專利名稱：:一種流感病毒的培養(yǎng)方法一種流感病毒的培養(yǎng)方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種流感病毒的培養(yǎng)方法，具體涉及一種用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)流感病毒的方法，屬于流感病毒疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前，包括高致病性禽流感病毒在內(nèi)，流感疫苗的生產(chǎn)還主要靠雞胚培養(yǎng)技術(shù)，學(xué)者們一直在探討用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗，但一直沒(méi)有找到合適的細(xì)胞。某些細(xì)胞能夠用于疫苗生產(chǎn)，如中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)C歸53172，公開(kāi)日2005.08.10，名稱為"用于病毒培養(yǎng)的棉鼠肺細(xì)胞"的發(fā)明專利公開(kāi)了棉鼠細(xì)胞系，棉鼠細(xì)胞用于生長(zhǎng)、繁殖、或培養(yǎng)生物體、病原體或病毒諸如PRRSV以及由此產(chǎn)生的生物體、病原體或病毒的用途。但是其卻不能用于流感病毒的培養(yǎng)。到目前為止，人們僅發(fā)現(xiàn)了原代猴腎細(xì)胞(PMK)和細(xì)胞系MDCK、Vero、A549、HEK等少數(shù)幾種細(xì)胞能夠用于培養(yǎng)流感病毒。H1N1型等低致病性流感病毒更是只能首選在MDCK細(xì)胞系上培養(yǎng)。但是，這些細(xì)胞或細(xì)胞系，有的如猴腎原代細(xì)胞獲取代價(jià)太高，有的如細(xì)胞系可能有癌變性質(zhì)，不適合用于疫苗尤其是人用疫苗的生產(chǎn)。即便這些細(xì)胞或細(xì)胞系能夠用于疫苗生產(chǎn)，其培養(yǎng)所得的流感病毒毒價(jià)往往較低，通過(guò)直接血凝法測(cè)定，一般只能達(dá)到25左右，尚不足以達(dá)到生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)疫苗的毒價(jià)水平。另外，流感病毒尤其是H1N1等型流感病毒，在進(jìn)行培養(yǎng)前必須進(jìn)行預(yù)處理，目前預(yù)處理的方法主要是將病毒溶解于含有胰蛋白酶的溶液中再接種。添加胰蛋白酶等酶類制劑對(duì)雞胚培養(yǎng)流感病毒的繼續(xù)生長(zhǎng)可能沒(méi)有影響，但在用細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒，尤其是用貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒時(shí)，其流感病毒的凝血效價(jià)始終不高。因此尋找高效、低成本、安全的培養(yǎng)流感病毒用細(xì)胞源以及與其配套的培養(yǎng)技術(shù)成為目前流感疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域中主攻方向之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是尋找更高效、更適用于流感疫苗生產(chǎn)的，流感病毒培養(yǎng)用新細(xì)胞源及其培養(yǎng)技術(shù)，提出了一種更高效價(jià)，無(wú)癌變危險(xiǎn)的流感病毒培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的一種流感病毒的培養(yǎng)方法，即用山羊胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)作為流感病毒培養(yǎng)的細(xì)胞源，具體操作步驟如下-A、選取懷孕2月齡以上的母山羊，在無(wú)菌條件下采用剖腹手術(shù)將羊胎兒連同胎膜一起取出，剝離胎膜，取出羊胎兒放入盛有無(wú)菌PBS溶液的培養(yǎng)皿中，洗滌2—3次，用手術(shù)器械剖開(kāi)羊胎兒腹腔，取出腎臟，按照組織細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，將羊胎兒腎組織制備培養(yǎng)成原代細(xì)胞；B、對(duì)采用雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理；C、將預(yù)處理后的流感病毒接種于由羊胎兒腎組織培養(yǎng)成的原代細(xì)胞中，先按每個(gè)細(xì)胞瓶培養(yǎng)流感病毒所需培養(yǎng)基總量的1/4加入經(jīng)預(yù)處理后的病毒液，37'C下，培養(yǎng)2-3小時(shí)后補(bǔ)足培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并在1500-2000轉(zhuǎn)/分下離心10-20分鐘取上清，得到含流感病毒的上清液。本發(fā)明所述步驟B中采用細(xì)胞凍融提取物對(duì)雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理，所述細(xì)胞凍融提取物是動(dòng)物成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞的凍融提取物，其制備和預(yù)處理方法如下A.細(xì)胞凍融物的制備無(wú)菌環(huán)境下，將培養(yǎng)好的動(dòng)物成纖維細(xì)胞或小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞除去培養(yǎng)液，經(jīng)兩次凍融，讓細(xì)胞充分破裂，成為細(xì)胞凍融碎片，培養(yǎng)瓶中按照每個(gè)100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打細(xì)胞培養(yǎng)面，將細(xì)胞凍融碎片吹入溶液中，將溶液吸入離心管內(nèi)，經(jīng)2500-3000轉(zhuǎn)/分離心，取上清，經(jīng)0.22微米過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，即成細(xì)胞凍融提取物；B.