專利名稱：一種殼聚糖的病原微生物滅活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼聚糖，尤其涉及一種殼聚糖的病原微生物滅活方法，屬于生物材料 加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖化學(xué)名為聚(1，4) -2-氨基-2-脫氧-β -D-葡聚糖，主要由廣泛存在于節(jié) 肢動(dòng)物外殼和真菌類細(xì)胞壁中提取的甲殼素經(jīng)脫乙酰化制得，是一種天然氨基多糖。因其 具有良好的生物相容性、生物降解性，殼聚糖在生物材料、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。但 殼聚糖來(lái)源于動(dòng)物體，可能被從病毒到細(xì)菌等各種病原微生物污染；同時(shí)殼聚糖在加工、儲(chǔ) 藏中也可能因儀器和器皿、試劑、生產(chǎn)環(huán)境等因素的影響，受到細(xì)菌、病毒等病原微生物的 污染。如果這些污染物被傳播給人，將會(huì)引起嚴(yán)重的健康問(wèn)題。這些污染物還可能降低甚 至破壞所污染的材料?，F(xiàn)有生物材料的細(xì)菌滅活方法包括干熱、濕熱、過(guò)濾等；病毒滅活方法包括S/D法 (有機(jī)溶劑/表面活性劑法)、過(guò)濾法、加熱法、環(huán)氧乙烷等。它們?cè)谏锊牧蠝缇鹊膽?yīng)用 可參見(jiàn)專利CN1225020A、專利申請(qǐng)200910209501. X等。但這些方法對(duì)殼聚糖病原微生物的滅活有局限性S/D法僅對(duì)包膜病毒有效；加 熱法對(duì)耐熱病毒效果差，并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加熱會(huì)引起殼聚糖產(chǎn)品的降解170°C 2小時(shí)干熱 滅菌后殼聚糖由類白色變?yōu)樽厣?20°C 4小時(shí)干熱滅菌后殼聚糖變?yōu)樽攸S色，分子量降低 至初始的27. 6% ；121°C濕熱滅菌后殼聚糖由類白色變?yōu)辄S色，分子量降低至初始的56. 8%。 烷基化劑可能引起材料的降解等反應(yīng)。過(guò)濾法對(duì)高粘度的產(chǎn)品如殼聚糖也不適用。Y-射線是一種由亞原子粒子相互作用產(chǎn)生的電磁輻射，它對(duì)各種微生物均有殺 滅作用，包括有包膜和無(wú)包膜病毒及所有的基因型物質(zhì)。與傳統(tǒng)的細(xì)菌、病毒滅活方法相比 較，Y-射線輻照有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)1、不使物品升溫，適用于忌熱物品的消毒，除某些塑料、 活細(xì)胞及其制劑外，許多醫(yī)用物品都可用它進(jìn)行消毒滅菌。2、穿透力強(qiáng)。射線可穿透被照 物品的各個(gè)部位，一般不受物品包裝、形態(tài)的限制。3、被照物品不會(huì)產(chǎn)生感生放射性，輻照 后無(wú)殘留毒性，方法簡(jiǎn)便。4、省能，尤其適于大規(guī)模工業(yè)化處理。由于上述優(yōu)勢(shì)，Y-射線輻 照在生物材料中對(duì)細(xì)菌和病毒的滅活應(yīng)用也越來(lái)越多，如專利CN1665388A、CN101757651A、 CN1628860A。一般情況下，20 50kGy劑量的、-射線輻照幾乎能滅活所有的細(xì)菌和病毒。方 月娥等報(bào)道采用2. 5 20kGy Y _射線輻照殼聚糖膜可滅活金葡菌和枯草芽孢桿菌，同時(shí)輻 照引起了殼聚糖分子量降低，但具體數(shù)值未報(bào)道。病毒滅活需要的輻照劑量大于滅菌需要 的劑量。輻照劑量越大，對(duì)生物大分子材料的損傷也越大。Choi等報(bào)道殼聚糖溶液2-10kGy 輻照后，分子量急劇下降，IOOkGy以上輻照時(shí)溶液變?yōu)樽厣ryczka等報(bào)道殼聚糖固體在 6. 3 300kGy輻照后分子量下降并結(jié)晶性發(fā)生變化，14. 4kGy輻照后分子量即降低至初始 分子量的30%，300kGy輻照后分子量?jī)H為初始分子量的2. 9%。Kang等報(bào)道殼聚糖溶液輻照 后結(jié)晶度降低。這些分子量、結(jié)晶度等的變化會(huì)顯著影響殼聚糖的質(zhì)量，限制其作為生物材料的應(yīng)用?？梢?jiàn)，對(duì)殼聚糖進(jìn)行病原微生物滅活的關(guān)鍵在于徹底進(jìn)行滅活的同時(shí)，盡最大限 度地減小對(duì)材料的生物活性和結(jié)構(gòu)的影響是非常重要的。