專利名稱：：新植物病毒顆粒及其滅活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常涉及植物生產(chǎn)的用作疫苗等的植物病毒。更具體地，本發(fā)明涉及病毒滅活方法以及作為疫苗等的植物病毒顆粒。
背景技術(shù)：
：疫苗接種能保護個體和整個種群免于傳染源的危害。然而，由于從有效抗原的鑒定到對開發(fā)的疫苗的安全性的關(guān)注的大量原因，開發(fā)安全有效的疫苗不總是簡單的。在復合(composite)病毒疫苗領(lǐng)域中已經(jīng)探究了使用病毒做為外源肽載體。這樣的疫苗基于是不同動物病毒組分的雜種的嵌合病毒。通常，這樣的雜種的主要組分衍生自無害或已經(jīng)將其無害化的病毒，且次要組分是選擇的病原性病毒的抗原組分。例如，可將痘病毒如牛痘或減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒用作其它動物病毒包括人類病毒的免疫原組分的載體。然而，上面討論的這樣的技術(shù)有缺點。這樣的疫苗產(chǎn)自培養(yǎng)在其設(shè)計和運行是昂貴的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的病毒。復合病毒方法涉及活的感染動物的病毒的操作，具有突變可能引起具有改變的感染性、抗原性和/或致病性的新型病毒的風險。此外，用作載體的動物病毒能是動物可能已經(jīng)暴露于其且病毒可能已經(jīng)產(chǎn)生針對該載體的抗體的病毒。因此，在第二病毒的混合抗原位點誘導免疫反應前，免疫系統(tǒng)能摧毀5載體。已經(jīng)為哺乳動物病毒滅活使用了大量方法。這些方法包括紫外線照射、紫外線/補骨脂素(psoralen)照射、戊糖化學藥(PentosePharmaceuticalschemicals)、微波、福爾馬林、BPL、pH、溫度和氯化銨孵育。已經(jīng)使用了紫外線照射來滅活重組植物病毒。參見例如，Langeveldda/.(2001)"InactivatedRecombinantPlantVirusProtectsDogsfromaLethalChallengewithCanineParvovirus,"松cc/"e19:3661-3670。涉及產(chǎn)生該顆粒的方法以及該顆粒的用途，特別地用作疫苗的專利包括美國專利No.6，110,466，該專利討論了含有預設(shè)的外源肽作為病毒衣殼蛋白部分的植物病毒的組裝顆粒和美國專利No.6，884，623，該專利討論了在病毒衣殼蛋白中包含外源肽的植物病毒的組裝顆粒，其中插入位點優(yōu)選地游離于位于插入位點兩側(cè)的直接的序列重復。美國專利No.5，602，242涉及用于在異源，優(yōu)選桿狀衣殼的蛋白衣殼內(nèi)的遺傳工程化的病毒序列的衣殼化的重組RNA病毒。該專利也涉及這樣的重組病毒的制造和使用，特別是關(guān)于帶來植物中基因型和表型改變的病毒轉(zhuǎn)染。在AhlquistWa/.(1981)"CompleteNucleotideSequenceofBromeMosaicVirusRNA3，"《/Afo/.153:23-38中公開了刪除或滅活病毒衣殼蛋白基因的方法。Burgeaa/.，"EffectofHeatonVirusInactivationbyAmmonia",五"v/ra".M/m6/o/ow,Aug46(2):446-51，1983討論了熱以及氯化銨對病毒滅活的效果。研究了噬菌體￡2和脊髓灰質(zhì)炎病毒1(包膜的哺乳動物病毒)。發(fā)現(xiàn)高于40。C的溫度損害了本文試驗的病毒。像Burge等人~"樣，CramerWN,da/."Kineticsofvirusinactivationbyammonia",五"v/ra"A^cra6/o/ogy,Mar45(3):760-5,1983為了滅活病毒，使用在一系列pH值范圍內(nèi)的氯化銨處理污水。再一次地，研究了噬菌體G和脊髓灰質(zhì)炎病毒l(CHAT株)。據(jù)報告那些試驗結(jié)果顯示，NH/濃度對脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活率的效果遠低于對f2的滅活率的效果，假如并非如此。本文討論了該方法學在污水處理植物作為氯的可能替代的應用，特別是對于腸道病毒群成員。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括通過給予硫酸銨到大于pH8.0的、選自植物、植物組織、植物細胞或原生質(zhì)體的植物材料，產(chǎn)生滅活病毒樣顆粒(VLP);孵育植物材料至少十個小時；然后從植物材料收獲滅活病毒樣顆粒而生產(chǎn)滅活植物病毒的方法。這些方法能包括外源肽整合到病毒中。該病毒能處于非包膜RNA病毒內(nèi)。滅活VLP能提呈異源生物活性肽。以0.5M至(Jl.OM，通常0.7M濃度給予硫酸銨。pH通常是9.0，且能在室溫下孵育植物材料。因為VLP缺少至少部分存在于植物病毒中的RNA，VLP不具有感染性。此外，在接種時它不啟動感染并且不能復制。本發(fā)明也包括嵌合植物病毒顆粒的滅活以及將滅活歩驟整合到病毒顆粒純化過程。滅活方法提供了不能感染植物的病毒。保留了病毒顆粒的完整性，同時摧毀了存在于病毒顆粒內(nèi)的感染性病毒基因組RNA。這些方法能夠量化，且能整合到純化程序中。本發(fā)明也包括通過給予硫酸銨到pH大于8.0的、選自植物、植物組織、植物細胞或原生質(zhì)體并缺少至少部分存在于植物病毒內(nèi)的RNA的植物材料；孵育植物材料至少十個小時；并從植物材料收獲滅活的不能復制的VLP而產(chǎn)生非感染VLP的方法。此外，本發(fā)明的實施方案也包括疫苗，其中疫苗包括病毒且該病毒包括整合到病毒內(nèi)的外源肽，且通過包含在大于8.0的pH，將硫酸銨加到選自植物、植物組織、植物細胞或原生質(zhì)體的植物材料；孵育植物材料至少十個小時；然后從植物材料收獲滅活的VLP的方法產(chǎn)生疫苗。當將VLP給予到哺乳動物時，提呈的VLP肽能激發(fā)免疫反應。會鵬該疫苗用于流感病毒、東方馬腦炎病毒(eosf簡，/"ee"cep/za/他virus)、犬細小病毒(Cam'"e戸rvov/n/力或炭疽桿菌(Sac/〃wsa"f/zrac/力。此外，該疫苗可以是亞單位疫苗，其中肽是抗原的一部分且該部分是疫苗的有效部分。圖1:顯示了抽提自活的PA10病毒和滅活的PA10病毒的RNA跑1.2%瓊脂糖凝膠，用溴化乙錠染色，說明了活病毒中CPMV基因組RNA1和2以及滅活病毒制備物中的降解的RNA。圖2:顯示了PA7E的AIEC色譜圖。圖3-5:證明了PA9、PA11和PA18的RNA滅活。圖6:顯示了PAIS的5天溫度穩(wěn)定性的SDS-PAGE膠。圖7:顯示了通過ELISA檢測的CPMV-PA免疫的猴子中的抗-PA抗體。圖8:顯示了140天時血清和支氣管灌洗中的抗-PA抗體(IgG)。序列簡要說明SEQIDNO:l是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA1的肽序列。SEQIDNO:2是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA2的肽序列。SEQIDNO:3是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA3的肽序列。