流感病毒的預(yù)處理先將準(zhǔn)備接種的雞胚培養(yǎng)的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接種細(xì)胞所需濃度的病毒液，然后將該病毒液與上述凍融提取物按l:l比例混合，靜置5-IO分鐘，再進(jìn)行接種。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)1、用直接血凝法測(cè)定本發(fā)明技術(shù)所培養(yǎng)的H1N1型流感病毒，其毒價(jià)可達(dá)到28以上，山羊胎兒腎原代細(xì)胞傳代到第七代后依然可以用于流感病毒培養(yǎng)，此時(shí)培養(yǎng)的H1N1型流感病毒的毒價(jià)也可以達(dá)到26以上。用原代細(xì)胞培養(yǎng)的流感病毒，其毒價(jià)顯著高于用現(xiàn)行技術(shù)培養(yǎng)的流感病毒。2、所用細(xì)胞為原代細(xì)胞，用于疫苗生產(chǎn)不存在癌變物質(zhì)危險(xiǎn)性。43、所用細(xì)胞來(lái)源較廣，獲取成本較低，與一般的山羊屠宰加工企業(yè)聯(lián)系即可。4、流感病毒的預(yù)處理不用胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶對(duì)產(chǎn)毒細(xì)胞的影響。圖1是本發(fā)明中未接種H1N1型流感病毒時(shí)山羊胎兒腎細(xì)胞的顯微圖片；圖2是本發(fā)明接種H1N1型流感病毒24小時(shí)后山羊胎兒腎細(xì)胞的顯微圖片；圖3是本發(fā)明接種H1N1型流感病毒病變后山羊胎兒腎細(xì)胞的顯微圖片；具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述一種流感病毒的培養(yǎng)方法，即用山羊胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)作為流感病毒培養(yǎng)的細(xì)胞源，具體操作步驟如下A、選取懷孕2月齡以上的母山羊，在無(wú)菌條件下采用剖腹手術(shù)將羊胎兒連同胎膜一起取出，剝離胎膜，取出羊胎兒放入盛有無(wú)菌PBS溶液的培養(yǎng)皿中，洗滌2—3次，用手術(shù)器械剖開(kāi)羊胎兒腹腔，取出腎臟，按照組織細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，將羊胎兒腎組織制備培養(yǎng)成原代細(xì)胞；B、對(duì)采用雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理；C、將預(yù)處理后的流感病毒接種于由羊胎兒腎組織培養(yǎng)成的原代細(xì)胞中，先按每個(gè)細(xì)胞瓶培養(yǎng)流感病毒所需培養(yǎng)基總量的1/4加入經(jīng)預(yù)處理后的病毒液，37'C下，培養(yǎng)2-3小時(shí)后補(bǔ)足培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并在1500-2000轉(zhuǎn)/分下離心10-20分鐘取上清，得到含流感病毒的上清液。本發(fā)明所述步驟B中采用細(xì)胞凍融提取物對(duì)雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理，所述細(xì)胞凍融提取物是動(dòng)物成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞的凍融提取物，其制備和預(yù)處理方法如下A.細(xì)胞凍融物的制備無(wú)菌環(huán)境下，將培養(yǎng)好的動(dòng)物成纖維細(xì)胞或小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞除去培養(yǎng)液，經(jīng)兩次凍融，讓細(xì)胞充分破裂，成為細(xì)胞凍融碎片，培養(yǎng)瓶中按照每個(gè)100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打細(xì)胞培養(yǎng)面，將細(xì)胞凍融碎片吹入溶液中，將溶液吸入離心管內(nèi)，經(jīng)2500-3000轉(zhuǎn)/分離心，取上清，經(jīng)0.22微米過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，即成細(xì)胞凍融提取物B.流感病毒的預(yù)處理先將準(zhǔn)備接種的雞胚培養(yǎng)的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接種細(xì)胞所需濃度的病毒液，然后將該病毒液與上述凍融提取物按l:l比例混合，靜置5-10分鐘，再進(jìn)行接種。按本發(fā)明方法培養(yǎng)H1N1型流感病毒并與MDCK細(xì)胞作對(duì)比試驗(yàn)，其結(jié)果如下1.MDCK和山羊胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)H1N1型流感病毒后其培養(yǎng)液的血凝效價(jià)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表一<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.