甲型h1n1流感病毒核酸的定性檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種甲型H1N1流感病毒核酸的定性檢測 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲型H1N1流感病毒是A型流感病毒，攜帶有H1N1亞型豬流感病毒毒株，包含有禽 流感、豬流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬 流感病毒特征。人群對甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人傳染人，人感染甲流后的早 期癥狀與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等，有些還會出 現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等。2009年開始，甲型H1N1流感在全球范圍內(nèi)大規(guī) 模流行。2010年8月，世衛(wèi)組織宣布甲型H1N1流感大流行期已經(jīng)結(jié)束。
[0003] 在此期間，基于PCR原理的核酸檢測方法特別是基于real-timeRT-PCR的方法是 一種快速有效的診斷方法，在突發(fā)傳染病應(yīng)急工作中發(fā)揮了巨大作用。H1N1病毒核酸檢測 原理是利用核酸檢測的方法，直接檢測H1N1病毒的核酸RNA。核酸檢測具有快速、高效、敏 感和特異等優(yōu)點(diǎn)，在感染過程中，患者體內(nèi)首先出現(xiàn)的是病毒RNA，這時可以采用核酸檢測 的方法檢測出來。而傳統(tǒng)的甲型H1N1流感病毒的核酸定性檢測試劑盒通常需要從樣本中 提取純化的核酸分子（H1N1-RNA)，而從樣本中提取核酸的步驟操作復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種不需要從樣本中提取核酸就可以完成檢測的甲型H1N1 流感病毒核酸的定性檢測試劑盒。
[0005] -種甲型H1N1流感病毒核酸的定性檢測試劑盒，包括：
[0006] 樣本處理劑，包括異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌酸鈉、β-巰基乙醇和蛋白酶 Κ；
[0007] 用于靶核苷酸擴(kuò)增的上游引物，所述上游引物包括上游引物InfAForword、上游 引物SWInfAForword和上游引物SWHlForword;
[0008] 用于靶核苷酸擴(kuò)增的下游引物，所述下游引物包括下游引物InfAReverse、下游 引物SWInfAReverse和下游引物SWHIReverse;
[0009] 用于革E核苷酸檢測的Taqman探針，所述Taqman探針包括Taqman探針infAProbe、 Taqman探針SWinfAProbe和Taqman探針SWHIProbe，所述Taqman探針infAProbe的 兩端分別結(jié)合有第一焚光基團(tuán)和第一焚光猝滅劑，所述Taqman探針SWinfAProbe的兩端 分別結(jié)合有第二熒光基團(tuán)和第二熒光猝滅劑，所述Taqman探針SWHIProbe的兩端分別結(jié) 合有第三熒光基團(tuán)和第三熒光猝滅劑；以及
[0010] RNA-步法反應(yīng)緩沖液。
[0011] 在一個實(shí)施例中，所述樣本處理劑用于與檢測樣本混合均勻后在55°C~70°C加 熱 10min~15min〇
[0012] 在一個實(shí)施例中，所述樣本處理劑中，所述異硫氰酸胍的濃度為0. 2mol/L~ 2mol/L，所述梓檬酸鈉的濃度為10mmol/L~30mmol/L，所述十二烷基肌酸鈉的質(zhì)量百分含 量為0.2%~1%，所述β-巰基乙醇的濃度為0.05mol/L~0·lmol/L，所述蛋白酶K的濃 度為lmg/mL~5mg/mL〇
[0013] 在一個實(shí)施例中，所述上游引物InfAForword的序列為SEQIDNo. 1所示的序 列，所述上游引物SWInfAForword的序列為SEQIDNo. 2所示的序列，所述上游引物SW HlForword的序列為SEQIDNo. 3所示的序列；
[0014] 所述下游引物InfAReverse的序列為SEQIDNo. 4所示的序列，所述下游引物SW InfAReverse的序列為SEQIDNo. 5所示的序列，所述下游引物SWHIReverse的序列為 SEQIDNo. 6所示的序列。
[0015] 在一個實(shí)施例中，所述Taqman探針infAProbe的序列為SEQIDNo. 7所示的序 列，所述Taqman探針SWinfAProbe的序列為SEQIDNo. 8所示的序列，所述Taqman探針 SWHIProbe的序列為SEQIDNo. 9所示的序列。
[0016] 在一個實(shí)施例中，所述Taqman探針infAProbe的5'端結(jié)合有FAM，所述Taqman 探針infAProbe的3'端結(jié)合有BHQ1 ;