SEQIDNO:4是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA3E的肽序列。SEQIDNO:5是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA4的肽序列。SEQIDNO.6是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA5的肽序列。SEQIDNO:7是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA6的肽序列。SEQIDNO:8是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA7的肽序列。SEQIDNO:9是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA7E的肽序列。SEQIDNO:10是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA8的肽序列。SEQIDNO:ll是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA9的肽序列。SEQIDNO.12是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA10的肽序列。SEQIDNO:13是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PAll的肽序列。SEQIDNO:14是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA12的肽序列。SEQIDNO:15是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA13的肽序列。SEQIDNO:16是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA14的肽序列。SEQIDNO:17是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA15的肽序列。SEQIDNO:18是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA16的肽序列。SEQIDNO:19是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA17的肽序列。SEQIDNO:20是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA18的肽序列。SEQIDNO:21是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA19的肽序列。SEQIDNO:22是根據(jù)本發(fā)明實施例3使用的表位PA20的肽序列。SEQIDNO:23是本炭疽菌苗的保護性抗原(PA)的氨基酸序列。SEQIDNO:24是流感病毒表位M2e的氨基酸序列。具體實施例方式以下將結(jié)合附圖和具體實施方案在下文中更完整地描述本發(fā)明。然而，可通過許多不同形式具體化本發(fā)明，但具體實施方案并非構(gòu)成限制本發(fā)明。本發(fā)明部分涉及用于制備用作疫苗等的新的植物病毒樣顆粒的新病毒滅活方法。本文描述了病毒滅活的方法。本發(fā)明提供了滅活嵌合植物病毒顆粒并將滅活步驟整合入病毒顆粒純化程序的實施例。滅活方法提供了不能感染植物的病毒。本發(fā)明的實施方案包括基于衍生自致病體的表位在滅活的植物病毒樣顆粒表面的表位展示產(chǎn)生安全疫苗的方式(means)和方法。本發(fā)明的實施方案包括滅活病毒以產(chǎn)生缺少病毒的完整感染性基因組的病毒樣顆粒(VLPs)的有效和量化的(scalable)程序。這樣的實施方案包括使用硫酸銨緩沖液，通常為pH9時，作為起始抽提緩沖液。管理當局認為硫酸銨無毒且可接受。本發(fā)明的實施方案包括用pH范圍為大約9.0的硫酸銨滅活病毒。病毒滅活能通過RNA斷裂和降解而發(fā)生。病毒顆粒變得可滲透，從而允許銨離子進入病毒。因此，應該在大于8.0的pH值進行用銨離子進行的孵育，因為在這個pH水平病毒發(fā)生膨脹，該膨脹打開了它的結(jié)構(gòu)，從而允許小分子通過病毒衣殼滲入。本發(fā)明也提供缺少典型地隨其相關(guān)的RNA的新RNA病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒包含適當提呈的抗原。本發(fā)明的實施方案包括以無縫方式將顆粒滅活同其它純化操作整合的方法。這些方法包括例子，其中收集并在抽提緩沖液中勻漿植物組織，其中緩沖液是pH9的0.7M硫酸銨并在室溫孵育大約20個小時。孵育后，顆粒不再對植物具有感染性并且不能在接種時引入感染。在pH7.0的相同條件下沒有滅活病毒，而且更高的溫度即4(TC似乎損害了病毒結(jié)構(gòu)。附加的過程步驟和參數(shù)本發(fā)明的實施方案也包括在滅活緩沖液中磨碎/勻漿植物材料，在滅活緩沖液中孵育磨碎的漿體以降解病毒基因組RNA，純化產(chǎn)生的病毒顆粒。可通過在滅活緩沖液中孵育前離心/過濾進一步地澄清磨碎的物質(zhì)。在孵育后，可通過PEG或通過將硫酸銨的摩爾濃度增加到導致顆粒從溶液中沉淀的水平來沉淀顆粒。通常在滅活步驟后進行緩沖液交換和層析步驟?？稍谌魏吸c上將滅活步驟整合入純化程序。例如，在某些程序中，以下述方式將滅活整合入程序中將CPMV在pH7的0.7M(NH4)2S04中結(jié)合到HIC柱子^用pH9的0.7M(NH4)2S04洗滌結(jié)合的CPMV一用pH9的0.7M(NH4》S04洗脫CPMV。可利用下述范圍0.5-1.0M(NH4)2S04、pH值大于8.0及溫度介于10到4(TC間。能用來制備VLPs的病毒的類型和選擇本發(fā)明的疫苗能是抗原形式并融合到非-包膜RNA病毒(+、-和/或雙鏈的)的衣殼蛋白。本發(fā)明的實施方案包括連同二十面體植物RNA病毒的植物RNA病毒。盡管本文例證的是豇豆花葉病毒，也能將本發(fā)明的方法應用到其它類似的病毒。例如，用于根據(jù)本發(fā)明的某些優(yōu)選的病毒是表1名字縮寫屬科豇豆褪綠斑駁病毒CCMV雀麥花葉病毒組雀麥花葉病毒科豇豆花葉病毒CPMV豇豆花葉病毒組豇豆花葉病毒科番茄叢矮病毒TBSV番茄叢矮病毒組番茄叢矮病毒科苜蓿花葉病毒AMV苜?；ㄈ~病毒屬雀麥花葉病毒科雀麥草花葉病毒B雨雀麥花葉病毒組雀麥花葉病毒科南方菜豆花葉病毒SBMV南方菜豆花葉病毒組番茄叢矮病毒科能將本發(fā)明應用到任何RNA植物病毒。為了證明該系統(tǒng)，選擇植物病毒豇豆花葉病毒(CPMV)。已知CPMV的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)允許鑒定適于修飾而不破壞顆粒結(jié)構(gòu)的位點。截至目前，已經(jīng)在高分別率10下解決了來源于至少九個植物病毒屬和三個亞組2ssRNA衛(wèi)星病毒的三級和四級結(jié)構(gòu)。在上面的表l中列出了某些這些病毒。用作載體的例證的一組植物病毒是那些其衣殼蛋白具有P-折疊桶結(jié)構(gòu)的病毒。使用具有(3-折疊桶結(jié)構(gòu)的病毒的一個優(yōu)點是，(3-折疊的單條股間的環(huán)為外源肽的插入提供了便利的位點。