因此，尋找一種能滅活所有病毒， 同時(shí)對(duì)殼聚糖質(zhì)量影響較小，操作方便的方法，將有助于提高殼聚糖產(chǎn)品的安全性，并保證 其質(zhì)量適合作為生物材料使用。NaOH溶液能夠滅活病原微生物，但由于很多生物材料不耐受強(qiáng)堿，其應(yīng)用很少見(jiàn)。 殼聚糖對(duì)NaOH穩(wěn)定，但由于殼聚糖不溶于堿，水相中的NaOH難以滅活包裹在殼聚糖固體顆 粒內(nèi)部的病原微生物，受這樣一個(gè)兩相體系的限制難以完全滅活病原微生物，所以該方法 對(duì)殼聚糖中病原微生物滅活有很大的局限性。綜上所述，殼聚糖來(lái)源于動(dòng)物體，涉及病毒以及傳染性病原體等的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有生物 材料的細(xì)菌滅活方法不適用于殼聚糖。Y“射線是一種有效滅活殼聚糖中病原微生物的方 法，但完全滅活殼聚糖中的病原體需要較高的輻照劑量，高劑量時(shí)對(duì)殼聚糖的降解較為顯 著，對(duì)其質(zhì)量有一定影響。NaOH滅活殼聚糖中病原微生物受到兩相體系的限制有很大局限 性。因此，尋找一種能滅活所有病毒，同時(shí)對(duì)殼聚糖質(zhì)量影響較小，操作方便的方法，將有助 于提高殼聚糖產(chǎn)品的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有病原微生物滅活技術(shù)在殼聚糖的病原微生物滅活中的缺 陷而提供的一種在保證有效殺滅可能污染的病原微生物的同時(shí)，維持殼聚糖的功能和性質(zhì) 的病原微生物滅活方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
采用NaOH溶液對(duì)殼聚糖中病原微生物進(jìn)行初步滅活，然后將殼聚糖干燥，充氮并密 封，控溫輻照。
所述的初步滅菌，采用質(zhì)量濃度4. 0% 40%的NaOH溶液，NaOH溶液與殼 聚糖用量質(zhì)量比為20 50 1，溫度為室溫至100°C，初步滅菌至菌落總數(shù)小于IOOOcfu/ g;然后過(guò)濾，水洗至中性。所述的干燥是包括但不限于常壓干燥、減壓干燥、冷凍干燥等方式，使殼聚糖含水 量小于10%。所述的充氮密封是取一定量殼聚糖至適當(dāng)?shù)娜萜髦?，充氮?dú)獠⒘⒓疵芊猓越档?氧的分壓，減少輻照產(chǎn)生的活性氧，減少輻照對(duì)殼聚糖的降解。所述的控溫輻照是指密封后的殼聚糖在溫度-20 30°C條件下，以10 50kGy的 Y-射線輻照。控溫輻照后殼聚糖中的殼聚糖中感染性病毒的殘留滴度<0. 5 Ig TCID50 ；菌落數(shù) 降低至彡10cfu/g。本發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)NaOH溶液初步滅活病原微生 物，降低殼聚糖的生物負(fù)載；然后通過(guò)10 50kGy的Y -射線輻照即可實(shí)現(xiàn)無(wú)菌無(wú)病毒，避 免了高劑量輻照。因此殼聚糖的脫乙酰度、結(jié)晶度等在滅活前后維持不變，分子量降低幅度 顯著低于其他病原微生物滅活方法；也避免了其他滅活方式引起殼聚糖降解或難以完全滅 活等缺點(diǎn)。在保證有效殺滅可能污染的病原微生物的同時(shí)，維持殼聚糖的質(zhì)量和性能，滅活后殼聚糖產(chǎn)品適用于作為生物材料使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
取殼聚糖樣品1份，依次加入約107cfu/g短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)，約 107cfu/g枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)和約 IO6TCID50/ g的豬細(xì)小病毒(PPV)，lg/瓶分裝。加入4. 0%Na0H溶液，NaOH溶液用量與殼聚糖比為20 1，80°C保溫，使滅菌至菌落總數(shù)小于lOOOcfu/g。過(guò)濾，水洗至中性，安瓿瓶分裝，冷凍干 燥，干燥后水分含量9.6%。充氮?dú)?，立即密封?20°C進(jìn)行50kGyY-射線輻照。輻照后采 用 Reed-muench TCID5tl 法測(cè)定病毒滴度降低(total reduction factor, TRF)情況，并測(cè) 定菌落數(shù)降低的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4.0%Na0H溶液80°C初步滅活后50kGy Y -射線輻照，PPV的殘留滴 度<0.5 Ig TCID5tl，菌落數(shù)降低至< lOcfu/g。同時(shí)滅活前后殼聚糖結(jié)晶度分別為36.4%、 36. 7%、脫乙酰度均為84. 2%，分子量降低為初始分子量的76. 6%。實(shí)施例2
