一種鑒定光慈菇的方法及其專用引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定光慈菇的方法及其專用引物對。
【背景技術(shù)】
[0002] 光慈燕（BulbusTulipae)為百合科（Liliaceae)植物老鴉瓣（Amanaedulis) 除去膜質(zhì)皮及絨毛后的干燥鱗莖，具有解毒散結(jié)、行血化瘀的功效，主治咽喉腫痛、瘰疬、癰 疽、瘡腫和產(chǎn)后瘀滯等。近年來研究表明，光慈菇對于乳腺疾病的治療具有顯著的效果，因 此導(dǎo)致光慈菇需求量的增加。但光慈菇主要來源于野生，其野生資源逐步匱乏，導(dǎo)致了偽品 的出現(xiàn)與混用，妨礙了臨床用藥的準(zhǔn)確性。為了保證臨床用藥的安全性和有效性，需要對光 慈菇及偽品進行鑒別。
[0003] 光慈菇及其混淆品主要依據(jù)外部形態(tài)、顯微特征、薄層色譜法、紫外光譜吸收特征 和液相色譜等方法進行鑒別。這些方法中有的分辨率不高，有的方法復(fù)雜費時，不利于推 廣，因此迫切需要建立快捷、簡便的鑒定光慈菇的方法，以保障光慈菇臨床用藥的安全。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題如何快速、簡便的鑒定光慈菇。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對，可由引物L(fēng)YB-CP20S和引物 LYB-CP20a組成，各條引物均為單鏈DNA分子，核苷酸序列依次為序列表中的序列1和序列 2〇
[0007] 上述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對中，所述引物L(fēng)YB-CP20S和引物 LYB-CP20a的摩爾比可為1:1。
[0008] 上述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對的應(yīng)用，為如下al)_al2)中任一種：
[0009] al)制備用于檢測或輔助檢測光慈菇的試劑盒；
[0010] a2)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或候選含有光慈菇；
[0011] a3)制備用于鑒定或輔助鑒定光慈菇的試劑盒；
[0012] a4)鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為或候選為光慈菇；
[0013] a5)制備用于鑒定或輔助鑒定市售光慈菇的真?zhèn)涡缘脑噭┖校?br>[0014] a6)鑒定或輔助鑒定市售光慈菇的真?zhèn)涡裕?br>[0015] a7)制備用于檢測或輔助檢測老鴉瓣的試劑盒；
[0016] a8)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或候選含有老鴉瓣；
[0017] a9)制備用于鑒定或輔助鑒定老鴉瓣的試劑盒；
[0018] alO)鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為或候選為老鴉瓣；
[0019] all)制備用于鑒定或輔助鑒定市售老鴉瓣的真?zhèn)涡缘脑噭┖校?br>[0020] al2)鑒定或輔助鑒定市售老鴉瓣的真?zhèn)涡浴?br>[0021] 本發(fā)明還提供了用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于鑒定光 慈菇或老鴉瓣的試劑盒含有上述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對。
[0022] 本發(fā)明還保護上述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的試劑盒的制備方法，可包括將上述 用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對的各引物分別單獨包裝的步驟。
[0023] 上述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的試劑盒的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述用 于鑒定光慈菇或老鴉瓣的試劑盒的應(yīng)用為如下bl)或b2)或b3):
[0024] bl)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或候選含有光慈菇或老鴉瓣；
[0025] b2)鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為或候選為光慈菇或老鴉瓣；