參見(jiàn)圖1、圖2、圖3，山羊胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)H1N1型流感病毒的病變過(guò)程，從上述照片中看出當(dāng)H1N1型流感病毒接種于山羊胎兒腎細(xì)胞(GH)細(xì)胞上。24小時(shí)后幾乎全部的易感細(xì)胞都出現(xiàn)病變，即腫脹變大、空泡樣變化，并大量崩解成碎片脫落，脫落部分無(wú)細(xì)胞形態(tài)。其中的非易感細(xì)胞則繼續(xù)生長(zhǎng)并且可以繼續(xù)傳代。這與MDCK細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樣病變差別明顯。3.將在100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48小時(shí)、且已長(zhǎng)滿瓶的上皮養(yǎng)分化細(xì)胞，棄去上清，-30'C下凍融2次，每瓶加2mlPBS反復(fù)吹打，離心取上清，0.22um過(guò)濾，凍存?zhèn)溆?。進(jìn)行細(xì)胞凍融物及胰蛋白酶對(duì)流感病毒培養(yǎng)的對(duì)比試驗(yàn)，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表二表二、預(yù)處理物對(duì)流感病毒培養(yǎng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種流感病毒的培養(yǎng)方法，其特征是用山羊胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)作為流感病毒培養(yǎng)的細(xì)胞源，具體操作步驟如下A、選取懷孕2月齡以上的母山羊，在無(wú)菌條件下采用剖腹手術(shù)將羊胎兒連同胎膜一起取出，剝離胎膜，取出羊胎兒放入盛有無(wú)菌PBS溶液的培養(yǎng)皿中，洗滌2-3次，用手術(shù)器械剖開(kāi)羊胎兒腹腔，取出腎臟，按照組織細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，將羊胎兒腎組織制備培養(yǎng)成原代細(xì)胞；B、對(duì)采用雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理；C、將預(yù)處理后的流感病毒接種于由羊胎兒腎組織培養(yǎng)成的原代細(xì)胞中，先按每個(gè)細(xì)胞瓶培養(yǎng)流感病毒所需培養(yǎng)基總量的1/4加入經(jīng)預(yù)處理后的病毒液，37℃下，培養(yǎng)2-3小時(shí)后補(bǔ)足培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并在1500-2000轉(zhuǎn)/分下離心10-20分鐘取上清，得到含流感病毒的上清液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)流感病毒的新方法，其特征在于所述步驟B中采用細(xì)胞凍融提取物對(duì)雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理，所述細(xì)胞凍融提取物是動(dòng)物成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞的凍融提取物，其制備和預(yù)處理方法如下A.細(xì)胞凍融物的制備無(wú)菌環(huán)境下，將培養(yǎng)好的動(dòng)物成纖維細(xì)胞或小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞除去培養(yǎng)液，經(jīng)兩次凍融，讓細(xì)胞充分破裂，成為細(xì)胞凍融碎片，培養(yǎng)瓶中按照每個(gè)100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打細(xì)胞培養(yǎng)面，將細(xì)胞凍融碎片吹入溶液中，將溶液吸入離心管內(nèi)，經(jīng)2500-3000轉(zhuǎn)/分離心，取上清，經(jīng)0.22微米過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，即成細(xì)胞凍融提取物；B.流感病毒的預(yù)處理先將準(zhǔn)備接種的雞胚培養(yǎng)的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接種細(xì)胞所需濃度的病毒液，然后將該病毒液與上述凍融提取物按l:l比例混合，靜置5-10分鐘，再進(jìn)行接種。專利摘要一種流感病毒的培養(yǎng)方法，用山羊胎兒腎細(xì)胞培養(yǎng)作為流感病毒培養(yǎng)的細(xì)胞源。采用細(xì)胞凍融提取物對(duì)雞胚培養(yǎng)的流感病毒進(jìn)行預(yù)處理，所述細(xì)胞凍融提取物是動(dòng)物成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞的上皮樣分化細(xì)胞的凍融提取物。本發(fā)明培養(yǎng)的流感病毒其毒價(jià)顯著高于用現(xiàn)行技術(shù)培養(yǎng)的流感病毒。所用細(xì)胞為原代細(xì)胞，用于疫苗生產(chǎn)不存在癌變物質(zhì)危險(xiǎn)性；所用細(xì)胞來(lái)源較廣，獲取成本較低；流感病毒的預(yù)處理不用胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶對(duì)產(chǎn)毒細(xì)胞的影響。文檔編號(hào)C12N7/00GKCN101260385SQ200810047297公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年4月11日發(fā)明者高其雙,黃海軍申請(qǐng)人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan