專利名稱：在培養(yǎng)物中復(fù)制流感病毒的方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2006年12月15日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)60/875287和2006年12月28日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)60/882412的優(yōu)先權(quán)，二者均納入本文作為參考。
背景技術(shù)：
人們已認(rèn)識(shí)流感流行和大流行達(dá)數(shù)個(gè)世紀(jì)，并且它已經(jīng)導(dǎo)致了相當(dāng)多的生命喪失。流感病毒是一種分段的含有RNA的病毒，屬于正黏病毒科。流行和大流行是由具有在人群中很少有免疫性的新包膜成分的病毒引起的。這些新成分通常為人類和動(dòng)物流感病毒突變和/或混合的結(jié)果。
然而，流感病毒的衣殼為略微多晶的，其外表面與所有病毒一致，由脂質(zhì)包膜組成，從脂質(zhì)包膜上伸出兩種突出的糖蛋白棘血細(xì)胞凝集素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)。有三種類型的流感病毒A、B和C型。僅A型流感病毒基于兩種主要的表面糖蛋白HA和NA進(jìn)一步分類為亞型。A型流感亞型根據(jù)病毒株進(jìn)一步分類。B型流感病毒僅感染哺乳動(dòng)物并在人中致病，但一般不如A型嚴(yán)重。C型流感病毒也僅僅感染哺乳動(dòng)物，但僅在兒童引起非常輕的呼吸道疾病。它們?cè)谶z傳學(xué)上和形態(tài)學(xué)上與A和B型不同。
A型流感病毒感染很多種動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，如，人、馬、狗、豬、白鼬、鳥類，如鴨、雞和火雞。有16種已知HA血清型和9種已知NA血清型。鳥類為特別重要的儲(chǔ)存庫(kù)，其生成遺傳學(xué)上/抗原學(xué)上不同的病毒的庫(kù)，所述病毒通過人和動(dòng)物之間的近距離接觸轉(zhuǎn)移到人群中。豬可感染人類和鳥類流感株。因?yàn)檫@種不尋常的特征，當(dāng)同一細(xì)胞感染兩種類型的病毒時(shí)，豬被認(rèn)為是允許鳥類和人類病毒之間基因交換的“混合容器”。
流感病毒基因組由分成8段的單鏈(-)有義RNA組成(C型流感為7段)。因?yàn)橐呀?jīng)作出了大量遺傳學(xué)研究(傳統(tǒng)和分子)基因組結(jié)構(gòu)是詳知的。每段編碼一種或兩種病毒蛋白。人們相信流行和大流行是因?yàn)榱鞲胁《綡A和NA蛋白的兩種不同的方式的遺傳改變而引起抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變?？乖平?jīng)常發(fā)生，而抗原轉(zhuǎn)變僅僅偶爾發(fā)生。A型流感病毒進(jìn)行兩種變化，B型流感病毒僅通過更漸進(jìn)性的過程抗原漂移而變化。
抗原漂移是指通過兩個(gè)基因中的點(diǎn)突變發(fā)生的小而漸進(jìn)的變化，所述兩個(gè)基因包含產(chǎn)生主要表面蛋白HA和NA的遺傳物質(zhì)。抗原轉(zhuǎn)變是指在人中產(chǎn)生目前不在人群中流行的新的A型流感病毒亞型的突然而大的變化?？乖D(zhuǎn)變可通過動(dòng)物(家禽)與人的直接傳播發(fā)生，或通過A型人流感和A型動(dòng)物流感病毒基因混合而通過被稱為遺傳重配的過程產(chǎn)生新的A型人流感病毒亞型?？乖D(zhuǎn)變產(chǎn)生新的A型人流感亞型。當(dāng)兩種不同的流感病毒感染相同細(xì)胞并平分或交換一個(gè)或多個(gè)RNA片段時(shí)發(fā)生遺傳重配。例如，如果轉(zhuǎn)移的片段是HA，則可導(dǎo)致新的病毒株出現(xiàn)，所述病毒株在抗原上為新型，并且進(jìn)入人群時(shí)具有很少或沒有免疫性。這個(gè)結(jié)果可導(dǎo)致流行和/或大流行。
流感病毒進(jìn)入細(xì)胞能通過HA棘與含有N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA＝唾液酸)端基的粘蛋白結(jié)合而變?nèi)菀?。結(jié)合后，顆粒通過內(nèi)吞作用經(jīng)包被的凹陷卷入形成內(nèi)吞囊泡，最后形成核內(nèi)體。這些被細(xì)胞酸化并且在約pH5.0下，HA單體在核內(nèi)體中被類胰蛋白酶裂解以激活它們內(nèi)化。一旦內(nèi)化，則發(fā)生病毒復(fù)制并產(chǎn)生流感癥狀。
人們對(duì)最近的流感爆發(fā)相當(dāng)關(guān)注。業(yè)已在狗中鑒別出因犬流感病毒(CIV)所致的一種嚴(yán)重呼吸道疾病。這種呼吸道疾病已被證實(shí)有高度傳染性。而且，CIV可引起100％的感染率和80％的發(fā)病率，以及在嚴(yán)重感染中高達(dá)5-8％的死亡率。自從2004年在靈提賽犬中首次檢出(Crawford等人，Science 310(5747)482-485(2005))，CIV已經(jīng)很快蔓延至全美國(guó)，其中至少25個(gè)州報(bào)道CIV爆發(fā)，并且二十七個(gè)州報(bào)道CIV血清陽(yáng)性。
引起最近爆發(fā)的CIV血清型是H3N8。這種CIV血清型最初在馬中發(fā)現(xiàn)， 認(rèn)為它是越過種屬障礙進(jìn)入犬類?？赡芸谷鞲胁《居行б呙绲娜狈υ谶@種病毒在狗中快速而廣泛的傳播中起重要作用。
A型流感(H5N1，禽流感)病毒也稱為“H5N1病毒”，是一種A型流感病毒亞型，主要在鳥類中發(fā)生，在鳥類中有高度傳染性，對(duì)鳥類可致死。H5N1病毒不經(jīng)常感染人類，但這些病毒感染在人類中發(fā)生過。迄今為止，已在10個(gè)國(guó)家(主要在亞洲)報(bào)道了超過200例的人類確診病例，這些病例導(dǎo)致了150余人死亡。幸運(yùn)的是，這種病毒還不容易從鳥類傳播至人類或在人類之間互相傳播。然而，這有可能發(fā)生，導(dǎo)致流行或大流行。防止與流行或大流行相關(guān)的發(fā)病率和致死率的最佳策略是疫苗接種。
目前給予人類的流感疫苗在預(yù)防住院治療和死亡方面有很高的性價(jià)比，然而，季節(jié)性疫苗的世界年產(chǎn)量有限，并且不能實(shí)際地覆蓋全球高風(fēng)險(xiǎn)人群?，F(xiàn)有疫苗是用自世界衛(wèi)生組織(WHO)或疾病控制中心(CDC)獲得的病毒在蛋中制成，WHO和CDC每年為疫苗生產(chǎn)提供病毒種子。流行病毒的HA變化(抗原漂移)需要在流感兩次爆發(fā)期間周期性置換疫苗株。WHO發(fā)表了包括南半球和北半球所包括的半年推薦株。為允許有足夠的時(shí)間生產(chǎn)，WHO在二月測(cè)定哪個(gè)疫苗株應(yīng)包括在下個(gè)冬天的疫苗內(nèi)。一般來(lái)說(shuō)，成人一個(gè)劑量含有45μg HA(15μg每種，3種病毒)的等同物。這個(gè)劑量大約為從為一個(gè)感染的含胚雞蛋的尿囊液中得到的純化的病毒的量。如果制備1億劑量的滅活的流感病毒疫苗，制造商必須獲得1億個(gè)含胚雞蛋。這使得疫苗生產(chǎn)依賴于高質(zhì)量含胚雞蛋的時(shí)間可行性和WHO/CDC提供的種子株。大部分原型種子株甚至在含胚雞蛋中也不容易生長(zhǎng)至高效價(jià)。要克服這個(gè)困難問題，政府機(jī)關(guān)首先要通過與高產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)室株A/PR/8/34經(jīng)典重配(以6∶2重配從A/PR/8/34株中得到6個(gè)片段)創(chuàng)造出高產(chǎn)率的實(shí)驗(yàn)室株。遺憾的是，這個(gè)方法可能很難做到，并且可能影響所得到的疫苗的抗原性。因此，需要提供生產(chǎn)疫苗的替代方法以預(yù)防由流感、特別是高度致病株如H5N1引起的臨床疾病。還有，仍然需要提供在快得足以有效預(yù)防可能的流行和/或大流行的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量救生流感疫苗的方法。本發(fā)明解決這些和其他需求。
本文所引用的任何參考不應(yīng)被理解為允許這種參考作為本申請(qǐng)的“現(xiàn)有技術(shù)”。
發(fā)明簡(jiǎn)述 本發(fā)明涉及預(yù)防A型和B型流感感染的疫苗。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的疫苗和方法，本發(fā)明的疫苗和相關(guān)方法提供大量?jī)?yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明的疫苗用組織培養(yǎng)細(xì)胞代替含胚雞蛋生產(chǎn)。所述創(chuàng)造性生產(chǎn)方法通過省略傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)步驟而節(jié)約了關(guān)鍵時(shí)間。另外，本發(fā)明的疫苗可用于那些對(duì)蛋物質(zhì)過敏者。本發(fā)明還提供可在疫苗中應(yīng)用的新型免疫原性組合物。這些新型免疫原性組合物可用于免疫動(dòng)物，包括鳥類，以抵抗流感。在本法明的具體實(shí)施方式
中，疫苗接受者為哺乳動(dòng)物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供保護(hù)犬類抵抗犬流感病毒(CIV)所致的犬呼吸道疾病的疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供保護(hù)人類抵抗通過遺傳重配自然產(chǎn)生的流感病毒株的疫苗。
本發(fā)明提供流感病毒分離物，其特別適于在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，改造的流感病毒分離物根據(jù)其在所選擇的組織培養(yǎng)細(xì)胞系中生長(zhǎng)的能力，用有限稀釋克隆(limit dilution cloning)選擇。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，通過將包含大量流感亞群的一些流感病毒通過系列稀釋為大量等分試樣，來(lái)選擇適于在培養(yǎng)細(xì)胞系中生長(zhǎng)的流感病毒亞群。然后大量等分試樣與培養(yǎng)的細(xì)胞系接觸，和/或在培養(yǎng)的細(xì)胞系中生長(zhǎng)。大量流感病毒亞群中的一個(gè)流感病毒亞群經(jīng)檢測(cè)被鑒別為以低感染復(fù)數(shù)(MOI)在培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感病毒亞群，并被選為適于在培養(yǎng)細(xì)胞系中生長(zhǎng)的流感病毒亞群。在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供如下方法，其包括使所述適于組織培養(yǎng)的分離物與組織培養(yǎng)細(xì)胞接觸，使所述細(xì)胞生長(zhǎng)一段足以產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的時(shí)間。此方法也可包括收獲流感病毒。在一些這樣的實(shí)施方式中，所述有限稀釋克隆方法包括系列稀釋流感病毒分離物，并使每種稀釋物與培養(yǎng)細(xì)胞接觸，使所述細(xì)胞生長(zhǎng)一段足以產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的時(shí)間，從致CPE的最高倍稀釋物中收獲病毒，并用收獲的病毒重復(fù)所述方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法也包括使所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶混合，然后與所述培養(yǎng)細(xì)胞接觸。在一些實(shí)施方式中，孵育所述混合物一段足以允許胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細(xì)胞從基底脫離的時(shí)間。用于裂解病毒蛋白的胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。在某些情況下，使適于組織培養(yǎng)的分離物與組織培養(yǎng)細(xì)胞接觸的步驟在感染復(fù)數(shù)(MOI)小于約0.01，包括小于約0.001和/或小于約0.0001的情況下進(jìn)行。在其他情況下，所述流感病毒分離物首先在組織培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)，以測(cè)定最適MOI。所述組織培養(yǎng)細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞，如，人胚胎腎細(xì)胞。所述流感病毒可為A、B和C型流感病毒。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述流感A病毒為H5N1株。所述流感病毒分離物可從任何來(lái)源得到，包括如鼻拭子、肺組織，和/或可由第三方提供，如WHO。在一些實(shí)施方式中，所述流感病毒分離物起初在含胚雞蛋中生長(zhǎng)，以得到大量適于組織培養(yǎng)的接種物。一些方法包括純化所收獲的病毒。在一個(gè)這樣的方法中，所述純化步驟用尺寸排阻層析進(jìn)行。本發(fā)明的方法也可包括在純化之前、之中或之后將流感病毒第二分離物與第一分離物混合，這種第二分離物是與第一分離物不同的株。在一些方法中，劑量效價(jià)研究在混合兩種病毒分離物之前進(jìn)行以測(cè)定病毒蛋白具有相等免疫原性的混合物。在一些實(shí)施方式中，流感被滅活。在這種類型的一些實(shí)施方式中，流感病毒用能有效滅活病毒的量的二乙烯亞胺(binary ethyleneimine)處理。在一些方法中，當(dāng)血細(xì)胞凝集素蛋白含量最高時(shí)進(jìn)行收獲。
其他實(shí)施方式包括通過收獲由以下方法制備的病毒分離物來(lái)制備的疫苗選擇在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感病毒，其通過用有限稀釋克隆滴定流感病毒分離物以便選擇適應(yīng)于組織培養(yǎng)細(xì)胞的流感病毒分離物。在一些實(shí)施方式中，所述病毒通過絨膜尿囊(也稱為尿囊腔)或羊膜接種途徑，由特異性無(wú)病原含胚雞蛋接種制備，然后進(jìn)行有限稀釋克隆。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述流感病毒首先通過含胚雞蛋的羊膜接種復(fù)制以得到適于組織培養(yǎng)細(xì)胞的接種物。
另外，本發(fā)明提供選擇在人胚胎腎細(xì)胞生長(zhǎng)的流感病毒的方法。在一個(gè)這樣的方法中，流感病毒分離物用有限稀釋克隆滴定以便選擇適于HEK細(xì)胞的流感病毒分離物。這種方法可包括適于HEK的分離物與HEK細(xì)胞接觸，以及使所述細(xì)胞生長(zhǎng)一段足以產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的時(shí)間。在這種類型的具體實(shí)施方式
中，收獲所得到的流感病毒。本發(fā)明也提供疫苗，所述疫苗包括通過這些方法得到的流感病毒分離物。所述方法也包括使所述流感病毒分離物與有效量的IX型胰蛋白酶混合，然后與所述培養(yǎng)細(xì)胞接觸一段足以使胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細(xì)胞脫離基底的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方式中，使適于HEK的分離物與HEK細(xì)胞接觸的步驟在MOI小于約0.001的條件下進(jìn)行。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小于4μg人流感HA配制的人流感病毒。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小于3μg人流感HA配制的人流感病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量小于2μg人流感HA配制的人流感病毒。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗包括以每劑量1.5-3.5μg人流感HA配制的人流感病毒。在具體的疫苗實(shí)施方式中，佐劑為ISCOM。在其他疫苗實(shí)施方式中，至少70％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的實(shí)施方式中，至少80％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的實(shí)施方式中，至少90％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的實(shí)施方式中，多于95％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。
本發(fā)明還提供組合疫苗，以產(chǎn)生保護(hù)性免疫來(lái)抵抗流感病毒，如犬流感病毒(CIV)和其他疾病，如其他犬類傳染病。本發(fā)明還提供免疫哺乳動(dòng)物例如，狗、貓或馬抵抗流感的方法。也提供制備和使用傳染病(如犬類傳染病)的疫苗的方法。
在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的免疫原性組合物包括含有滅活CIVH3N8和佐劑的免疫原性組合物。所述佐劑通常包含水包油乳液。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，所述佐劑還包含氫氧化鋁。在這種類型的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述佐劑是

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性組合物是疫苗。
疫苗組合物可包括每劑量約100血細(xì)胞凝集單位(HAU)至1500HAU。這可根據(jù)接受治療的個(gè)體大小和其他健康因素而變化。所述組合物通常在每劑量250和750HAU之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疫苗組合物包括每劑量約500HAU。
本發(fā)明的疫苗可任選包括藥學(xué)上可接受的免疫刺激劑，如細(xì)胞因子；生長(zhǎng)因子；趨化因子；來(lái)自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或來(lái)自淋巴器官的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液；植物、細(xì)菌或寄生蟲的細(xì)胞制劑和/或提取液；或促細(xì)胞分裂劑。
本發(fā)明的疫苗可通過如下途徑給藥胃腸外給藥、肌肉注射、皮下注射、腹膜注射、皮內(nèi)注射、口服、鼻內(nèi)給藥、劃痕及上述的組合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，疫苗通過肌肉注射給藥。
本發(fā)明還提供含有與CIV H3N8結(jié)合的抗體的來(lái)自接種動(dòng)物的血清，以及純化抗體本身。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，與CIV H3N8結(jié)合的純化抗體是嵌合抗體。
本發(fā)明還提供組合疫苗，所述組合疫苗包括一種或多種滅活CIV株(如CIV H3N8)與一種或多種包括下列的其他犬病原體和/或免疫原相組合，如對(duì)以下產(chǎn)生免疫的免疫原犬瘟病毒；犬腺病毒；犬腺病毒2型；犬細(xì)小病毒；犬副流感病毒；犬冠狀病毒；犬流感病毒；和/或鉤端螺旋體(Leptospira)血清型，如感冒傷寒型kirschneri血清型鉤端螺旋體(Leptospira kirschneriserovar grippotyphosa)、犬型問號(hào)血清型鉤端螺旋體(Leptospira interrogansserovar canicola)、出血性黃疸問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogansicterohaemorrhagiae)和/或波蒙納問號(hào)血清型鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans serovar pomona)?？杉尤氡景l(fā)明的聯(lián)合疫苗的其他犬病原體包括支氣管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；利什曼(Leishmania)生物，如成人利什曼蟲(Leishmania major)和嬰兒利什曼蟲(Leishmaniainfantum)；包柔氏螺旋體(Borrelia)屬螺旋體，包括狹義上的(ss)博氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、博氏疏螺旋體ss、博氏疏螺旋體加利尼(B.garinii)和博氏疏螺旋體阿滋利(B.afzelii)；支原體屬(如犬支原體)；狂犬病病毒和犬艾希體(Ehrlichia canis)。
本發(fā)明提供在培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)CIV H3N8的方法。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)細(xì)胞是非犬的哺乳動(dòng)物腎細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為馬-達(dá)氏(Madin-Darby)牛腎(MDBK)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為Vero細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供包含以小于每劑量500HAU配制的CIV H3N8的疫苗。在這些實(shí)施方式中，佐劑通常為氫氧化鋁，并且至少70％，通常至少90％的HA具有相同氨基酸序列。在其他疫苗實(shí)施方式中，至少80％的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。在另外的疫苗實(shí)施方式中，多于95％的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。
本發(fā)明的這些和其他方面將通過參考以下附圖和實(shí)施方式得到更好的理解。



圖1顯示CIV感染狗之后的平均臨床評(píng)分。用CIV感染非接種對(duì)照和接種的狗，并從感染后-2天至10天每日監(jiān)測(cè)臨床征象，如眼和鼻排出物、噴嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困難。所述臨床征象根據(jù)實(shí)施例1所述的指南評(píng)分，并將每個(gè)處理組的臨床評(píng)分對(duì)天數(shù)作圖。
圖2證明感染后狗的鼻CIV釋出。用CIV感染非接種對(duì)照和接種狗。在感染前一天(-1天)收集鼻拭子以證實(shí)狗沒有感染CIV。通過每天收集鼻拭子10天(感染后1天至10天)在感染狗中監(jiān)測(cè)鼻病毒釋出，并在單層MDCK上進(jìn)行滴定。每個(gè)處理組的平均病毒效價(jià)以Log10 TCID50/mL表示，計(jì)算并對(duì)感染后天數(shù)作圖。
發(fā)明詳述 生產(chǎn)流感疫苗的傳統(tǒng)方法包括在含胚母雞蛋中分離株的生長(zhǎng)，這至少部分是因?yàn)殡u蛋廉價(jià)且有效，并且因?yàn)闆]有大量生長(zhǎng)流感的明顯替代選擇。在人流感的情況下這尤其確切，因?yàn)楹芏嗫捎糜诜敝沉鞲胁《镜募?xì)胞系還沒有經(jīng)FDA認(rèn)證用于人類疫苗生產(chǎn)，并且在組織培養(yǎng)中僅得到了很低的效價(jià)。
當(dāng)疫苗在雞蛋中生產(chǎn)時(shí)，一般如下制備。最初，從咽拭子或相似的來(lái)源回收病毒，在雞蛋中分離。最初在雞蛋中的分離很困難，但病毒適應(yīng)雞蛋宿主并且其后在雞蛋中的繁殖相對(duì)較容易。在雞蛋中生長(zhǎng)后，純化病毒，并用福爾馬林或β-丙內(nèi)酯滅活。生長(zhǎng)跡象表明雞蛋不是最適于病毒繁殖的。例如，用于基于雞蛋的生產(chǎn)的常規(guī)產(chǎn)蛋雞群具有使病毒制劑受到在這些裝置中常見的內(nèi)生病毒污染的較高風(fēng)險(xiǎn)。而且，成千上萬(wàn)的雞蛋的分離接種和收集以及復(fù)雜的下游加工步驟導(dǎo)致大量時(shí)機(jī)能將環(huán)境污染物引入病毒制劑，這很有可能是2004年某次疫苗召回的原因。如前所述，很難完全移除雞蛋物質(zhì)，而這可能導(dǎo)致對(duì)疫苗的敏感性。此外，所述加工完全缺乏在需要突然增加時(shí)的靈活性，這是因?yàn)闆]有大量適合的雞蛋可用而造成的物流問題。也有證據(jù)表明在雞蛋中生長(zhǎng)可降低病毒的抗原性。一致的，在雞蛋中生長(zhǎng)A或B型流感病毒會(huì)生成具有HA突變譜的異源病毒產(chǎn)物。相反，在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中相應(yīng)生長(zhǎng)的病毒則生成結(jié)構(gòu)與最初分離的那些相同的流感病毒(Rocha，等人，J.Gen.Virol 1993；742513-2518)。而且，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感病毒更容易得到在人血清中中和并且HA抑制的抗體，且抗體效價(jià)高于雞蛋中生長(zhǎng)的對(duì)照(Oxford，等人，Bull WHO 1987；65181-187)。
遺憾的是，所有流感病毒株看來(lái)均在雞蛋中生長(zhǎng)，而迄今很多流感病毒株在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)不佳，且其中在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的那些經(jīng)常不能以產(chǎn)生有效疫苗所需的量生長(zhǎng)。本發(fā)明人現(xiàn)在公開了當(dāng)用有限稀釋克隆(limiting dilution cloning)使病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)時(shí)，可產(chǎn)生適于組織培養(yǎng)的分離物。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在組織培養(yǎng)細(xì)胞(如，Vero細(xì)胞)中繁殖時(shí)，由通過含胚雞蛋的羊膜接種得到的病毒的復(fù)制能產(chǎn)生可以復(fù)制并產(chǎn)生高水平HA的病毒群。所得到的病毒分離物產(chǎn)生的HA效價(jià)幾乎與用含胚雞蛋得到的效價(jià)相等，而HA效價(jià)為疫苗效力的一個(gè)重要量度。因此，本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及生產(chǎn)適于組織培養(yǎng)和適用于流感疫苗(尤其是哺乳動(dòng)物疫苗)生產(chǎn)的流感病毒分離物的方法。所述方法涉及使用有限稀釋克隆來(lái)分離和鑒定適于組織培養(yǎng)的病毒。所得到的分離物可經(jīng)處理以生產(chǎn)疫苗。因此，本發(fā)明也涉及生產(chǎn)改進(jìn)的流感病毒疫苗的方法。
為此，本發(fā)明提供選擇適于組織培養(yǎng)的流感病毒的方法，該方法通過用有限稀釋克隆滴定病毒并重復(fù)該過程2次或更多次來(lái)達(dá)成。在一些方法中，所用組織培養(yǎng)細(xì)胞是HEK細(xì)胞?？捎靡鹊鞍酌富虻韧鞍酌冈黾硬《具M(jìn)入細(xì)胞的效率。其他方法包括滴定胰蛋白酶以確定所使用的胰蛋白酶批次和所用細(xì)胞的最佳濃度。對(duì)所用的每一種流感病毒以及對(duì)具體細(xì)胞最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)的測(cè)定也有助于組織培養(yǎng)繁殖成功。分離的適于組織培養(yǎng)的病毒可用來(lái)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)疫苗。在一些實(shí)施方式中，所述疫苗包括佐劑ISCOM的使用。在一些實(shí)施方式中，所述疫苗包括佐劑氫氧化鋁的使用。當(dāng)疫苗中包括超過一種的病毒株或分離物時(shí)，所述方法可包括以免疫學(xué)等量混合兩種物質(zhì)。本發(fā)明提供適于組織培養(yǎng)的病毒分離物和由此制成的疫苗的方法和組合物。
I.選擇適于組織培養(yǎng)的病毒的方法 用于本發(fā)明方法的病毒來(lái)源對(duì)本發(fā)明不重要。例如，病毒可從感染的動(dòng)物或患者分離得到；作為WHO的種子病毒原液，可從適當(dāng)?shù)慕M織(如，ATCC)購(gòu)買得到；或從科研實(shí)驗(yàn)室得到。具體來(lái)說(shuō)，已知CIV引起包括肺炎的嚴(yán)重呼吸道疾病。因此，顯示這些癥狀的狗是可用的來(lái)源。分離病毒的適合標(biāo)本包括鼻洗滌物/抽出物、鼻咽拭子、咽喉拭子、支氣管肺清洗物、氣管抽出物、胸膜穿刺液、唾液、泄殖腔涂片和尸體解剖標(biāo)本。來(lái)自活體動(dòng)物的標(biāo)本優(yōu)選早期收集，且在某些情況下，在發(fā)病后4天內(nèi)收集。標(biāo)本可用適合的運(yùn)輸介質(zhì)收集，并貯存在該介質(zhì)中直至使用，或者立即使用。如果貯存，則病毒可在較低溫下保存，如在4℃下，以保證其存活力。要從標(biāo)本中分離流感病毒，可以移除大量污染物(如，通過離心)并將上清液接種到各種稀釋倍數(shù)的各種細(xì)胞?；蛘?，來(lái)自動(dòng)物的病毒最初可在母雞雞蛋中生長(zhǎng)?？捎梅椒ㄗC實(shí)在過程中的任何時(shí)間點(diǎn)的病毒分離物確實(shí)是流感。
可用各種篩選方法證實(shí)所需流感病毒存在于制備適于組織培養(yǎng)的分離物的過程中的任何時(shí)間?？赏ㄟ^使用任何已知和/或適合的測(cè)定流感病毒的測(cè)定來(lái)篩選病毒。這種測(cè)定包括(單獨(dú)或組合)用如逆遺傳學(xué)、重配、互補(bǔ)和/或感染的方法進(jìn)行的病毒復(fù)制、定量和/或定性滅活測(cè)量(如，通過抗血清)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯、病毒體合并、病毒力、HA或NA活性、病毒產(chǎn)率和/或形態(tài)發(fā)生。
A.組織培養(yǎng)細(xì)胞 允許流感病毒生長(zhǎng)的任何哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可用于本發(fā)明的方法。通常，所述宿主細(xì)胞適合排除外源因子，具有可根據(jù)WHO對(duì)疫苗生產(chǎn)的要求確認(rèn)的傳代數(shù)。很多細(xì)胞系可用于分離和繁殖流感病毒。已使用的一些細(xì)胞系包括Vero細(xì)胞(猴腎細(xì)胞)、MDCK細(xì)胞(馬-達(dá)氏犬腎細(xì)胞))、BHK-21細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎)和BSC(猴腎細(xì)胞)和HEK細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞)。因此，可用允許流感病毒生長(zhǎng)的任何組織培養(yǎng)細(xì)胞。適合的細(xì)胞包括但不限于Vero、MDBK、BK21、CV-1和任何哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞(如，HEK)。在一些實(shí)施方式中，使用Vero細(xì)胞或哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，使用人胚胎腎細(xì)胞(HEK細(xì)胞)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知用于上述細(xì)胞系繁殖的適合組織培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基可含有濃度高達(dá)20％v/v的適合血清(如，胎牛血清)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，可以使用含有少于20％v/v血清(2-5％v/v)的培養(yǎng)基來(lái)繁殖上述細(xì)胞系。
B.優(yōu)化用于細(xì)胞的胰蛋白酶 為了在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)出高效價(jià)的病毒原液，可用適量的蛋白酶活化血細(xì)胞凝集素，使之內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)。含有蛋白酶的溶液可直接加入到分離物中，或分離物可稀釋至用于疫苗生產(chǎn)的分離物生長(zhǎng)的蛋白酶中。所述蛋白酶可用來(lái)將病毒稀釋至適合生長(zhǎng)的MOI。
蛋白酶可為能激活HA內(nèi)化而不破壞病毒蛋白使其不能生長(zhǎng)和/或感染細(xì)胞的任何蛋白酶。這些蛋白酶包括但不限于原核生物蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶和枯草菌蛋白酶(A)，例如，IX型胰蛋白酶。
所用的蛋白酶的量應(yīng)足以激活病毒，并且對(duì)細(xì)胞的毒效非常小。毒效可通過鑒定對(duì)細(xì)胞的損傷特征來(lái)分析，如脫離平板或基底、存在細(xì)胞碎片、出現(xiàn)死細(xì)胞和缺乏活力的細(xì)胞。因此，“有效量的胰蛋白酶”是指，當(dāng)其使用足夠時(shí)間時(shí)，允許胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使細(xì)胞從基底分離或引起其他毒效者。也可使用蛋白酶滴定來(lái)增加組織培養(yǎng)中活性病毒的產(chǎn)量。滴定包括確定引起細(xì)胞最小損傷程度的胰蛋白酶的最大量。這個(gè)量可隨所用的組織培養(yǎng)細(xì)胞以及蛋白酶批次而變化。因此，可在使用之前滴定新的蛋白酶批次以建立最適水平，且每個(gè)蛋白酶可對(duì)每種組織培養(yǎng)細(xì)胞滴定。滴定涉及用所述蛋白酶分步稀釋接種組織培養(yǎng)細(xì)胞并將其孵育一段合適的時(shí)間。例如，可用蛋白酶半步稀釋(10-0.5)。孵育時(shí)間隨細(xì)胞系變化，但通常在約2天和7天之間。蛋白酶水平可用所用細(xì)胞的通常孵育時(shí)間測(cè)定。例如，如果4天孵育對(duì)流感病毒最好，則蛋白酶可通過在蛋白酶單獨(dú)存在下孵育約4天測(cè)試。然后可用對(duì)細(xì)胞沒有毒性或毒性非常低的蛋白酶最低倍稀釋物。可用于哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞(如Vero細(xì)胞)的胰蛋白酶濃度范圍為約0.5μg/mL至約10μg/mL，但更常用約2.5μg/mL培養(yǎng)基。
一旦蛋白酶的最適水平確定，病毒可在含有適量蛋白酶(如，胰蛋白酶)的感染培養(yǎng)基中稀釋，以便當(dāng)病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)達(dá)到最適水平。最適量的胰蛋白酶可用于有限稀釋克隆以產(chǎn)生適于組織培養(yǎng)的分離物以及用于所述分離物的生長(zhǎng)和收獲。
C.有限稀釋克隆 典型的病毒培養(yǎng)物是異源的。因此，例如在微滴定板的孔中的單個(gè)病毒顆粒在傳染性、復(fù)制等方面可以變化。系列稀釋用于選擇培養(yǎng)中的病毒亞群，例如，最適于細(xì)胞的亞群。系列稀釋涉及系列地稀釋病毒培養(yǎng)物直至不含病毒，例如，用來(lái)測(cè)定最佳MOI。這通常涉及一系列10倍稀釋，但可根據(jù)病毒效價(jià)變化。
有限稀釋通常用于鑒定對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生病毒效應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)。所述病毒效應(yīng)可為致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。致細(xì)胞病變效應(yīng)為流感病毒感染引起的對(duì)細(xì)胞的任何效應(yīng)。這些效應(yīng)包括但不限于細(xì)胞變圓(cell rounding)、退化、脫落、凋亡、活性氧物質(zhì)(ROS)誘導(dǎo)、細(xì)胞變成顆粒狀然后成片段化，以及細(xì)胞脫離支持物(如組織培養(yǎng)皿)。收獲最高倍稀釋物的孔。然后將所收獲的病毒稀釋至不含病毒，并且重復(fù)該過程。系列10倍稀釋液通常用適合的培養(yǎng)基配制(含或不含胰蛋白酶)，且將0.2mL的每種稀釋液加入含有組織培養(yǎng)細(xì)胞的平板或微滴定板的孔中，并孵育一段足以鑒定細(xì)胞的CPE的時(shí)間。因?yàn)檠鍦缁钜鹊鞍酌?，所以培養(yǎng)基通常不含血清。收獲含有引起CPE的最高倍稀釋物的孔或平板，然后稀釋，并且重復(fù)該過程。該過程通常重復(fù)至少兩次，但可重復(fù)多達(dá)5次。在一些情況下，該過程重復(fù)3次。
通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒培養(yǎng)物特征在于病毒中HA蛋白序列的同質(zhì)性。有很多方法可用于測(cè)量序列同質(zhì)性程度。例如，對(duì)HA蛋白本身測(cè)序或通過對(duì)編碼這種蛋白的RNA測(cè)序。本發(fā)明的方法生產(chǎn)的病毒制劑通常含有其中至少70％的HA蛋白具有相同氨基酸序列的病毒。在一些實(shí)施方式中為80％，或至少90％的HA蛋白具有相同氨基酸序列。
D.檢測(cè)流感病毒的方法 可進(jìn)行檢測(cè)以證實(shí)在本法明方法的過程中任何時(shí)間流感病毒的活性和存在。例如，可如下鑒定血細(xì)胞凝集。如果病毒具有表面HA蛋白，其可附著在RBC上并使其凝集。如果樣品中病毒濃度很高，則當(dāng)樣品與RBC混合時(shí)，將形成病毒和RBC晶格。這種現(xiàn)象稱為血細(xì)胞凝集。這是一種檢測(cè)使血細(xì)胞凝集的病毒(如流感病毒)的存在和效價(jià)的簡(jiǎn)單方法。如果樣品中沒有足夠病毒使RBC血細(xì)胞凝集，則它們?cè)诳椎牡撞啃纬尚∏?。以顯示完全血細(xì)胞凝集的最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)。病毒效價(jià)表達(dá)為HA單位(HAU)，為每毫升稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。例如，在50μL中1/32倍稀釋時(shí)孔中有完全血細(xì)胞凝集，但在下一個(gè)最高稀釋倍數(shù)的孔中沒有，則所述病毒效價(jià)為每50μL32HAU或每mL 640HAU。
可用于鑒別和定量流感病毒的其他測(cè)定包括CPE測(cè)定(如本文所討論)，Western印跡(Western blot)、ELISA、PCR和用對(duì)病毒某些部分(具體來(lái)說(shuō)，為HA抗原)有特異性的抗體和/或探針鑒別流感病毒的其他方法。
II.生長(zhǎng)和收獲方法 在生產(chǎn)病毒分離物之后，收獲所述分離物?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法。所收獲的分離物可儲(chǔ)存供以后使用，或可用于用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)疫苗。當(dāng)產(chǎn)生最大量病毒時(shí)；當(dāng)產(chǎn)生最大量血細(xì)胞凝集素時(shí)，如用HA測(cè)定方法測(cè)量；和/或當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)，可收獲病毒。
在得到適于組織培養(yǎng)的分離物后，所述分離物可生長(zhǎng)并收獲。生長(zhǎng)和收獲適于組織培養(yǎng)的病毒的方法對(duì)本發(fā)明不重要，并且可用標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，在一些實(shí)施方式中，病毒在其最適的組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)。所收獲的病毒分離物可儲(chǔ)存供以后使用，或可用于用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)疫苗?？赏ㄟ^在適量的蛋白酶(如胰蛋白酶)中以適合的MOI將病毒加入細(xì)胞中，使病毒在適合的組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)一段足以產(chǎn)生高效價(jià)的病毒和/或直至細(xì)胞裂解的時(shí)間。當(dāng)產(chǎn)生最大量病毒時(shí)；當(dāng)產(chǎn)生最大量血細(xì)胞凝集素時(shí)；和/或當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)，可收獲病毒。本文業(yè)已發(fā)現(xiàn)，病毒在雞蛋中(在尿囊腔或通過羊膜接種)的最適預(yù)生長(zhǎng)可增強(qiáng)病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞中的適應(yīng)性。
A.在雞蛋中的預(yù)生長(zhǎng) 雞蛋培養(yǎng)物的傳代顯示能促進(jìn)病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞中的適應(yīng)性。因此，使病毒分離物在含胚母雞雞蛋中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)預(yù)生長(zhǎng)是可取的。例如，所述病毒注射入尿囊腔或通過9-12天齡的含胚雞蛋的羊膜，并且使其擴(kuò)增約三天。然后收集尿囊液或羊膜液，收集的材料可以適合的MOI在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，用于疫苗生產(chǎn)?；蛘?，收集的材料可直接用于有限稀釋克隆。已發(fā)現(xiàn)，通過羊膜的雞蛋接種能濃集可復(fù)制的病毒，并且在Vero細(xì)胞中生長(zhǎng)時(shí)可以產(chǎn)生高水平的HA蛋白。
B.MOI 本文鑒定出低MOI產(chǎn)生較好和/或較高效價(jià)病毒分離物。不受具體理論的限制，人們相信低的MOI減少缺陷病毒顆粒的量，并且產(chǎn)生更有效的感染過程。在一些實(shí)施方式中，所用的MOI小于0.01(每100個(gè)細(xì)胞1個(gè)病毒)。在其他實(shí)施方式中，MOI小于0.003。在一些實(shí)施方式中，MOI小于0.001。MOI可選擇在約3至4天中產(chǎn)生高效價(jià)病毒和/或裂解細(xì)胞的最低MOI。
III.疫苗生產(chǎn) 一旦從適于組織培養(yǎng)的病毒得到所需的分離物，則病毒可用于生產(chǎn)疫苗。已知很多類型的病毒疫苗，包括但不限于減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和片段疫苗。
A.減毒病毒生產(chǎn)方法 減毒疫苗是已經(jīng)減毒或改變而不再引起疾病的活的病毒疫苗。這些可通過多種方法生產(chǎn)，例如，在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，重復(fù)傳代，并且遺傳操作突變或去除涉及致病的基因。適于組織培養(yǎng)的分離物可用于用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)減毒病毒。例如，一個(gè)病毒基因和/或蛋白經(jīng)鑒定涉及致病或涉及疾病表現(xiàn)，則其可被突變或改變以便所述病毒仍能在細(xì)胞內(nèi)感染和復(fù)制，但不引起疾病。一個(gè)這樣的實(shí)例是誘變HA1/HA2切割位點(diǎn)。所述適于組織培養(yǎng)的病毒可用任何標(biāo)準(zhǔn)方法減毒，例如，冷適應(yīng)病毒。