一個或更多個環(huán)的修飾能是表達依據(jù)本發(fā)明的外源肽的一個策略。在衣殼蛋白的其它區(qū)域的插入也是可能的，例如在N-末端和/或C-末端中的插入。所有的具有二十面體對稱的已經(jīng)解決了其結(jié)構(gòu)的植物病毒符合如CPMV例證的八股P-折疊桶折疊，并且這可能代表了在所有的二十面體病毒中的共同的結(jié)構(gòu)。所有的這樣的病毒適用于本發(fā)明提呈外源肽序列的目的，該提呈能發(fā)生在P-折疊桶間的環(huán)中和/或N-末端和/和C-末端內(nèi)。修飾DNA序列以插入異源或外源序列的方法是本領(lǐng)域公知的。通常將病毒RNA序列轉(zhuǎn)變成全長cDNA轉(zhuǎn)錄物并克隆入載體，然后通過在能容忍這樣的插入而沒有破壞RNA復制、顆粒形成或干擾感染性的區(qū)域插入外源DNA片段進行修飾。豇豆花葉病毒組是一組主要感染豆類的至少十四種植物病毒。它們的基因組由獨立地在大約28nm直徑的等軸顆粒內(nèi)殼體化的具有不同長度的單鏈正義RNA的兩個分子組成。由于它們在氯化銫密度梯度離心中行為的結(jié)果，將兩類核蛋白分別命名為中間(M)和底部(B)組分，在顆粒內(nèi)的RNA分別命名為M和BRNA。兩類顆粒具有相同的蛋白組成，其由每一個大(VP37)和小(VP23)衣殼蛋白的60個拷貝組成。除了核蛋白顆粒外，豇豆花葉病毒制備物還包括可變量的命名為頂部(T)組分的空(僅有蛋白質(zhì))衣殼。在豇豆花葉病毒組的類型成員的情況下，已知豇豆花葉病毒(CPMV)的M和BRNA均被聚腺苷酸化并具有共價連接到其5'末端的小蛋白(VPg)。對其它豇豆花葉病毒的更有限的研究暗示，該組的所有成員的RNA均分享了這些特點。已經(jīng)將來源于CPMV的兩個RNA進行了測序并顯示其由3481(M)和5889(B)個核苷酸組成，排除聚腺甘酸尾(vanWezenbeek等人，1983;Lomonossoff和Shanks,1983)。兩條RNA均含有單個的長的開放閱讀框。通過巨大前體多肽的合成和ii隨后的切割，病毒基因產(chǎn)物的病毒發(fā)生。兩條RNA均是感染完整植物所必需的。更大的BRNA能在原生質(zhì)體中獨立復制，可是在這個情況下不產(chǎn)生病毒顆粒(Goldbach等人，1980)。該觀察以及更早的遺傳研究建立了MRNA編碼衣殼蛋白以及感染性病毒顆粒的形成依賴于B和M兩條病毒基因組RNA的存在的認識。豇豆花葉病毒科的一個優(yōu)點是，它們的衣殼包括能被獨立操作的每一個具有3個不同P-折疊桶的六十個拷貝。上面所列的所有其它病毒科和屬均具有相似的3-維結(jié)構(gòu)但僅有一種類型的(3-折疊桶。(例如，在CPMV的情況下，能在小衣殼蛋白(VP23)PB-(3C環(huán)中脯氨酸23(Pro23)殘基的前面制備外源插入。參見美國專利No.6,884,623。也能將本發(fā)明應用到尚未測定其晶體結(jié)構(gòu)的二十面體植物病毒(包括那些包含卩-折疊桶結(jié)構(gòu)的)。在未知其晶體結(jié)構(gòu)的一種病毒和已知其晶體結(jié)構(gòu)的第二病毒間存在衣殼蛋白基因內(nèi)的顯著的序列同一性的地方，對一級結(jié)構(gòu)的比對允許(3-鏈間的待推斷的環(huán)的單位[參見Dolja,V.V.andKoonin，E.V.(1991)J！72,pp1481-1486]。此外，在病毒同那些己經(jīng)測定其晶體結(jié)構(gòu)的病毒僅具有最小的衣殼蛋白序列同一性的地方，可將一級結(jié)構(gòu)比對同適當?shù)亩壓腿壗Y(jié)構(gòu)預測算法結(jié)合使用來允許潛在的插入位點的定位的測定。CPMV和菜豆莢斑點病毒(BPMV)顯示，BPMV和CPMV的3-D結(jié)構(gòu)非常相似且一般而言是豇豆花葉病毒科的典型。CPMV包含兩種亞基，小的(S)和大的(L)衣殼蛋白，每個病毒顆粒每一種亞基具有60個拷貝?？蓮耐粋€病毒粒上的L或S蛋白或從兩種衣殼蛋白上表達外源肽序列。CPMV是由兩部分組成的(biparite)RNA病毒。為了操作任何RNA病毒的基因組來表達外源肽，可使用RNA的cDNA克隆?？梢垣@得能將其進行操作以插入編碼外源肽的寡核苷酸序列的兩種CPMVRNA分子的全長cDNA克隆。能使用來源于植物RNA病毒的基因組的cDNA克隆來體外產(chǎn)生當將其接種到植物上時具有感染性的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明進一步的方面，構(gòu)建了CPMVRNAM和B的cDNA克隆，其中MRNA的cDNA克隆含有插入的編碼外源肽的寡核苷酸序列，其使用連接到病毒cDNA的5'端的木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動12子序列，在植物中產(chǎn)生感染性轉(zhuǎn)錄物。該技術(shù)克服了使用體外產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物時碰到的某些問題并可應用到所有的植物RNA病毒。其它病毒能包括各種雀麥草花葉病毒組，特別是豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)和南方菜豆花葉病毒組，特別是南方菜豆花葉病毒(SBMV)。也可使用具有三部分的病毒的RNA片段。這樣的有用病毒的例子是雀麥花葉病毒科的有三部分的病毒，如雀麥草花葉病毒(BMV)和豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)，其包裝在二十面體衣殼內(nèi)。BMV的基因組分成信使意義RNA1、2和3，大小分別是3.2、2.9和2.1kb。從RNA3形成的亞基因組RNA4編碼衣殼蛋白。為了用BMVRNA3轉(zhuǎn)染的細胞，BMVRNA1和2編碼的蛋白必須存在。這三個BMVRNA被分別殼體化到相同的顆粒中。每一個顆粒包括180個衣殼蛋白。可修飾衣殼蛋白以攜帶肽插入物。已經(jīng)比較了表1中顯示的大量病毒的衣殼蛋白。在美國專利No.6，884,623的圖10中解釋了二級結(jié)構(gòu)元素和它們的空間組織的相似性。外源表位的插入能使用任何位于P-折疊桶間的環(huán)。然而，制備插入使得將增加物暴露在病毒的內(nèi)部或外部表面并使得不廢除衣殼蛋白亞單位的組裝和病毒的感染性。通過使用晶體結(jié)構(gòu)顯示的單個衣殼蛋白亞單位的結(jié)構(gòu)以及它們彼此之間的相互作用的知識選擇特定的環(huán)，使得任何插入不太可能干擾病毒組裝。通過觀察晶體結(jié)構(gòu)然后通過體內(nèi)試驗法來鑒定最好的位點能初步選擇準確的插入位點。因此，為了鑒定被特別暴露在病毒表面并因而是潛在的好插入位點的衣殼蛋白的部分，可檢查植物病毒的三維結(jié)構(gòu)。也可檢査衣殼蛋白暴露部分的氨基酸序列以尋找斷裂a-螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸，因為這些也是潛在的好插入位點。合適的氨基酸的例子是脯氨酸和羥脯氨酸，其在多肽鏈內(nèi)打斷a-螺旋并創(chuàng)立結(jié)構(gòu)中的剛性扭結(jié)或彎曲。衣殼蛋白的N-和C-末端也是有吸引力的插入位點?？乖捅砦坏念愋捅景l(fā)明的實施方案包括亞單位類型疫苗的方法；即，提呈的抗原僅代表了已知有效的抗原的片段。這樣的疫苗(抗原)比全生物或全蛋白疫苗固有地更安全，因為它們?nèi)鄙倥c疾病的感染過程或病理學相13關(guān)的所有功能性。