[0026] b3)鑒定或輔助鑒定市售光慈菇或老鴉瓣的真?zhèn)涡浴?br>[0027] 本發(fā)明還提供了一種檢測待測樣品是否含有或候選含有光慈菇的方法，可包括如 下步驟：提取待測樣品的總DNA，采用上述任一所述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對進 行PCR擴增，如果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增，則所述待測樣品中含有或候選含有光慈菇；如果不能 實現(xiàn)有效擴增，則所述待測樣品中不含有或候選不含有光慈菇。所述待測樣品可為中藥材， 或，所述中藥材的基源植物，或，取自所述中藥材的基源植物的組織或器官。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種鑒定待測樣品是否為或候選為光慈菇的方法，可包括如下步 驟：提取待測樣品的基因組DNA，采用上述任一所述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對進 行PCR擴增，如果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增，則所述待測樣品為或候選為光慈菇；如果不能實現(xiàn)有 效擴增，則所述待測樣品不為或候選不為光慈菇。所述待測樣品可為中藥材，或，所述中藥 材的基源植物，或，取自所述中藥材的基源植物的組織或器官。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種鑒定市售光慈菇的真?zhèn)涡缘姆椒?，可包括如下步驟：提取市 售光慈菇的基因組DNA，采用上述任一所述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對進行PCR擴 增，如果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增，則所述市售光慈菇為或候選為真品；如果不能實現(xiàn)有效擴增， 則所述市售光慈菇為或候選為偽品。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種鑒定市售老鴉瓣的真?zhèn)涡缘姆椒?，可包括如下步驟：提取市 售老鴉瓣的基因組DNA，采用上述任一所述用于鑒定光慈菇或老鴉瓣的引物對進行PCR擴 增，如果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增，則所述市售老鴉瓣為或候選為真品；如果不能實現(xiàn)有效擴增， 則所述市售老鴉瓣為或候選為偽品。
[0031] 上述任一所述方法中，所述"能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增"可為所述PCR擴增產(chǎn)物中含有 400-500bp的DNA片段。
[0032] 上述任一所述方法中，所述"不能實現(xiàn)有效擴增"可為所述PCR擴增產(chǎn)物中不含有 400-500bp的DNA片段。
[0033] 所述400-500bp的DNA片段可為432bp的DNA片段。
[0034] 所述432bp的DNA片段具體可為序列表中序列3所示的DNA片段。
[0035] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的退火溫度具體可為55 °C。
[0036] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的擴增程序具體可為95°C5min; 95。〇3〇8,551€3〇8,25個循環(huán)；72。(：1〇11^11。
[0037] 所述中藥材可為光慈菇和/或毛慈菇和/或冰球子和/或金果欖。
[0038] 所述中藥材的基源植物可為老鴉瓣（Amanaedulis)、杜鵲蘭（Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)、獨蒜蘭（Pleionebulbocodioides)或云南獨蒜蘭 (Pleioneyunnanensis)〇
[0039] 利用本發(fā)明提供的鑒定光慈菇的方法及其專用引物對能夠快捷而簡便的鑒定光 慈菇，以保障光慈菇臨床用藥的安全，具有重大的推廣前景和應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0040] 圖1為光慈菇及混淆品的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0041 ] 圖2為通用引物對PCR擴增凝膠電泳圖。
[0042] 圖3為特異性PCR引物對的特異性檢測。
[0043] 圖4為特異性PCR引物對的靈敏度檢測。
【具體實施方式】