減毒病毒生產(chǎn)之后，可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備疫苗(如，本文的方法)?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法純化病毒，例如，用尺寸排阻層析。可用標(biāo)準(zhǔn)佐劑和疫苗制劑制備疫苗，如ISCOM、納米珠、礦物油、植物油、氫氧化鋁、皂甙、非離子去污劑、角鯊烯和嵌段共聚物，可單獨(dú)使用或作為輔助劑組合使用。目前美國(guó)和歐洲市售的疫苗不含任何佐劑(活疫苗和死疫苗)，這是疫苗中需要如此高濃度的HA(每病毒株15μg的HA，三價(jià)配方含45μg的HA)的部分原因。
B.滅活、亞單位和片段病毒疫苗生產(chǎn)方法 一旦得到所需病毒，可將其用于生產(chǎn)免疫原性組合物，例如，疫苗。“死”疫苗的實(shí)例是滅活、片段和亞單位疫苗。這些可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備以治療流感。
例如，亞單位疫苗一般涉及僅分離激活免疫系統(tǒng)的病毒部分。在有流感的情況下，用純化HA和NA制備亞單位疫苗，但病毒蛋白的任何混合物可用于生產(chǎn)亞單位疫苗。一般來(lái)說(shuō)，病毒蛋白(如HA)從重組病毒形式中提取，并且亞單位疫苗經(jīng)配制含有來(lái)自WHO推薦的病毒株的這些病毒蛋白的混合物。例如，1995-1996年的疫苗含有來(lái)自兩種A株和一種B株(A/Singapore/6/86(H1N1)；A/Johannesburg/33/94(H3N2)；和B/Beijing/84/93)的HA和NA。對(duì)于H3N8 CIV來(lái)說(shuō)，可用H3和/或N8抗原。
一般來(lái)說(shuō)，病毒蛋白從病毒中提取，并且亞單位疫苗經(jīng)配制含有這些病毒蛋白的混合物。蛋白可用標(biāo)準(zhǔn)方法從適于組織培養(yǎng)的分離物中分離用于亞單位疫苗。或者，蛋白可用重組技術(shù)生產(chǎn)。本領(lǐng)域已知生產(chǎn)具體蛋白的技術(shù)。
片段疫苗一般涉及用去污劑處理包膜病毒，以使其中的蛋白溶解。在流感病毒的情況下，HA和NA溶解。例如，可用非離子去污劑如Triton X-100生產(chǎn)片段疫苗。
滅活病毒疫苗通過滅活收獲的病毒并用已知方法配制來(lái)制備，以用作誘發(fā)哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的疫苗。滅活步驟、亞單位純化和/或片段可在尺寸排阻純化病毒之前或之后進(jìn)行。例如，滅活疫苗的生產(chǎn)可涉及去除細(xì)胞材料、滅活病毒、純化和溶解病毒包膜。其他實(shí)施方式可涉及病毒純化，然后滅活，例如，用甲醛。
一旦制備，任何疫苗(如，減毒、片段或滅活)可被檢測(cè)以確定所述病毒和/或疫苗保持相似的抗原性，在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生血清學(xué)反應(yīng)，和/或提供對(duì)抗哺乳動(dòng)物疾病的保護(hù)。
C.收獲病毒的進(jìn)一步加工 1.收獲病毒的凈化 收獲后和/或滅活收獲的病毒后，可以通過例如，沉淀去除微載體并通過滲濾濃縮上清液去除細(xì)胞材料和其他干擾材料。在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感將含有宿主細(xì)胞蛋白?？赡苄枰锨逡旱囊恍┻M(jìn)一步凈化。細(xì)胞DNA可通過酶處理(如，Benzonase)去除。在最初去除干擾材料之后，病毒可用標(biāo)準(zhǔn)方法滅活?；蛘?，可在通過，如尺寸排阻層析進(jìn)一步純化后進(jìn)行滅活。
2.病毒滅活 流感病毒可以任何方法和用任何試劑滅活。滅活方法對(duì)本發(fā)明不重要。滅活可發(fā)生在污染或干擾材料去除之后。滅活可包括使用任何已知滅活劑。這些滅活劑包括但不限于UV照射、甲醛、戊二醛、二乙烯亞胺(BEI)和β-丙內(nèi)酯。在一些實(shí)施方式中，用BEI是因?yàn)橐阎淦茐牟《竞怂岫黄茐牟《镜鞍?。此外，BEI不受蛋白含量和溫度的影響。滅活劑以高至足以滅活溶液中每個(gè)病毒顆粒的濃度使用。例如，BEI可以約0.5和10mM之間的終濃度使用，包括但不限于1.5、3、4、5和6mM，并且包括約1至6和1至3mM的范圍。在一實(shí)施方式中，BEI以約6mM的濃度使用。BEI通常以約1.5mM的濃度使用并且在37℃下孵育48小時(shí)。在CIV的疫苗制備中，BEI可以約0.5和10mM之間，通常為4至8mM，經(jīng)常為5和7mM之間的終濃度使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，BEI以約6mM的濃度使用。在一些實(shí)施方式中，滅活在對(duì)滅活劑適合的pH和溫度下發(fā)生?？蛇x擇pH和溫度以保證得到的滅活病毒仍然有免疫原性。滅活可在適當(dāng)?shù)臄嚢柘逻M(jìn)行以保證所述試劑與溶液中所有的病毒顆粒相接觸。
滅活后，可用以下方法去除滅活劑，該方法包括但不限于，滅活劑的滅活、滅活劑的沉淀、滅活劑的過濾，以及層析，或這些方法的混合。例如，BEI可通過加入硫代硫酸鈉滅活。殘留的BEI也可通過尺寸排阻方法從病毒/病毒蛋白分離。一旦確定無(wú)害(缺乏活病毒)，病毒溶液可進(jìn)一步加工以生產(chǎn)疫苗。
3.進(jìn)一步加工 可進(jìn)一步加工病毒溶液，例如，以去除污染物，進(jìn)一步濃縮病毒，以提供較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。進(jìn)一步加工的一些實(shí)例包括用標(biāo)準(zhǔn)方法最初去除細(xì)胞材料、去除細(xì)胞DNA、濃縮和在佐劑中配制。在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感含有宿主細(xì)胞蛋白。例如，在人胚胎腎細(xì)胞(HEK)中繁殖的流感將含有HEK蛋白，或如果在MDBK或VERO細(xì)胞中生長(zhǎng)，則分別含有牛或猴蛋白。這些蛋白可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法檢測(cè)。已知很多去除DNA的方法，包括加入各種已知降解細(xì)胞DNA的DNA酶，例如，Benzonase?？蛇M(jìn)行起始濃縮步驟以提供最適于進(jìn)一步層析純化的濃度的病毒溶液。這可用任何標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，包括但不限于用分子量截留為約100K的膜(如MWCO為100K的聚砜膜)進(jìn)行超濾。病毒溶液可濃縮至約100倍，包括但不限于90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍和5倍。在一些實(shí)施方式中，病毒溶液濃縮至約50倍，但更通常包括20倍和30倍。
4.純化 可用標(biāo)準(zhǔn)方法如密度離心純化病毒。在一些實(shí)施方式中，病毒通過尺寸排阻凝膠層析純化。使用尺寸排阻的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率優(yōu)于用密度離心純化?？捎玫玫讲《炯兓娜魏纬叽缗抛枘z?？捎萌魏螛?biāo)準(zhǔn)凝膠，如瓊脂糖凝膠(如Sepharose CL-2B)。在一些實(shí)施方式中，柱子長(zhǎng)度為約70至120cm以得到所需純化，包括但不限于約80、90、100和110。在其他實(shí)施方式中，柱子長(zhǎng)度為約80至100cm，例如柱子長(zhǎng)度為約90cm。在一些實(shí)施方式中，用多個(gè)柱子串聯(lián)可得到所述長(zhǎng)度，如兩個(gè)45cm的柱子或3個(gè)30cm的柱子(如，長(zhǎng)度為30-32cm，直徑為30cm的柱子)。濃縮的病毒可用標(biāo)準(zhǔn)方法上柱，如，所述病毒可以5-10％的柱體積(CV)，通常5-7％CV上柱。然后可以從柱子上收集病毒峰，用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，超濾)進(jìn)一步濃縮。在一些實(shí)施方式中，用總長(zhǎng)度為90cm的2至3個(gè)柱子串聯(lián)，聚集最終峰，用超濾濃縮。