本發(fā)明的實施方案包括抗炭疽(炭疽桿菌)感染效應的亞單位疫苗的方法。在該炭疽疫苗中，SEQIDNo:23，亞單位抗原代表了衍生自所謂的保護性抗原或PA的大約25個氨基酸的片段。己知該蛋白能有效激發(fā)針對炭疽的免疫并是新一代炭疽疫苗的基礎(chǔ)。也生產(chǎn)了犬細小病毒疫苗。參見例如Langeveldaa/.(2001)"InactivatedRecombinantPlantVirusProtectsDogsfromaLethalChallengewithCanineParvovirus,"&c">7e19:3661-3670禾卩Langeveld&a/.(1995)"FullProtectioninMinkAgainstMinkEnteritisViruswithNewGenerationCanineParvovirusVaccinesBasedonSyntheticPeptideorRecombinantProtein,"^c"Ve13:1033-1037。已經(jīng)證明了這些基于病毒顆粒的亞單位疫苗能有效抵抗病毒病原(細小病毒屬)并保護動物免受傳染源的致命威脅。當前通過用預先工程化的重組病毒RNA或DNA感染植物在植物中生產(chǎn)嵌合顆粒。緊接著接種，重組病毒從細胞到細胞和遠距離地傳播。這導致植物的系統(tǒng)感染。收集感染的植物組織，抽提、.按配方制造嵌合病毒顆粒并將其用作疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活疫苗候選者以滿足環(huán)境保護的要求是有利的。不僅可將本滅活方法應用到展示抗原表位然后將其用作疫苗的顆粒，也可將其應用到展示任何其它有用的肽如靶向肽、抗微生物肽等等的顆粒。也可將該技術(shù)應用到野生型或修飾的顆粒，然后將其用于各種部分到顆粒表面的共價連接。這包括包含抗原蛋白、肽、碳水化合物、脂類、核酸、檢測劑(如熒光染料)、放射劑、靶向配體等等的蛋白連接?？蓪㈩w粒合成物用作疫苗以及用于將相關(guān)的因子傳遞到靶向組織等等。也能在各種試劑如藥物、位于顆粒中的用于表達外源基因、毒素等等，然后將其用于殼體化的試劑的給予和傳遞的外源核酸的殼體化前應用該技術(shù)。包括在能根據(jù)本發(fā)明進行使用并表達在衣殼表面上的許多肽表位是來源于病毒和細菌病原和癌癥的那些，包括來源于流感病毒、東方馬腦炎病毒和炭疽桿菌的那些?？赡苷先胫参锊《镜耐庠措?參見例如WO92/18618)可能具有高度不同的類型。由于外源肽的性質(zhì)和大小以及將其置于病毒顆粒14內(nèi)或上的位點，可能存在某些限制。肽序列不應干擾修飾的病毒在體內(nèi)培養(yǎng)時進行組裝的能力。在本說明書中，當術(shù)語"外源的"應用到肽或編碼它的核酸時，其意思是指針對用作載體的植物病毒不是與生俱來的肽或核酸序列。也可將這樣的序列可選地描述為外源的或異源的序列。術(shù)語"肽"包括小肽和多肽。肽通常包括超過5個氨基酸殘基。能從任何生物上有用的肽形成修飾的病毒顆粒。這樣的肽的例子是肽類激素；酶；生長因子；原生動物、病毒、細菌、真菌或動物起源的抗原；包括抗獨特性抗體的抗體；免疫調(diào)節(jié)劑和細胞因子，例如干擾素和白介素；受體；粘附素；和任何上述類型肽的部分或前體。在提呈在植物病毒載體上的廣泛范圍的生物活性肽中(例如，與WO92/18618—致)，特殊的重要性附加到是疫苗，特別地動物(包括人類)病毒和細菌疫苗的基礎(chǔ)的抗原肽。應注意，疫苗可能具有預防性的(即疾病預防)或治療性的(即疾病治療)應用。對于疫苗應用，提供了特別有吸引力的表位提呈系統(tǒng)。當用于這樣的應用時，抗原肽組分將被適當?shù)囟ㄎ辉诒磉_顆粒上以能被免疫系統(tǒng)容易地識別，例如通過在病毒的衣殼蛋白的暴露部分的定位。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，提供的是包含衍生自病原，例如動物病毒或細菌病原，整合在植物病毒的衣殼蛋白表面上的暴露位置的抗原的修飾植物病毒的組裝顆粒。能將組裝的修飾的植物病毒顆粒用作疫苗的免疫原組分。這樣的組裝的修飾的提呈抗原肽的植物病毒顆粒也具有作為用于檢測，例如，動物(包括人類)病原和疾病的免疫診斷試驗的抗原提呈組分的應用。在本發(fā)明的實施方案中，在保留抗原的完整性的同時，將抗原VLP滅活和/或使其不具有感染性。因此，這消除了感染性病毒顆粒非期望傳送的風險，縱使它們是植物病毒。這極大地減少了調(diào)控上的關(guān)注。因此，極大地減少了在將它給予被治療的人或動物后植物病毒到植物的傳播和散布。關(guān)于能被插入到病毒衣殼蛋白內(nèi)的外源肽的大小，該系統(tǒng)是高度通用的。因此，根據(jù)本發(fā)明，能使用包含多達38或更多個氨基酸的肽。給予方法給予這些，當前是重組的，病毒的方法包括給予到粘膜的氣霧劑。然而，根據(jù)本發(fā)明，能使用各種給予方法。這些包括可注射的給予(IP、IM、SC)或經(jīng)皮的、鼻內(nèi)的或口服的給予。候選病毒、其衣殼形態(tài)學和其中抗原/表位的插入能在原始病毒衣殼蛋白中的任何合適位置插入編碼外源肽的多核苷酸片段，其不干擾病毒復制和感染宿主的能力且其允許在修飾的病毒顆粒上適當?shù)厣a(chǎn)和提呈肽。通常，插入外源多核苷酸，因此它被作為衣殼蛋白的部分或與衣殼蛋白融合而被生產(chǎn)。在體內(nèi)例如在細菌宿主內(nèi)或如本領(lǐng)域所公知的在體外制備RNA轉(zhuǎn)錄物并使用其來接種合適的植物宿主或植物組織。能以殼體化形式或在溶液中使用RNA，因為殼體化將在宿主生物內(nèi)發(fā)生。可選地，能使用融合到依賴DNA的RNA聚合酶啟動子的病毒DNA來啟動病毒RNA在植物宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。然后，轉(zhuǎn)錄的RNA能啟動病毒在植物宿主內(nèi)的感染。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，給定的病毒可能需要最佳的感染性和復制的特殊條件，包括以順式或反式起作用的基因的存在，當感染植物或植物組織時，其全部將被提呈。例如，對于BMVRNA3的感染性，BMVRNA1和2的存在是必需的。此外，具有針對給定宿主的必需的宿主特異性基因的病毒的感染能在某些環(huán)境中允許通過正常情況下不影響該宿主的第二病毒感染宿主，例如混合的TMV和BMV病毒將感染大麥和煙草，即使BMV單獨不感染煙草且TMV單獨不感染大麥(HamiltonandNichols(1977)尸/2j^/aA0/0gv,67:484-489)。能在田地和/或溫室條件下轉(zhuǎn)染植物。轉(zhuǎn)染通常需要葉片組織的擦傷?？稍谥参锷L周期的任何時間接種植物，優(yōu)選植物幼小時。病毒的選擇和修飾的細節(jié)是選擇的問題，這依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉和理解的參數(shù)。除了修飾衣殼蛋白外，為了在宿主植物中的表達，也可將其他合適的基因插入原始的病毒基因組。這些包括用于在植物中生產(chǎn)商業(yè)有用的肽、蛋白質(zhì)、藥物或任何其他有用的多肽的基因。通常，可將其16表達產(chǎn)物在植物細胞中起作用的異源基因插入本文公開的病毒表達系統(tǒng)?？蓪⑿揎椀囊職さ鞍妆旧聿迦氘愒床《镜幕蚪M中。