殼聚糖的準(zhǔn)備同實(shí)施例1。用NaOH溶液質(zhì)量濃度為15%，NaOH溶液與殼聚糖用量比為30 1，60°C滅菌至菌 落總數(shù)小于lOOOcfu/g。過(guò)濾，水洗至中性。減壓干燥至水分含量8. 8 %。安瓿瓶分裝，充氮 氣，密封。室溫進(jìn)行總劑量25kGyY-射線輻照，輻照后PPV的殘留滴度彡0.5 Ig TCID5tl，菌 落數(shù)降低至彡lOcfu/g。輻照前后殼聚糖結(jié)晶度分別為36. 4,36. 7%，脫乙酰度分別為84. 2% 和84. 6%，分子量降低為初始分子量的77. 8 %。實(shí)施例3
殼聚糖的準(zhǔn)備同實(shí)施例1。用NaOH溶液質(zhì)量濃度為40%，NaOH溶液與殼聚糖用量比為50 1，溫度為室溫， 滅菌至菌落總數(shù)小于lOOOcfu/g。過(guò)濾，水洗至中性。減壓干燥，干燥后水分含量8. 9 %。 安瓿瓶分裝，充氮?dú)?，密封?0°C進(jìn)行總劑量IOkGy Y-射線輻照，輻照后PPV的殘留滴度 彡0.5 Ig TCID5tl，菌落數(shù)降低至彡lOcfu/g。輻照前后殼聚糖結(jié)晶度分別為36.4、36.2%， 脫乙酰度分別為84. 2%和85. 0%，分子量降低為初始分子量的80. 1%。實(shí)施例4
殼聚糖的準(zhǔn)備同實(shí)施例1。用NaOH溶液質(zhì)量濃度為30%，NaOH溶液與殼聚糖用量比為40 1，溫度為100°C， 滅菌至菌落總數(shù)小于lOOOcfu/g。過(guò)濾，水洗至中性。常壓干燥，干燥后水分含量9. 2 %。 安瓿瓶分裝，充氮?dú)?，密封?10°C進(jìn)行總劑量30kGy Y-射線輻照，輻照后PPV的殘留滴度 彡0.5 Ig TCID5tl，菌落數(shù)降低至彡lOcfu/g。輻照前后殼聚糖結(jié)晶度分別為36. 5、36.3%， 脫乙酰度分別為84. 1%和84. 7%，分子量降低為初始分子量的78. 2%。
權(quán)利要求
一種殼聚糖的病原微生物滅活方法，其特征在于采用NaOH溶液對(duì)殼聚糖中病原微生物進(jìn)行初步滅活，然后將殼聚糖干燥，充氮并密封，控溫輻照；步驟為(1)采用NaOH溶液對(duì)殼聚糖中病原微生物進(jìn)行初步滅活所述的NaOH溶液質(zhì)量濃度為4.0%～40%，NaOH溶液與殼聚糖質(zhì)量比為20～50︰1，溫度為室溫至100℃，初步滅活至菌落總數(shù)小于1000cfu/g；然后過(guò)濾，水洗至中性；(2)所述的干燥采用常壓干燥、減壓干燥、或冷凍干燥，使殼聚糖含水量小于10%；(3)所述的充氮密封取一定量殼聚糖至適當(dāng)?shù)娜萜髦?，充氮?dú)獠⒘⒓疵芊?，以降低氧的分壓，減少輻照產(chǎn)生的活性氧，減少輻照對(duì)殼聚糖的降解；(4)所述的控溫輻照密封后的殼聚糖在溫度 20～30℃條件下，以10～50kGy的γ 射線輻照；經(jīng)控溫輻照后，殼聚糖中感染性病毒的殘留滴度≤0.5 lg TCID50；菌落數(shù)降低至≤10cfu/g。
全文摘要
一種殼聚糖的病原微生物滅活方法，屬于生物材料加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是采用NaOH溶液對(duì)殼聚糖中病原微生物進(jìn)行初步滅活，然后將殼聚糖干燥，充氮并密封，在-20～30℃條件下進(jìn)行10～50kGy的γ-射線輻照，將殼聚糖中可能存在的病原微生物滅活，保證殼聚糖作為生物材料的安全性。與現(xiàn)有病原微生物滅活方法相比，本發(fā)明具有在保證有效殺滅細(xì)菌、病毒等病原微生物的同時(shí)，殼聚糖的脫乙酰度、結(jié)晶度等質(zhì)量指標(biāo)不變，分子量的降低程度顯著低于其他滅活方法，在保證有效的殺滅可能污染的病原微生物的同時(shí)，維持該生物材料的質(zhì)量和功能。
文檔編號(hào)A61L2/08GK101983725SQ20101054770
公開(kāi)日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者夏文水, 張家驪, 李博 申請(qǐng)人:江南大學(xué)