5.包膜蛋白溶解 濃縮的病毒峰材料可用標(biāo)準(zhǔn)方法溶解，如用非離子去污劑?？梢赃M(jìn)行溶解以制備ISCOM配方的材料(見下文)。非離子去污劑的實(shí)例包括但不限于壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylfucamide)(Mega 9)、TritonX-100、辛基葡萄糖苷、毛地黃皂苷、C12E8、Lubrol、Nonidet P-40和Tween(如Tween 20、80或120)。溶解后，病毒可用于生產(chǎn)疫苗，和/或可加入佐劑。例如，對(duì)于ISCOM佐劑生產(chǎn)，可加入脂質(zhì)混合物，以有助于ISCOM形成。所述脂質(zhì)混合物可包括磷脂酰膽堿和合成膽固醇。在一些實(shí)施方式中，所述病毒在室溫下邊攪拌邊用Mega 9破壞，然后可加入脂質(zhì)混合物(磷脂酰膽堿和膽固醇)，并繼續(xù)攪拌。
6.佐劑形成 疫苗和/或藥物組合物中可加入適合的佐劑。佐劑的實(shí)例包括含有油和水的乳液的那些，以及還包含氫氧化鋁的那些。在后一種情況下，可使用市售的氫氧化鋁，例如，Alhydrogel，(Superfos Biosector，F(xiàn)rederikssund，Denmark)和Rehydrogel(Reheis Inc.)。油和水的乳液通常包含礦物油或可代謝的油(如，植物油、魚油)。非離子去污劑或表面活性劑可用作乳化劑。乳化劑的實(shí)例包括Tween 80/Span 80、Arlecel 80/Tween 80和Montanides(Seppic，Paris，F(xiàn)rance)。在佐劑乳液的情況下，一般5-25％的體積是油，75-95％的體積是水。在一些實(shí)施方式中，佐劑乳液為20％體積的油和80％體積的水。氫氧化鋁的量一般為水相的約5％和15％之間。在一些實(shí)施方式中，

是佐劑。
對(duì)于一些實(shí)施方式，ISCOM用作輔助劑。ISCOM是免疫刺激復(fù)合物的首字母縮合詞，Morein等人(Nature 308457-460(1984))描述了該技術(shù)。ISCOM是新型疫苗遞送系統(tǒng)并且與傳統(tǒng)佐劑技術(shù)不同。ISCOM可方便地以兩種方式中的一種形成。在一些實(shí)施方式中，抗原在其配制期間物理上并入結(jié)構(gòu)中。在其他實(shí)施方式中，ISCOM-基質(zhì)(例如，通過Isconova提供)不含抗原，但通過終端使用者在免疫之前與選擇的抗原混合。在混合后，抗原在溶液中與ISCOM-基質(zhì)一起存在，但在物理上不并入結(jié)構(gòu)中。
一般來(lái)說(shuō)，在ISCOM中，純化抗原基于在關(guān)鍵濃度下Quil A自發(fā)形成膠束，并通過疏水/親水鍵捕獲純化的免疫原的能力以多聚體形式存在。這些膠束結(jié)構(gòu)大小為35nm并很容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別。與傳統(tǒng)的儲(chǔ)存輔助劑不同，ISCOM很快從注射部位清除和引出局部、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在具體的實(shí)施方式中，ISCOM如下形成。所述病毒用標(biāo)準(zhǔn)方法溶解，如用非離子去污劑(如Mega-9、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黃皂苷、Nonidet P-40、C12E8、Lubrol、Tween-80)。加入脂質(zhì)混合物以有助于ISCOM形成。所述脂質(zhì)混合物可包括磷脂酰膽堿和合成膽固醇。在一些實(shí)施方式中，所述混合物首先在室溫下邊攪拌邊用非離子去污劑處理，然后可加入脂質(zhì)混合物(例如，等份數(shù)的磷脂酰膽堿和膽固醇)，并繼續(xù)攪拌。將Quil A(皂苷的純化糖苷)加至病毒脂質(zhì)混合物中并繼續(xù)攪拌?？杉尤胨鯭uil A得到最終濃度為約0.01至0.1％的Quil A，包括但不限于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08和0.09的Quil A。在一些實(shí)施方式中，所述最終濃度為約0.05％。去除所述非離子去污劑(例如，通過與醋酸銨滲濾)。ISCOM的基質(zhì)通過Quil A形成。通過電子顯微鏡觀察，ISCOM粒子的形態(tài)學(xué)顯示典型的籠狀結(jié)構(gòu)，大小為約35nm。ISCOM形成時(shí)期可用切向流滲濾精簡(jiǎn)。ISCOM顯示了基于Quil A在關(guān)鍵濃度下自發(fā)形成膠束和通過捕獲純化抗原的疏水/親水鍵的能力呈多聚體形式的純化抗原。ISCOM的形成可通過電子顯微鏡證實(shí)其已形成的典型籠狀結(jié)構(gòu)而證實(shí)。ISCOM呈遞的免疫反應(yīng)顯示至少比作為凝集膜蛋白膠束單獨(dú)呈遞的相似抗原負(fù)荷量的免疫反應(yīng)好十倍。還發(fā)現(xiàn)ISCOM能誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，這在用傳統(tǒng)的整個(gè)病毒疫苗時(shí)未發(fā)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，最終濃度為約0.05％。
也可在疫苗和/或藥物組合物中加入免疫刺激劑。免疫刺激劑包括單獨(dú)使用或組合使用的細(xì)胞因子；生長(zhǎng)因子；趨化因子；來(lái)自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或來(lái)自淋巴器官的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；植物的細(xì)胞制劑和/或提取物；細(xì)菌、寄生蟲的細(xì)胞制劑和/或提取物；或促細(xì)胞分裂劑，以及從其他病毒和/或其他來(lái)源(如雙鏈RNA、CpG)得到的新型核酸；嵌段共聚物；納米珠或本領(lǐng)域已知的其他化合物。
佐劑和其他免疫刺激劑的具體實(shí)例包括但不限于溶血卵磷脂；葡萄糖苷(如皂苷和皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100)；陽(yáng)離子表面活性劑(如DDA)；季銨烴基鹵化物(quaternary hydr℃arbon ammonium halogenides)；復(fù)合多元醇；聚陰離子和多原子離子；聚丙烯酸，非離子嵌段聚合物(如Pluronic F-127)；和MDP(如，N-乙酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降-胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺、N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺)。
D.疫苗效力 本領(lǐng)域熟知測(cè)定亞單位、減毒、片段和/或滅活病毒疫苗是否與臨床分離物或從其中得到的適于組織培養(yǎng)的分離物的病毒維持相似抗原性的方法。這些已知方法包括抗血清或抗體、HA和NA活性和抑制以及DNA篩選(如探針雜交或PCR)的應(yīng)用，以證實(shí)編碼抗原決定簇的供者基因在滅活病毒中存在。本領(lǐng)域也熟知鑒別疫苗是否誘導(dǎo)血清學(xué)反應(yīng)的方法，其包括用疫苗免疫待測(cè)動(dòng)物，然后接種致病病毒，并鑒別疾病癥狀存在還是不存在。因此，流感疫苗效力可在動(dòng)物中檢測(cè)，通常用白鼬、小鼠和豚鼠?？捎醚?xì)胞凝集抑制(HI)或神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)方法檢測(cè)抗體效價(jià)，或檢測(cè)組織培養(yǎng)物中的病毒中和抗體(微中和檢測(cè))，這些方法一般均已知。挑戰(zhàn)性研究可提供評(píng)估疫苗的重要信息。
適合治療的藥物組合物和/或疫苗包括病毒或病毒亞單位與無(wú)菌水性或非水性溶液混合物。生產(chǎn)藥物組合物和/或疫苗的方法可包括分離適于組織培養(yǎng)的分離物，生長(zhǎng)和純化病毒分離物，滅活和/或減毒病毒并以適合的效價(jià)與生理上可接受的稀釋劑和免疫刺激劑混合?；蛘?，病毒蛋白可經(jīng)純化以用于亞單位疫苗，并以適量與生理上可接受的稀釋劑和免疫刺激劑混合。可純化足夠的病毒，以使得沒有可干擾滅活步驟和/或病毒的免疫原性的污染材料或物質(zhì)。
適合效價(jià)的病毒或適合濃度的病毒蛋白可與稀釋劑和免疫刺激劑混合。TCID50測(cè)量是一種測(cè)量病毒效價(jià)的方法(感染50％組織培養(yǎng)物劑量)。例如，可用約105至1012的TCID50(基于預(yù)滅活效價(jià))的效價(jià)，包括但不限于106、107、108、109、1010和1011。任選所述效價(jià)可用HA效價(jià)分析，并在疫苗中每個(gè)病毒可包含約1至30μg的HA，包括但不限于用于佐劑制劑的1至10μg和用于非佐劑疫苗的1至30μg。在一些實(shí)施方式中，效價(jià)為約15μg。因此，例如，當(dāng)未加佐劑疫苗中包括3種病毒時(shí)，1個(gè)成人劑量含有45μgHA(3種病毒株，每一種15μg)的等同物。在其他實(shí)施方式中，每株的量可不同(例如，取決于抗原性)，但最終濃度為約1至約60μg HA，包括2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50和55μg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)期佐劑疫苗含有的HA量為約1至30μg，包括2、5、10和20μg。疫苗的體積通常為約50μl和5000μl之間，包括100、500、1000、2000和5000μl。