為了確保異源衣殼蛋白基因的翻譯保真度，假如原始衣殼蛋白的翻譯起始ATG密碼子未被刪除也必需將其進行修飾，且可通過本領(lǐng)域已知的方法完成該修飾，如寡核苷酸直接取代。假如待加載的衣殼蛋白序列具有它自己的翻譯起始密碼子，必需將該原始蛋白的起始密碼子刪除或滅活；然而，可選地，可將其保留并用于啟動加載的衣殼蛋白序列的翻譯，只要因此引入的任何氨基酸序列改變不干擾RNA包裝和衣殼形成?？墒褂脤挿秶囊赘兄参锼拗骱椭参锛毎?。這些包括任何雙子葉植物和單子葉植物、植物的組織以及培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)物中或形成愈合組織的植物細胞。進一步的程序步驟為了生產(chǎn)修飾的植物病毒顆粒，可通過引入編碼以同編碼衣殼蛋白的部分植物病毒基因組融合的外源肽(如動物病毒或細菌抗原)的核苷酸序列，用修飾的病毒核酸感染植物或植物細胞并收集修飾的病毒的組裝顆粒修飾植物病毒核酸。然后根據(jù)本發(fā)明將分離的病毒滅活。典型地在植物病毒基因組編碼衣殼蛋白暴露部分的部分引入編碼外源肽的核酸序列?？赏ㄟ^相應于RNA病毒的RNA的cDNA操作實現(xiàn)該操作。在RNA病毒的情況下，為了接種植物細胞，或優(yōu)選地全植物，通常制備修飾的DNA的RNA轉(zhuǎn)錄物，以在收獲組裝的修飾病毒顆粒前獲取增殖階段?？蛇x地，可在質(zhì)粒中構(gòu)建RNA病毒的cDNA克隆，以使病毒衣殼蛋白的5'端編碼序列直接融合到在植物宿主中具有活性的啟動子的翻譯起始位點?？蓪⑼庠措淖畛踝鳛橐職さ鞍椎牟糠侄M行表達并借此以完整病毒顆粒的部分而進行生產(chǎn)。因此，可將肽作為想以此進行使用的共軛分子進行生產(chǎn)?？蛇x地，為了允許目標肽從病毒顆粒釋放，可應用合適的導致其從病毒顆粒斷裂的試劑來設(shè)計病毒的遺傳修飾?？赏ㄟ^在目標肽兩側(cè)插入對酸性水解敏感的氨基酸而完成該釋放。例如，可將天冬氨酸-脯氨酸氨基酸工程化使其位于插入肽的兩側(cè)且可通過用弱酸處理將插入肽從顆粒上釋放。17為了商業(yè)規(guī)模地生產(chǎn)修飾的病毒，不必為每一批病毒生產(chǎn)制備無效接種劑(DNA或RNA轉(zhuǎn)錄物)?？蛇x地，可使用原始的接種劑感染植物；可在植物中擴增產(chǎn)生的修飾病毒來生產(chǎn)全病毒或病毒RNA作為隨后的批次的接種劑?？梢愿鞣N配置將外源RNA或DNA插入到植物病毒基因組中。例如，可將它以在編碼衣殼蛋白的已存在核酸上的加載形式或以編碼衣殼蛋白的部分已存在序列的替換的形式進行插入。可通過衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和用其可在沒有干擾遺傳修飾的病毒在植物中組裝成顆粒的能力下制備加載或取代的放松(ease)而部分測定該選擇。根據(jù)本公開，能在每一種特定情況下通過某些額外的實驗獲取用于本發(fā)明目的的可允許的和最合適的加載或刪除的大小的測定。在某些情況下，額外插入物的使用似乎提供了比取代插入物更多的靈活性。在植物中增殖修飾的病毒能生產(chǎn)顯著的產(chǎn)率。如上面表明地，插入的異源核苷酸序列可能包括那些編碼易被斷裂的氨基酸的序列，因此，在增殖階段后，能從病毒顆粒分離目標物質(zhì)。例如，人們能將兩條肽插入衣殼蛋白一可將一條用于通過，例如，親和純化進行的修飾顆粒的純化并在純化后將其斷裂；另一條能是保留在顆粒上并用于免疫接種的抗原肽。作為肽的全部斷裂的選擇，在某些情況下，以其在衣殼的主要部分內(nèi)保持完整的形式釋放是可能的和期望的。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可在編碼衣殼蛋白的病毒核酸內(nèi)選擇兩種不同的限制酶位點且通過使用合適的限制酶可將核酸進行限制性酶切。合成編碼期望插入病毒衣殼蛋白內(nèi)的外源肽的互補寡核苷酸對。寡核苷酸在與限制酶位點一致的末端終止從而允許將其插入限制的病毒核酸。這個操作導致編碼外源肽的核苷酸序列引入到衣殼蛋白序列中。如本文所用，術(shù)語"雜種RNA病毒"或"修飾的RNA病毒"指包含衍生自RNA病毒的感染性病毒序列、衍生自另一來源的表位/抗原/肽的多核苷酸片段的重組病毒RNA序列。因此，在滅活前，本發(fā)明的雜種的或修飾的病毒RNA是包含衍生自一種RNA病毒的感染性病毒序列和衍生自另一種病毒、細菌或其它來源的表位/抗原/肽的多核苷酸片段的RNA序列?？蓪⑿g(shù)語"雜種RNA病毒粒"或"雜種病毒18顆粒"用來指這樣的病毒的殼體化形式。一種適于接受插入的編碼肽的多核苷酸片段的原始病毒RNA序列是相應于RNA病毒序列的序列的例子。當通過插入或其它方式修飾時，這些序列是"衍生自"原始的/天然發(fā)生的病毒序列。這樣的病毒序列必須最少也要具有在宿主內(nèi)復制的功能和感染宿主的能力?？赡苄枰@樣的順式功能測定或在其它情況下，可能反式提供這樣的功能測定。可滿足反式復制需要的例子是為了允許BMVRNA3在宿主中復制對BMVRNA1和2編碼的蛋白的存在的需要。相比較地，某些復制信號必須順式存在(即直接連接到RNA3衍生物上)以允許通過在被RNA1和2誘導的感染細胞內(nèi)的機制復制RNA3衍生物。另一個反式功能的例子是為了允許CPMVRNA2在宿主內(nèi)復制，需要CPMVRNA1編碼的蛋白。相比較地，某些復制信號必須以順式存在(即直接連接到RNA2衍生物上)以允許通過被RNA1引導的感染細胞內(nèi)的機制復制RNA2衍生物。也可期望的是，原始病毒序列具有外源或異源肽編碼多核苷酸的合適加載位點。與這些多核苷酸片段和序列有關(guān)的術(shù)語"外源的"和"異源的"指在原始病毒中未天然存在的序列。相似地，外源或異源肽和多肽本文指加到病毒表達/生產(chǎn)系統(tǒng)的抗原或表位?？蓪⑦@樣的外源多核苷酸或序列在不干擾原始病毒序列的必需功能，即復制和感染宿主的能力的任何位置插入。關(guān)于在宿主中的表達，"異源的"或"分離的"多核苷酸是一條在宿主內(nèi)其被置于的位置為天然存在的多核苷酸?？善谕?，異源肽編碼片段的放置不干擾原始病毒序列的必需功能。不必天然發(fā)生但可能被修飾的插入核酸片段復合了多于一種編碼片段或編碼多于一種的肽/多肽。也可通過組合插入和刪除修飾RNA以控制修飾的RNA分子的整體長度或其它性質(zhì)。插入的外源RNA序列在起源上能是非病毒的或病毒的，且可能本質(zhì)上對應于RNA或DNA。它們在起源上可能是原核生物的或真核生物的，只要它們處于能被受體細胞的翻譯機制直接翻譯或在其他方面，它們的功能、結(jié)構(gòu)或調(diào)控功能能被識別和利用的形式。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知地，通過提供合適的宿主特異性和復制功19能，可用本發(fā)明的RNA序列感染任何植物。在合適的構(gòu)建下，也可將其它的真核生物如可能是單個細胞和組織培養(yǎng)物進行感染。本發(fā)明不限于任何給定的宿主種類或RNA病毒類型。術(shù)語"系統(tǒng)感染"指感染通過宿主生物的系統(tǒng)傳播以包括多于在原始接種位點上的細胞。不必感染整個的宿主生物；感染可針對某些組織。優(yōu)選的組織是葉片組織。當應用到宿主生物時，術(shù)語"轉(zhuǎn)染的"指將本發(fā)明的病毒序列以能在其中復制的方式整合入生物體的細胞。為了被轉(zhuǎn)染，不必但能是系統(tǒng)感染生物體。然而，本發(fā)明不需要病毒的系統(tǒng)傳播。