的檢測。盡管此類檢測通?？?以在短時間內完成，但其臨床靈敏性仍然不足，僅大致相當于傳統(tǒng)病毒培養(yǎng)法的70%。上 述快速檢測法臨床靈敏性的不足是由于分析靈敏度（或檢測極限）偏低所導致，因為其檢 測限的范圍通常僅為1〇 4和10 5CEID50 (雞胚半數(shù)感染量）或TCID50 (半數(shù)組織培養(yǎng)物感染 量）流感病毒單位。靈敏度的不足嚴重地削弱了上述檢測法的臨床應用。
[0005] 近來，有些論文中公開了一些采用PCR檢測流感病毒核酸且具有更高的靈敏度的 檢測法。盡管這些方法有著更高的靈敏度，但其普遍具有的一些缺點卻使其也難于適應床 邊快速檢測。例如，這些方法通常都要求進行復雜且耗時較長的制作過程，不僅會增加成 本，而且也增加了檢測過程的用時。另外，這些方法（尤其是所謂的實時PCR檢測法）還要 求使用價格昂貴的儀器，并要求操作人員受過良好的相關訓練，而這些對于大部分床邊檢 測機構，尤其是醫(yī)師辦公室而目是無法負擔的。
[0006] 此外，流感病毒有著極強的抗原變異性，尤其甲型流感病毒是變異最為頻繁的一 個類型，每隔十幾年就會發(fā)生一個抗原性大變異，產(chǎn)生一個新的毒株，這種變化稱作抗原轉 變亦稱抗原的質變；在甲型流感亞型內還會發(fā)生抗原的小變異，其表現(xiàn)形式主要是抗原氨 基酸序列的點突變，稱作抗原漂移亦稱抗原的量變。流感病毒的高變異性增大了人們檢測 流行性感冒的難度，人們無法準確預測即將流行的病毒亞型，也極大地限制現(xiàn)有的針對病 毒核酸或特異性抗體對流感蛋白質或抗原進行檢測的試劑應用。
[0007] 為了制備出對流感病毒檢測具有更高敏感度的試劑，人們合成了一種可用于化學 發(fā)光流感病毒神經(jīng)氨酸酶檢測的底物（《分析生物化學》，2000年；280:291-300)。這種底 物是N-乙酰神經(jīng)氨酸與spiroadamantyl-l，2-金剛燒（下文中簡稱金剛燒）通過唾液酸 的2位而形成的一種共輒結構。神經(jīng)氨酸酶能夠使這種共輒鍵發(fā)生裂解，從而釋放出在堿 性條件下能夠發(fā)生氧化反應以產(chǎn)生化學熒光的金剛烷。因此，這種底物可用于對神經(jīng)氨酸 酶（包括流感病毒神經(jīng)氨酸酶）的活性進行檢測，從而成為一種病原體（如流感病毒）檢 測手段。
[0008] 楊威（乙酰神經(jīng)氨酸衍生物的合成及其在快速檢測流感病毒中的應用）公開了一 種流感病毒神經(jīng)氨酸酶檢測的底物及檢測方法。所述的檢測的底物為：熒光素-N-乙酰神 經(jīng)氨酸和熒光素-4, 7-二甲基-N-乙酰神經(jīng)氨酸。采用的檢測方法為：首先通過神經(jīng)氨酸 酶反應釋放底物中的熒光素，然后熒光素在熒光素酶的催化下進行化學發(fā)光反應，通過檢 測熒光素的發(fā)光信號來檢測流感病毒神經(jīng)氨酸酶。因為神經(jīng)氨酸酶反應所需的pH值（流 感病毒為pH6. 5,細菌為pH5.0)與化學發(fā)光反應中熒光素酶所需的pH值（pH8.0)之間 有著顯著差別，所以上述方法中神經(jīng)氨酸酶反應和化學發(fā)光反應必須分別進行，而這增加 了這種檢測的復雜性和成本，降低時效性。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于，為了解決現(xiàn)有技術中檢測流感病毒的神經(jīng)氨酸酶中的兩步反 應步驟相對繁瑣、耗時、不滿足及時性的問題，提供一種流感病毒的神經(jīng)酰胺酶活性一步反 應、實時檢測的試劑盒，用于快速、實時檢測流感病毒。
[0010] 同時本發(fā)明的目的還在于，提供一種流感病毒的神經(jīng)酰胺酶活性一步反應、實時 檢測的檢測方法。
[0011] 為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：
[0012] 一種流感病毒實時檢測試劑盒，包括檢測組合物，所述檢測組合物pH值為 7. 0-7. 2,組成包括以下：
[0013] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 0·l_80mM;
[0014] BSA0.l-10mg/mL；
[0015] ATP-鈉鹽 0·l_20mM;
[0016] DTT0.l-40mM；
[0017] 輔酶A0.1-20mM;
[0018] MgS04 0.l-40mM；
