一種h7n9亞型禽流感病毒檢測試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種分型檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的 RT-PCR-ELISA試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲型流感病毒分類上屬于正粘病毒科，基因組由8個單鏈負義RNA節(jié)段組成。甲型 流感病毒宿主較廣，可W感染人、禽和其它哺乳動物。根據(jù)病毒表面2個糖蛋白血凝素化A) 和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性，甲型流感病毒可W分為不同的血清亞型。目前已在甲型流感 病毒的自然儲存宿主野生水禽中發(fā)現(xiàn)16種HA亞型化1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)。一般情況 下，禽流感病毒不會突破種屬障礙感染人。但自1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件W 來，禽流感病毒(包括H5、朋和H7亞型)感染人事件的發(fā)生越來越頻繁。2013年初，在我國長 S角地區(qū)出現(xiàn)一種新的通過基因重配產(chǎn)生的H7N9亞型禽流感病毒，該病毒能夠跨物種感染 人并引起嚴重疾病。目前中國大陸的省份和地區(qū)都有病例報道，截止，對人類健康和公共衛(wèi) 生造成新的重大威脅。
[0003] 目前針對H7N9亞型禽流感病毒感染的核酸檢測方法主要有基因測序法、Realtime t ime PCR 法和環(huán)等溫擴增化 AMP) 法等 ?；?測序法是分子診斷的 金標(biāo)準 ，但耗時費 力，一般需要24-48小時，對實驗人員的技術(shù)要求高，同時試驗儀器和試劑昂貴，一般實驗室 難W開展。Real-time time PCR法和LAMP法具有很好的特異性和敏感性，但前者同樣依賴 昂貴的儀器和試劑;而后者難W實現(xiàn)多重檢測。因此，建立一種成本低、通量高、適合現(xiàn)場診 斷的H7N9亞型核酸分子檢測方法，對于疾病的臨床救治和防控意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的問題是提供一種分型檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的多重 PCR-ELISA試劑盒及其使用方法。
[0005] 本發(fā)明提供的檢測H7N9亞型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA的試劑盒由RT-PCR 反應(yīng)體系；3個祀基因甲型流感病毒M基因、H7N9亞型病毒HA基因和H7N9亞型病毒N9基因的 陽性質(zhì)粒:pMD-M、^d-HT和化d-N9;陰性質(zhì)控品和3個祀基因的特異性引物探針(表1)組成， 探針的5端用生物素 (BI CtO)標(biāo)記。
[0006] 表1祀基因的特異性引物探針
[000引本發(fā)明所述一種多重PCR-ELISA試劑盒在H7N9亞型禽流感病毒分型檢測中的使用 方法：
[0009] (1)病毒核酸提取:采用常規(guī)方法提取臨床鼻咽拭子標(biāo)本或病毒培養(yǎng)物核酸，-70 °(：冰箱放置備用。
[0010] (2)多重PRT-PCR反應(yīng):采用化KaRa公司的一步法試劑盒進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體 系為：10XExTaqBuffer化L，25mMMgCl?^L，2.5mMdNTPs化L，l'aqDNA聚合酶抓，M、H7 和N9上下游引物各0.7扣L，模板1.化L，加 DEPC水至50化.。擴增程序為：50°C逆轉(zhuǎn)錄30min， 94預(yù)變性2min，熱循環(huán)參數(shù)為94°C變性30s，56 °C退火30s，72°C延伸90s，35個循環(huán)后，72°C 延伸7min，得到生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，同時設(shè)置空白對照組。
[0011] (3化LISA檢測：取擴增好的生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物扣L，加至10化的O.lmol/L NaOH 溶液中，于室溫下變性lOmin，再加入lOnmol/L地高辛標(biāo)記的特異性探針(用含有300mmol/L 化Cl，100mmol/L IYis-HCl P冊.5，10mmol/L 邸TA，0.1%Twee-20的雜交液稀釋），50°C解 育lOmin。隨后，取100化液體加至鏈霉親和素包被的96孔微板中，50°C解育60min，棄去孔中 液體，加入30化L PBST洗板5次。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體10化L，37°C 解育60min，洗板5次，最后加入TMB顯色液進行顯色，一定時間后加入終止液終止顯色，于酶 標(biāo)儀450nm波長處測定其吸光度值(OD)。本實驗需設(shè)置兩個或兩個W上重復(fù)，同時WPCR擴 增反應(yīng)中的空白對照作為陰性對照組，若實驗組的OD值〉2倍陰性對照組平均OD值，則判定 為陽性，反之則為陰性。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：。
[0013] 設(shè)計針對H7N9流感病毒3個祀基因的特異性引物探針，通過PCR-化ISA方法，可W 對臨床、環(huán)境及動物標(biāo)本和病毒分離物進行H7N9亞型流感病毒分型鑒定，具有快速、敏感、 特異等特點;且無需昂貴儀器設(shè)備，便于操作，為H7N9亞型流感監(jiān)測和臨床救治提供一種新 的檢測方法，是一種成本低、通量高、適合現(xiàn)場診斷的H7N9亞型核酸分子檢測方法。
【附圖說明】
[0014] 圖1通過M、H7、N9質(zhì)粒比較普通PCR和PCR-ELISA的敏感性
【具體實施方式】
[0015] 下面提供具體實施例進一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于 實施例。
[0016] 實施例1:祀基因質(zhì)粒構(gòu)建
[0017] 設(shè)計特異性引物，分別針對甲型流感病毒M基因、H7亞型病毒HA基因和N9亞型病毒 NA基因，通過RT-PCR法擴增獲得3個目的基因片段，回收純化后的分別與T載體連接，獲得祀 基因陽性質(zhì)粒，分別命名為pMD-M、^d-HT和化d-N9。
[001引實施例2: PCR-ELISA法敏感性
[0019] (I)PCR反應(yīng):分別將祀基因克隆質(zhì)粒pMD-MJmd-H7和Pmd-N9稀釋100倍，再按10倍 梯度稀釋成1〇-2-1〇-9共八個濃度，W此為模板，使用上述由生物素標(biāo)記的引物，采用化KaRa 公司的一步法試劑盒進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，熱循環(huán)參數(shù)是94°C 變性30s，56 °C退火30s，72°C延伸90s，35個循環(huán)后，72 °C延伸7min，得到地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn) 物，同時設(shè)置空白對照組。將所得到的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別通過ELISA、1.5%瓊脂糖 凝膠電泳兩種方法來確定各自的敏感性。
[0020] (2化LISA檢測：取擴增好的生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物扣L，加至10化的O.lmol/L NaOH 溶液中，于室溫下變性lOmin，再加入lOnmol/L地高辛標(biāo)記的特異性探針(用含有300mmol/L 化Cl，100mmol/L IYis-HCl P冊.5，10mmol/L 邸TA，0.1%Twee-20的雜交液稀釋），50°C解 育lOmin。隨后，取100化液體加至鏈霉親和素包被的96孔微板中，50°C解育60min，棄去孔中 液體，加入30化L PBST洗板5次。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體10化L，37°C 解育60min，洗板5次，最后加入TMB顯色液進行顯色，3min后加入終止液終止顯色，于酶標(biāo)儀 450nm波長處測定其吸光度值(OD)。本實驗需設(shè)置兩個或兩個W上重復(fù)，同時WPCR擴增反 應(yīng)中的空白對照作為陰性對照組，若實驗組的OD值〉2倍陰性對照組平均OD值，則判定為陽 性，反之則為陰性。