本領(lǐng)域公知啟動宿主生物體感染的方法，并且可使用任何合適的方法。優(yōu)選的植物感染方法是將創(chuàng)傷的植物與含有病毒或病毒RNA的溶液接觸以導致病毒在植物中復制或感染植物。本發(fā)明的實施方案能利用植物病毒作為在植物中和通過植物生產(chǎn)疫苗樣和其它多肽的載體系統(tǒng)。本發(fā)明的一個方面涉及組裝的含有預設(shè)的外源肽作為病毒衣殼蛋白的部分的植物RNA病毒顆粒，其中通過使用本發(fā)明的方法已經(jīng)消除了RNA或使其不具有感染性。本發(fā)明也能包括組裝的展示外源肽的植物病毒顆粒，其中內(nèi)部展示是可能的。本發(fā)明也包括缺少感染性RNA的病毒。當應用到疫苗制備時，本發(fā)明具有超過傳統(tǒng)疫苗、基于動物病毒或細菌的重組疫苗和肽疫苗的優(yōu)點，包括1)降低了生產(chǎn)費用，因為能從感染的植物中獲得極高收率的純病毒，且不需要組織培養(yǎng)生產(chǎn)步驟；2)提高的安全性，因為植物病毒不能感染動物和在動物中復制，因此不能突變成有毒的形式，但傳統(tǒng)的和重組動物疫苗可能會產(chǎn)生這種情況；3)像豇豆花葉病毒組一樣的罕見的穩(wěn)定性，能在沒有丟失有效性的情況下干燥純化的制備物并將其存放多年；4)缺少導致增加的免疫原性的肽的共軛，從而在顆粒的表面展示肽；和5)當與體內(nèi)同源重組(轉(zhuǎn)染)相比時，更小的病毒允許通過體外操作引入嵌合基因。除非另外指明，如本文所用，術(shù)語"a"、"an"和"the"指至少一。以到不與本說明書的明確教導不一致的程度將本文參考或引用的所有的專利、專利申請、臨時專利和出版物的全文引入本文作為參考。下述內(nèi)容是解釋實施本發(fā)明的過程的實施例。不應將這些實施例解釋為限制。除非另外指明，所有的百分比是重量百分比，所有的溶劑混合物比例是體積比。實施例實施例l-CPMV顆粒滅活的概述使用該步驟滅活超過16種不同的CPMV顆粒(攜帶不同的表位)以及野生型CPMV病毒。已經(jīng)從滅活的病毒分離了RNA并在凝膠上跑膠來測定RNA是否被降解。也將滅活的顆粒接種植物來測試誘導感染的能力。沒有接種的植物產(chǎn)生病毒感染。從滅活病毒顆粒分離的RNA在每一個測試的情況中都被降解(參見圖1作為例子)實施例2-CPMV滅活的進一步的例子設(shè)立一個研究來測定0.8M的硫酸銨能否滅活CPMV，同時保留它的完整性。將0.8M的硫酸銨用作本純化過程的部分。在該過程中的pH的增加滲透化(permealize)病毒，但也會增加游離NH3的濃度。本研究的結(jié)論是，pH9禾npH7的0.8M的硫酸銨均在22。C和40'C維持了病毒完整性，而且僅僅在pH9時病毒完整性丟失。對照實驗中，在30mMTris-HCl中在22和40。C下孵育CPMV，產(chǎn)生了完全的感染性CPMV顆粒。從這些結(jié)果，可進一步推論，導致滅活所需的是0.8M的硫酸銨和pH9的組合，而不是單獨的溫度或硫酸銨。在調(diào)整到合適的硫酸銨濃度和pH的磨碎的細胞液上繼續(xù)進行本研究實驗，且關(guān)注植物漿料中的化合物導致滅活(例如補骨脂素)。為了證明或反駁這一點，設(shè)立第二個研究來測定能否使用硫酸銨和pH9的組合將純化的CPMV顆粒滅活。使用各種純化級別的化學品來測定化學品中某些雜質(zhì)是否要為滅活負責。設(shè)立實驗矩陣，且所有測試的條件顯示在表2中。使用了0.7M的硫酸銨，因為它是我們再次最佳化的過程的部分，因此，可容易進行整合。表2在22。C進行20h的(NH4)2S04滅活研究的實驗矩陣No.(NH4)2S04_(NH4)2S0430mMTris-HCl1ANALAR0.1是212ARISTAR0.5否20.7pH9的濃度為0.5M和0.7M的(麗4)2804滅活了CPMV，而pH9的0.1M的(NH4)2S04沒有滅活。圖1顯示了抽提自活性的和滅活的病毒的跑1.2%的瓊脂糖凝膠并用EtBr染色的RNA。結(jié)果顯示了在活性病毒內(nèi)CPMV基因組RNA1和2以及滅活的病毒制備物中降解的RNA的存在。超過15種嵌合病毒顆粒和野生型病毒已經(jīng)獲得了相同的結(jié)果。實施例3-滅活實驗中使用的嵌合CPMV顆粒工程化嵌合CPMV顆粒以表達衍生自炭疽桿菌保護性抗原("PA")蛋白的肽。通過使用美國專利5,874,087、5,958,422和6,110,466公開的方法在CPMV的大和/或小衣殼蛋白上表達該肽。表達了下述肽表3<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例4-在植物中生產(chǎn)嵌合CPMV顆粒在室溫下在濕紙巾中過夜使購自費里-摩爾斯公司序列號1450的豇豆加利福尼亞#5種子發(fā)芽。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)到土壤中。發(fā)芽后七天，用WT或嵌合CPMV顆粒接種幼苗。在接種后，在25°C、光周期為16小時光8小時黑暗將植物培養(yǎng)兩到三周。收集顯示了癥狀的葉片并在純化前將其在-8(TC中冷凍。實施例5-嵌合CPMV顆粒的滅活和滅活的嵌合CPMV病毒樣顆粒的純化在-8(TC冷凍40gCPMV感染的葉片組織。用手破碎冷凍的葉片組織并將其倒入Waring高速攪拌器、序列號8011S中。將120ml冷的滅活緩沖液(0.5M硫酸銨、0.03MTris堿pH9.00、0.2mMPMSF)倒到破碎的葉片上。在高速下將葉片磨2次進行3秒。將溶液輕輕倒入500ml的離心瓶中。用30ml冷的滅活緩沖液洗滌攪拌器并將洗滌物倒入500ml離心瓶。在15，000G下將溶液離心30分鐘以去除植物細胞碎片。)瞎上清輕輕倒入刻度量筒并孵育以在室溫下將病毒滅活20小時。為了沉淀CPMV病毒，將冷的PEG6000溶液(20%PEG6000,1MNaCl)加到上清中使最終的PEG濃度為具有0.2MNaCl的4%PEG6000，然后輕柔地混合溶液。在冰上將溶液沉淀1小時。然后在15，000G下將病毒沉淀溶液離心30分鐘來收集CPMV病毒沉淀。倒掉上清并將病毒立即重懸于陰離子交換結(jié)合緩沖液(30mMTris堿、pH7.50)中。為了進一步純化病毒樣顆粒，通過使用購自AppliedBiosystems、序列號為1-2559-11的POROS50HQ強陰離子交換樹脂的陰離子交換色譜將蛋白混合物分級。20倍柱體積梯度是從緩沖液A、30mMTris堿、pH6.75到具有1MNaCl的緩沖液B、30mMTris堿、pH6.75。用購自AmershamBiosciences、序列號18-1112-41的AKTAexplorer進行層析。圖2說明了PA7E的AIEC色譜圖。使用本實施例中公開的方法處理列在實施例3中的所有樣品，具有相似的結(jié)果。檢測到兩個主要的峰。藍跡線是在280的吸收度，紅跡線是在260的吸收度，綠跡線是緩沖液B的百分比，棕跡線是電導率。在色譜圖底部的紅色記號是流份。通過使用100kDa截留膜Millipore旋轉(zhuǎn)濃縮器、序列號UFC910096將在梯度上的第一個峰，其含期望的病毒樣顆粒緩沖液交換到PBS緩沖液、pH7.4中。然后將樣品保存在-80。C。第二個峰含有斷裂的顆粒污染物。用PA7EPEG沉淀物AIEC裝載、WTCPMV標準和AIECPA7E流份制備SDS-PAGE凝膠。在InvitrogenNupage4-12%Bis-Tris、12孔膠、序列號NP0322上跑SDS-PAGE。跑膠緩沖液是InvitrogenNupageMESSDS跑膠緩沖液、序列號NP0002。