[0044] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0045] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047] 以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0048] 本實施例中的光慈燕（基源植物為老鴉瓣（Amanaedulis))購自安徽全椒縣，毛 慈燕（基源植物為杜鵲蘭（Cremastraappendiculata(D.Don)Makino))、冰球子（基源植物 為獨蒜蘭（Pleionebulbocodioides)或云南獨蒜蘭（Pleioneyunnanensis))和金果欖均 購自于安徽亳州藥材市場。各中藥材均符合中國藥典（2010年版）一部正文各藥材項下的 有關(guān)規(guī)定，通過鑒定，各位中藥材實物與名稱相符，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0049] 實施例1、制備用于鑒定光慈菇的試劑盒及其使用方法
[0050] -、用于鑒定光慈菇的引物對的設(shè)計與合成
[0051] 從GenBank查找光慈菇（基源植物為老鴉瓣（Amanaedulis))及混淆品的ITS序 列，詳見表1。
[0052] 表1.光慈菇及混淆品的ITS序列數(shù)量及GenBank登錄號
[0053]
[0054]分別用貝葉斯法（Bayesianinference,BI)和簡約法（maximumparsimony,MP) 進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建BI和MP兩種系統(tǒng)樹（以水寥（Polygonumhydropiper)的2條 ITS序列（GenBank登錄號為JF977851和JF977850)為外群，內(nèi)群則包括表1中所示的 光慈菇及混淆品的ITS序列）。其中BI樹用MrBayesversion3. 1. 2軟件構(gòu)建，MP樹用 PAUP*version4.Obeta10 軟件構(gòu)建。構(gòu)建BI樹時，用MrModeltestversion2. 3 軟件根 據(jù)AIC(AkaikeInformationCriterion)檢驗標(biāo)準(zhǔn)選擇數(shù)據(jù)的最適模型，所選最適模型是 (GTR+G)。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（MarkovChainsMonteCarlo,MCMC)設(shè)置為四條鏈 并運行1000000代。為了確定其收斂情況，MCMC分別運行兩次。每100代抽取一個樣本， 共形成20002個樣本。經(jīng)過分析得知，整個運行在20000代后達到平穩(wěn)，這樣，總共剩余的 樣本數(shù)為19602,用剩余樣本重建系統(tǒng)樹并估計其后驗概率值。構(gòu)建MP樹時，設(shè)置自舉重復(fù) 次數(shù)bootstrapnreps為1000次，使用啟發(fā)式搜索分析自舉重復(fù)數(shù)據(jù)集，啟發(fā)式搜索設(shè)置 為由隨機逐步添加法產(chǎn)生起始樹，重復(fù)10次，采用TBR分支交換。
[0055] 通過BI法和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹完全一致（圖 1)。圖1中各譜系分支的節(jié)點處標(biāo)有BI樹的后驗概率（posteriorprobability，PP)值和 MP樹的自舉支持度（Bootstrap，BS)。結(jié)果表明，光慈菇所有序列的單倍型形成單系（PP= 1. 00,BS= 90)。
[0056] 在確定光慈菇為單系群的前提下，用軟件Clustal X 1.81對所有ITS序列進行對 位排序和比較，找到差異片段，根據(jù)光慈菇特有的變異位點設(shè)計并合成用于光慈菇鑒定的 大量PCR引物對。
[0057] 對獲得的大量PCR引物對依次進行篩選、效果驗證、特異性驗證和靈敏度驗證，最 終獲得一對特異性、靈敏度最佳的引物對如下：
[0058] 引物L(fēng)YB-CP20s:5' -GAGAAGTCGTAACAAGGITTCCGTAG-3'（序列表中序列 1);
[0059] 引物L(fēng)YB-CP20a:5' -AGGCAGGCGTGCCCGCA-3'（序列表中序列 2)。
[0060] 引物L(fēng)YB-CP20s和引物L(fēng)YB-CP20a均為單鏈DNA分子。
[0061] 理論PCR擴增產(chǎn)物的長度為432bp。
[0062] 二、制備用于鑒定光慈菇的試劑盒
[0063] 用于鑒定光慈菇的試劑盒為將步驟一合成的引物L(fēng)YB-CP20S和引物L(fēng)YB_CP20a分 別單獨包裝后，與分別單獨包裝的10XPCRBuffer、TaqDNApolymerase、MgCl2(25mM)和 dNTPs等包裝于同一個試劑盒中。
[0064] 三、鑒定待測樣品中是否含有光慈菇的方法的建立
[0065] 采用步驟二的試劑盒鑒定待測樣品中是否含有光慈菇，步驟如下：
[0066] 1、PCR擴增
[0067] 提取待測樣品的基因組DNA并以其作為模板，采用步驟二的試劑盒進行PCR擴增 反應(yīng)，獲得PCR擴增產(chǎn)物。
[0068] 反應(yīng)體系：待測樣品的基因組DNA(6 - 50)ng、10XPCRB