[0019] CaCl2 0.l-20mM；
[0020] 甘露醇 3-9% ;
[0021] 蔗糖 2-8% ;
[0022] N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽2-200μg/mL;
[0023] 螢火蟲熒光素酶10-1000μg/ml;
[0024] 所述N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物結構式如式⑴所示，
[0025]
[0026] 其中，RpR2、R3各自為氫或1-5個碳原子的烷基。
[0027] 上述流感病毒實時檢測試劑盒，優(yōu)選的，所述檢測組合物，組成包括以下：
[0028] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 60mM;
[0029] BSA4mg/mL；
[0030] ATP-鈉鹽 18mM;
[0031] DTT16mM；
[0032] 輔酶A8mM;
[0033] MgS04 35mM；
[0034] CaCl2lOmM；
[0035] 甘露醇6% ;
[0036] 蔗糖 4% ;
[0037] N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽24μg/mL;
[0038] 螢火蟲熒光素酶7-9μg/ml。
[0039] 上述流感病毒實時檢測試劑盒，還包括捕獲劑，所述捕獲劑為：濃度為4_6mg/mL 的待檢測流感病毒的特異性抗體溶液，所述溶液為〇.lwt%的疊氮化鈉溶液，所述待檢測流 感病毒的特異性抗體附著于磁粉上。
[0040] 上述流感病毒實時檢測試劑盒，還包括流感病毒的裂解緩沖液與清洗緩沖液；所 述清洗緩沖液為0. 005MPBS緩沖液；所述裂解緩沖液為pH7. 0、16mM的Trizma堿，含有 0. 5%的曲拉通X-100。
[0041] 一種流感病毒實時檢測試方法，包括：將流感病毒與檢測組合物在pH值為 7. 0-7. 2的環(huán)境下結合，然后檢測是否有螢火蟲熒光素信號；所述檢測組合物包括螢火蟲 熒光素酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽；
[0042] 所述N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物如式⑴所述，其中，&、R2、R3各自 為氫或1-5個碳原子的烷基。
[0043] 上述流感病毒實時檢測試方法，所述檢測組合物的組成包括：
[0044] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 0·l_80mM;
[0045] BSA0. 1-lOmg/mL；
[0046] ATP-鈉鹽 0·l_20mM;
[0047] DTT0.l-40mM；
[0048] 輔酶A0·l_20mM ;
[0049] MgS04 0.l-40mM ；
[0050] CaCl2 0·l_20mM ;
[0051] 甘露醇 3-9% ;
[0052] 蔗糖 2-8% ;
[0053] N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽2-200μg/mL;
[0054] 螢火蟲焚光素酶10-1000μg/ml。
[0055] 上述流感病毒實時檢測試方法，所述檢測組合物，組成包括以下：
[0056] Trizma喊，pH7. 0-7. 2 60mM;
[0057] BSA4mg/mL；
[0058] ATP-鈉鹽 18mM;
[0059] DTT16mM；
[0060] 輔酶A8mM;
[0061] MgS04 35mM；
[0062] CaCl2lOmM；
[0063] 甘露醇6% ;
[0064] 蔗糖 4% ;
[0065] N-乙酰神經(jīng)氨酸-螢火蟲熒光素輒合物或其鹽24μg/mL;
[0066] 螢火蟲焚光素酶7-9μg/ml。
[0067] 上述流感病毒實時檢測試方法，檢測組合物使用前于2_8°C下靜置2-8小時。
[0068] 上述流感病毒實時檢測試方法，還包括：將流感病毒用捕獲劑捕獲，然后與檢測組 合物結合，所述捕獲劑為：濃度為4-6mg/mL的待檢測流感病毒的特異性抗體溶液，所述溶 液為0.lwt%的疊氮化鈉溶液，所述待檢測流感病毒的特異性抗體附著于磁粉上。
[0069] 上述流感病毒實時檢測試方法，還包