用200V電壓降將膠跑膠35分鐘。泳道1含有5^1InvitrogenSeeBluePlus2梯度、序列號LC5925。泳道2含有重懸的裝載到AIEC柱子上的PEG沉淀PA7E。泳道3含有WTCPMV。泳道4-8含有相應于AIEC峰1的目標純化的PA7E顆粒，其被進一步地收集和處理。泳道9-10含有相應于AIEC峰2的斷裂的PA7E顆粒污染物。實施例6-滅活的嵌合CPMV病毒樣顆粒-病毒基因組RNA抽提物的分析使用AmbionRNAqueous、序列號1912試劑盒來從PEG純化的滅活CPMV樣品抽提病毒基因組RNA。將未滅活的CPMV病毒顆粒用作對照(有活性的樣品)。圖3-5顯示了PA9、PA10、PAll、PA12和PAIS的RNA滅活結(jié)果。通過使用實施例6中公開的方法處理實施例3中列出的所有樣品，具有相似的結(jié)果。為圖l-3使用了購自Invitrogen、序列號G501801的預灌注1.2%E-Gels來可視化抽提的RNA。圖3-5中的所有的分子量梯度是1KB增加的分子量梯度、序列號10787-026的l^il上樣。在圖3中，泳道1是l^d分子量梯度。泳道2是有活性的PA9。泳道3是滅活的PA9。泳道4是分子量梯度。泳道5是有活性的PA10，泳道6是無活性的PA10。泳道7是分子量梯度。在圖4中，泳道1是1|il分子量梯度。泳道2是有活性的PA11。泳道3是滅活的PA11。泳道4是分子量梯度。泳道5是有活性的PA12，泳道6是無活性的PA12。泳道7是分子量的梯度。在圖5中，泳道l是ljal分子量梯度。泳道2是有活性的PA18。泳道3是滅活的PA18。如通過檢測"模糊"表明地，滅活樣品中的病毒基因組RNA被降解了，但在未經(jīng)歷滅活的樣品中檢測到了全長CPMV基因組RNA1和RNA2。24實施例7-通過SDS-PAGE分析滅活的嵌合CPMV病毒樣顆粒-穩(wěn)定性用SDS-PAGE測定小的和大的衣殼蛋白的穩(wěn)定性。圖6顯示了作為例子的PAIS的5天溫度穩(wěn)定性測定的SDS-PAGE凝膠。在InvitrogenNupage4-12%Bis-Tris、12孔凝膠、序列號NP0322上跑SDS-PAGE。用150V電壓降將凝膠跑膠60分鐘。跑膠緩沖液是InvitrogenNupageMESSDS跑膠緩沖液、序列號NP0002。泳道1含有7plInvitrogenBenchmark未染色蛋白分子量梯度、序列號10747-012。泳道2含有在室溫下孵育5天的滅活的PAIS病毒顆粒。泳道3含有在4"C孵育5天的滅活的PAIS病毒顆粒。泳道4含有在-2(TC孵育5天的滅活的PAIS病毒顆粒。未檢測到蛋白降解。實施例8-通過SEC分析滅活嵌合CPMV病毒樣顆粒-穩(wěn)定性通過使用分子排阻色譜(SEC)測定組裝的病毒樣顆粒的完整性。通過使用SEC分析實施例3中所列的所有樣品，具有相似的結(jié)果。使用的SEC柱是購自Supelco的具有10微米球大小、序列號08023的30cmx7.8mmTosohTskGelG5000分析型SEC柱。SEC的流動相是0.1M的NaP04、pH7.00。檢測到相應于組裝的病毒顆粒的單個峰。組裝的CPMV顆粒從柱子上洗脫，保留時間是14分鐘。實施例9-植物中滅活嵌合CPMV病毒樣顆粒感染性的分析測驗了實施例3中所列的滅活嵌合CPMV顆粒感染植物的能力。在室溫下在濕紙巾中過夜使購自費里-摩爾斯公司序列號1450的豇豆加利福尼亞弁5種子發(fā)芽。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)到土壤中。發(fā)芽后七天，用滅活的和有活性的WT或嵌合CPMV顆粒接種十株幼苗。在接種后，在25°C、光周期為16小時光8小時黑暗將植物培養(yǎng)兩到三周并觀察癥狀的形成。用滅活WT或嵌合CPMV顆粒接種的植物沒顯示癥狀，但用有活性WT或嵌合CPMV顆粒接種的植物顯示了典型的CPMV感染癥狀。收集用滅活WT或嵌合CPMV顆粒的接種的葉片并為病毒顆粒分離而進行處理。在-8(TC冷凍40gCPMV感染的葉片組織。用手破碎冷凍的葉片組織并將其倒入Waring高速攪拌器、序列號8011S中。將120ml冷的30mMTris堿、pH7.50、0.2mMPMSF倒在破碎的葉片上。在高速下將葉片磨2次進行3秒。將溶液輕輕倒入500ml的離心瓶中。用30ml冷的緩沖液洗滌攪拌器并將洗滌物倒入500ml離心瓶。在15，000G下將溶液離心30分鐘以去除植物細胞碎片。將上清輕輕倒入刻度量筒。為了沉淀CPMV病毒，將冷的PEG6000溶液(20%PEG6000:1MNaCl)加到上清中使最終的PEG濃度為具有0.2MNaCl的4%PEG6000，然后輕柔地混合溶液。在冰上將溶液沉淀1小時。然后在15,000G下將病毒沉淀溶液離心30分鐘來收集沉淀中的CPMV病毒。倒掉上清并將病毒立即重懸于PBS緩沖液、pH7.4中。用SDS-PAGE測定樣品中病毒顆粒的存在。在lnvitrogenNupage4-12。/。Bis-Tris、12孔膠、序列號NP0322上跑SDS-PAGE。用150V電壓降將膠跑膠60分鐘。跑膠緩沖液是InvitrogenNupageMESSDS跑膠緩沖液、序列號NP0002。未檢測到病毒顆粒。實施例10-用含有PA表位的滅活CPMV顆粒免疫小鼠用lOOpg純化的滅活CPMV-PA在存在佐劑下腹腔內(nèi)注射7周齡雌性Balb/c小鼠三次。對照小鼠接受具有不相關(guān)肽或僅處于PBS、pH7.0內(nèi)的佐劑的滅活CPMV顆粒。使用了同10(Hd樣品混合的lOO(ilRibi佐劑(R-700;RibiImmunochemResearch,哈密爾頓，蒙大拿)。給藥的總體積是200W。以3-周間隔給予注射。為了鼻內(nèi)免疫，將沒有佐劑的滅活CPMV-PA給予到麻醉的小鼠。在兩個鼻孔內(nèi)給予100pl的總體積(每個鼻孔5(Hd)。對照小鼠接受具有不相關(guān)肽或僅PBS、pH7.0的滅活CPMV。在第一次給予前1天和在兩次隨后的給予的每一次后2周獲取血樣。下面提供了小鼠免疫研究的概述表4佐劑處理途徑劑量小鼠#是CPMV醒PAIP3x100ug/200ul5是CPMV-對照IP3x100ug/200ul5是PBS,pH7.0IP3xN/A/200ul326否否否CPMV-PACPMV-對照PBS，pH7.0INININ3x100ug/100ul3x100ug/100ul3xN/A/100ul實施例ll-用含有PA表位的滅活CPMV顆粒免疫非人靈長類測驗當將含有PA表位的滅活CPMV顆粒給予到恒河猴時其產(chǎn)生針對共表達的炭疽表位的抗體反應的能力。用滅活的CPMV-PA肽構(gòu)建物肌內(nèi)免疫四只猴子且一只猴子用滅活的野生型CPMV對照進行肌內(nèi)免疫。每一免疫劑量由2mg的所有16種PA-CPMV構(gòu)建物的病毒-肽混合物組成。在第0、7、14和28天免疫接種動物。通過使用ELISA測定用PA蛋白作為目標監(jiān)控IgG和IgA抗體。在免疫天數(shù)的每一天將三到5ml血吸入肝素中。分離并冷藏保存細胞和血漿。在第0、14和28天將氯胺酮麻醉的猴子進行支氣管鏡手術(shù)并獲取和冷凍保藏支氣管灌洗樣。融化支氣管沖洗物和血漿并在ELISA測定中測量IgG和IgA抗體。在血漿和支氣管灌洗內(nèi)均檢測到了高滴度的IgG和IgA抗體。結(jié)果顯示在圖7和8。實施例12-用含有流感病毒表位M2e的滅活CPMV顆粒免疫小用100嗎純化的表達流感肽M2e的滅活CPMV在存在佐劑下腹腔內(nèi)注射7周齡雌性Balb/c小鼠三次。