[0017] 所述Taqman探針SWinfAProbe的 5' 端結(jié)合有FAM，所述Taqman探針SWinfA Probe的3'端結(jié)合有BHQ1 ;
[0018] 所述Taqman探針SWHIProbe的 5'端結(jié)合有FAM，所述Taqman探針SWH1Probe 的3'端結(jié)合有BHQ1。
[0019] 在一個實(shí)施例中，還包括H1N1內(nèi)標(biāo)的RNA轉(zhuǎn)錄物、內(nèi)標(biāo)上游引物RnasePForward、 內(nèi)標(biāo)下游引物RnasePReverse和內(nèi)標(biāo)探針RnasePProbe，所述H1N1內(nèi)標(biāo)的RNA轉(zhuǎn)錄物為 H1N1內(nèi)標(biāo)轉(zhuǎn)錄得到，所述H1N1內(nèi)標(biāo)為非競爭性內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)探針RnasePProbe的兩端分 別結(jié)合有第四熒光基團(tuán)和第四熒光猝滅劑。
[0020] 在一個實(shí)施例中，所述內(nèi)標(biāo)上游引物RnasePForward的序列為SEQIDNo. 10所 示的序列，所述內(nèi)標(biāo)下游引物RnasePReverse的序列為SEQIDNo. 11所示的序列，所述內(nèi) 標(biāo)探針RnasePProbe的序列為SEQIDNo. 12所示的序列，所述內(nèi)標(biāo)探針RnasePProbe的 5'端結(jié)合有HEX，所述內(nèi)標(biāo)探針RnasePProbe的3'端結(jié)合有BHQ1。
[0021] 在一個實(shí)施例中，所述H1N1內(nèi)標(biāo)的序列為SEQIDNo. 13所示的序列。
[0022] 在一個實(shí)施例中，還包括H1N1陽性質(zhì)控品和H1N1陰性質(zhì)控品。
[0023] 這種甲型H1N1流感病毒核酸的定性檢測試劑盒在進(jìn)行檢測時，直接將檢測樣本 與樣本處理劑混合處理后即可用于后續(xù)檢測。相對于傳統(tǒng)的甲型H1N1流感病毒核酸的定 性檢測試劑盒，這種甲型H1N1流感病毒核酸的定性檢測試劑盒省略了從樣本中提取純化 的核酸分子的步驟，從而操作上更為省時、簡單。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實(shí)施例1優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后線性模板的檢測結(jié)果圖；
[0025] 圖2為實(shí)施例1線性模板檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0026] 圖3為實(shí)施例2試劑盒中強(qiáng)陽和臨界陽質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對甲型H1N1流感病毒核酸的定性檢測試劑盒做 進(jìn)一步的解釋說明。
[0028] 一實(shí)施方式的甲型H1N1流感病毒核酸的定性檢測試劑盒，包括：樣本處理劑、用 于靶核苷酸擴(kuò)增的上游引物、用于靶核苷酸擴(kuò)增的下游引物、用于靶核苷酸檢測的Taqman 探針以及RNA-步法反應(yīng)緩沖液。
[0029] 樣本處理劑包括異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌酸鈉、β-巰基乙醇和蛋白酶 Κ〇
[0030]β-巰基乙醇和異硫氰酸胍協(xié)同抑制RNase活性，異硫氰酸胍將RNase變性，暴露 出RNase活性中心的二硫鍵，β-巰基乙醇打開二硫鍵，從而抑制其活性。
[0031] 樣本處理劑用于與檢測樣本混合均勾后在55°C~70°C加熱lOmin~15min;其 中，樣本處理劑與檢測樣本的體積比可以為2~1 :1。
[0032] 具體的，樣本為鼻拭子、咽拭子或分泌物等類型的樣本時，須先用生理鹽水沖洗后 12000rpm離心5min棄除上清后再與樣本處理劑混合。
[0033] 樣本處理劑中，異硫氰酸胍的濃度為0. 2mol/L~2mol/L，檸檬酸鈉的濃度為 10mmol/L~30mmol/L，十二烷基肌酸鈉的質(zhì)量百分含量為0. 2%~1%，β-巰基乙醇的濃 度為0. 05mol/L~0. lmol/L，蛋白酶Κ的濃度為lmg/mL~5mg/mL。
[0034] 上游引物包括上游引物InfA Forword、上游引物SW InfA Forword和上游引物SW HlForword。
[0035] 下游引物包括下游引物InfA Reverse、下游引物SW InfA Reverse和下游引物SW HlReverse。
[0036] Taqman探針包括Taqman探針inf A Probe、Taqman探針SW inf A Probe和Taqman 探針SW HI Probe。
[0037] 本實(shí)施方式中，采用的上游引物、下游引物和Taqman探針均為世界衛(wèi)生組織 (WHO)在其網(wǎng)站上公布的美國疾病預(yù)防控制中心（