序列是SLLTEVETPIRNEGCR--CNDSSD(SEQIDNO:24)。對照小鼠接受具有不相關(guān)肽或僅在PBS、pH7.0內(nèi)的佐劑的滅活CPMV顆粒。使用同lOOjal樣品混合的lOOplRibi佐劑(R-700;RibiImmunochemResearch,哈密爾頓，蒙大拿)。給予的總體積是200)！1。以3-周間隔給予注射。為了鼻內(nèi)免疫，將沒有佐劑的含有流感肽M2e的滅活CPMV給予到麻醉的小鼠。在兩個鼻孔內(nèi)給予100)al的總體積(每個鼻孔50pl)。對照小鼠接受具有不相關(guān)肽或僅PBS、pH7.0的滅活CPMV。在第一次給予前1天和在兩次隨后的給予的每一次后2周獲取血樣。下面提供了小鼠免疫研究的概述'<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權(quán)利要求1、滅活植物病毒的方法，包括pH值大于8.0時，向表達病毒樣顆粒的植物材料給予硫酸銨，其中，植物材料選自植物、植物組織、植物細胞或原生質(zhì)體；孵育植物材料至少十個小時以生產(chǎn)滅活病毒樣顆粒；和從植物材料收獲滅活病毒樣顆粒。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括至少一條整合入病毒的外源肽。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的病毒是非包膜RNA病毒。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的滅活病毒樣顆粒提呈異源生物活性肽。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的肽是抗原。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的肽是表位。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中以0.5M到1.0M濃度給予硫酸銨。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中pH是9.0。9、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中在1(TC到4(TC間孵育植物材料。10、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的方法包括在pH7的0.7M(NH4)2S04中將植物病毒結(jié)合到疏水相互作用色譜柱上、用pH9的0.7M(NH4)2S04洗滌結(jié)合的病毒，并用pH9的0.7M(NH4)2S04洗脫所述病毒。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該病毒具有二十面體的衣殼。12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該病毒是來自選自雀麥花葉病毒科、豇豆花葉病毒科或番茄叢矮病毒科的科的病毒。13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中病毒是來自選自雀麥花葉病毒組、豇豆花葉病毒組、番茄叢矮病毒組、苜蓿花葉病毒組或南方菜豆花葉病毒組的屬的病毒。14、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中病毒選自豇豆花葉病毒、豇豆褪綠斑駁病毒、番茄叢矮病毒、苜蓿花葉病毒、雀麥草花葉病毒或南方菜豆花葉病毒。15、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中病毒包括衣殼蛋白，且肽是融合到衣殼蛋白的抗原。16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中肽選自肽類激素、酶、生長因子、抗體、免疫調(diào)節(jié)劑或細胞因子。17、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述方法進一步包括將病毒RNA序列轉(zhuǎn)變成全長cDNA轉(zhuǎn)錄物、將所述cDNA克隆入載體和通過在能容忍這樣的插入而沒有瓦解RNA復制、顆粒形成或感染性的區(qū)域內(nèi)插入外源DNA片段修飾所述cDNA。18、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中整合入病毒的外源肽選自流感病毒亞基、東方馬腦炎病毒、犬細小病毒或炭疽桿菌。19、生產(chǎn)非感染性病毒樣顆粒的方法，包括pH值大于8.0時，向選自植物、植物組織、植物細胞或原生質(zhì)體且缺少至少一部分存在于植物病毒內(nèi)的RNA的植物材料給予硫酸銨；孵育植物材料至少十個小時；和從植物材料收獲滅活病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆粒不能復制。20、含有病毒樣顆粒的疫苗，其中所述疫苗包括植物病毒，而所述植物病毒包括至少一種整合入該病毒的外源肽，pH值大于8.0時，采用包括向，選自植物、植物組織、植物細胞或原生質(zhì)體的植物材料給予硫酸銨，生產(chǎn)滅活病毒樣顆粒；孵育植物材料至少十個小時；和從植物材料收獲滅活病毒樣顆粒的方法生產(chǎn)疫苗。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗，其中當將所述病毒樣顆粒給予哺乳動物時提呈的VLP肽誘導免疫反應。22、根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗，其中疫苗是為了流感病毒、東方馬腦炎病毒、犬細小病毒或炭疽桿菌。23、根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗，其中肽是表位。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的疫苗，其中表位是病毒病原體、細菌病原體或癌癥。25、根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗，其中所述疫苗是亞單位疫苗，其中所述肽是部分抗原且所述部分作為疫苗是有效的。26、根據(jù)權(quán)利要求20所述的疫苗，其中所述外源肽包括SEQIDNO:23。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)植物生產(chǎn)的用作疫苗等的植物病毒。更明確地，本發(fā)明涉及簡單的滅活方法和借此獲得的植物病毒顆粒。本文公開的發(fā)明提供生產(chǎn)基于在滅活植物病毒樣顆粒表面上的衍生自致病體表位展示的安全疫苗的手段和方法。本發(fā)明披露了嵌合植物病毒顆粒的滅活和將滅活步驟整合入病毒顆粒的純化中。滅活方法提供不能感染植物且保留了病毒顆粒完整性的病毒。文檔編號A61K39/07GK101495137SQ200680045205公開日2009年7月29日申請日期2006年12月1日優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日發(fā)明者J·P·費爾普斯,L·拉索霍娃申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司