可用生理上可接受的標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑，例如，EMEM、Hanks平衡鹽溶液和磷酸鹽緩沖液(PBS)和生理鹽水。
疫苗和/或藥物組合物中可加入適合的免疫刺激佐劑。免疫刺激佐劑的實(shí)例包括但不限于單獨(dú)使用或組合使用的礦物油、植物油、氫氧化鋁、皂苷、非離子去污劑、角鯊烯、嵌段共聚物、納米珠、ISCOM、ISCOM基質(zhì)或本領(lǐng)域已知的其他化合物。
除了佐劑外，藥物組合物中也可包括可用于抗流感的任何適合的抗病毒劑。這些抗病毒劑包括例如，金剛乙胺(rimantadine)、金剛烷胺(amantadine)、神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如zanamivir和oseltamivir)、γ干擾素、胍、羥基苯并咪唑、干擾素α、干擾素β、縮氨基硫脲(thiosemicarbarzones)、美替沙腙(methisazone)、利福平(rifampin)、利巴韋林(ribavirin)、嘧啶或嘌呤類似物和磷甲酸鈉(foscarnet)。
含有多于一種病毒或病毒蛋白株的疫苗可用本發(fā)明的方法生產(chǎn)?；旌衔锟擅庖咴缘味ㄒ蕴峁┻m當(dāng)?shù)牡韧庖咝?。免疫原性滴定意指生產(chǎn)的最終產(chǎn)物平分免疫性的不同。例如，如果制備A株和B株混合物，且A株有5倍的免疫原性，則混合株的比例為A株∶B株為1∶5。
IV.疫苗給藥 疫苗組合物和/或藥物組合物的給藥可用于預(yù)防性目的。當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，組合物在任何流感病毒感染癥狀明顯出現(xiàn)之前提供。組合物的預(yù)防性給藥用于預(yù)防或減弱任何后續(xù)感染。藥物組合物和/或疫苗可以本領(lǐng)域已知的任何方式給藥，包括通過吸入、鼻內(nèi)(例如用減毒疫苗)、口服或胃腸外給藥。胃腸外途徑給藥的實(shí)例包括皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下。在一些實(shí)施方式中，疫苗經(jīng)上臂肌肉內(nèi)或深層皮下注射給藥。對(duì)于之前沒有接種或沒有接觸流感(未致敏)的一些兒童來(lái)說(shuō)，第二劑量可間隔2至4周給藥。一或多個(gè)加強(qiáng)劑疫苗可在最初免疫之后的適合的時(shí)間給藥。
給藥有效量的疫苗和/或藥物組合物。有效量是足以取得諸如誘導(dǎo)足夠體液或細(xì)胞免疫等所需生物學(xué)效應(yīng)的量。這可能取決于疫苗類型、接受者的年齡、性別、健康狀況和體重。所需生物效應(yīng)的實(shí)例包括但不限于無(wú)癥狀產(chǎn)生、癥狀減輕、組織或鼻內(nèi)分泌物的病毒效價(jià)減少、完全防止流感病毒感染和部分防止流感病毒感染。
在一些實(shí)施方式中，免疫學(xué)上有效量的CIV疫苗為每劑量約100HAU至約1500HAU。組合物通常為每劑量250至750HAU之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，疫苗組合物包括每劑量約500HAU。
當(dāng)以溶液給藥時(shí)，所述疫苗可以水溶液、糖漿、酏劑或酊劑的形式制備。這些制劑在本領(lǐng)域已知，并且通過將抗原和其他適合的添加劑溶于適合的溶劑系統(tǒng)中來(lái)制備。這些溶劑包括例如，水、鹽水、乙醇、乙二醇、甘油和A1液。適合的添加劑包括經(jīng)鑒定的染料、香料、甜味劑和抗微生物的防腐劑，如硫汞撒(thimerosal)(乙基汞硫代水楊酸納)。這些溶液可用標(biāo)準(zhǔn)方法穩(wěn)定，例如，通過加入部分水解的明膠、山梨醇或細(xì)胞培養(yǎng)基，并可用標(biāo)準(zhǔn)方法緩沖，用諸如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀和/或磷酸二氫鉀的試劑。液體制劑也可包括懸浮液和乳液。懸浮液的制備(例如)用膠體磨，乳液的制備(例如)用勻漿器。
V.病毒株和WHO 為了有時(shí)間生產(chǎn)足夠疫苗原液，必須在流感季節(jié)來(lái)臨之前決定好對(duì)于今年的疫苗(冬季用)來(lái)說(shuō)用流感A株和B株的哪一種。有一個(gè)世界性的精巧而復(fù)雜的流行病學(xué)監(jiān)控系統(tǒng)來(lái)幫助這些決定。此外，WHO通常制備用于生產(chǎn)疫苗的種子病毒。
有16種已知HA亞型和9種已知NA亞型。HA和NA蛋白的多種不同組合是可能的。目前僅有一些流感A亞型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人群中普遍流行。其他亞型在其他動(dòng)物種中最常見。例如，在馬中致病的H7N7和H3N8病毒，最近顯示H3N8也在狗中致病。
已知感染鳥類和人類的禽流感A病毒三種顯著亞型為流感A H5-H5感染，如，HPAI H5N1病毒、流感A H7和流感A H9。然而，感染人類并引起流行或大流行的下一批病毒株可來(lái)自任何亞型。
可用標(biāo)準(zhǔn)方法得到病毒，例如，從患者樣本、美國(guó)菌種保藏中心(theAmerican Type Culture Collection)(或其他保藏中心)，或從研究病毒的其他特定實(shí)驗(yàn)室得到。在一些實(shí)施方式中，病毒從WHO或CDC得到，包括季節(jié)性病毒和可能的大流行株。
VI.血清學(xué)反應(yīng)的檢測(cè) 本領(lǐng)域也熟知鑒別疫苗是否誘導(dǎo)血清學(xué)反應(yīng)的方法。例如，可將免疫原性化合物/疫苗注射入測(cè)試動(dòng)物，并在血清中鑒定抗病毒抗體。本領(lǐng)域熟知鑒別疫苗是否有保護(hù)性的方法，該方法包括用疫苗免疫測(cè)試動(dòng)物，然后用致病病毒接種，并鑒別疾病癥狀存在還是不存在。
可進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)以鑒別對(duì)血細(xì)胞凝集素的血清學(xué)反應(yīng)的存在?？稍谒袦y(cè)試血清樣品上用火雞紅細(xì)胞(RBC)進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HAI)測(cè)定，例如，通過用已知流感亞型如CIV(H3N8)。簡(jiǎn)言之，在V形底的96孔微滴定板中的PBS中進(jìn)行測(cè)試血清的兩倍系列稀釋。將含有4-8HAU/50μl CIV的等體積病毒懸浮液加入到含有測(cè)試血清的各孔中，并該板在室溫下孵育30分鐘。然后加入等體積的0.5％的火雞RBC懸浮液。然后將該板在室溫下孵育30分鐘并讀取HAI結(jié)果。顯示HA抑制的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)被認(rèn)為是測(cè)試樣品的HAI效價(jià)。
測(cè)定抗流感病毒抗體存在的其他方法包括神經(jīng)氨酸酶抑制測(cè)試、Western印跡、ELISA、PCR和鑒別流感病毒抗體的其他方法。這些測(cè)定是本領(lǐng)域已知的。
VII.實(shí)施例 如下實(shí)施例提供制備用于生產(chǎn)主要種子的均勻病毒群的流感病毒分離、適應(yīng)和純化步驟。這些實(shí)施例使用Vero細(xì)胞(美國(guó)菌種保藏中心，CCL81)，但可用流感病毒適用的任何細(xì)胞類型。
實(shí)施例1化學(xué)試劑和生物試劑 所用感染培養(yǎng)基含有1L DMEM(Cambrex，目錄號(hào)04-096)或等同物，貯存在2-7℃；20mL L-谷氨酰胺(Cellgro，目錄號(hào)25-005-CV)或等同物，貯存在-10℃或更低溫度，一旦融解，其可貯存在2-7℃多達(dá)4周；以及IX型胰蛋白酶(Sigma產(chǎn)品號(hào)T0303，CAS No.9002-07-7)或等同物，分裝并冷凍貯存在-5至-30℃。在感染細(xì)胞之前新配制感染培養(yǎng)基。
細(xì)胞培養(yǎng)基制備如下1L DMEM、20mL L-谷氨酰胺、50mL胎牛血清(Gibco目錄號(hào)04-4000DK)或等同物(注意來(lái)自無(wú)BSE的國(guó)家)。完全培養(yǎng)基制備后在2-7℃下貯存不多于30天。
用于傳代細(xì)胞的EDTA-胰蛋白酶(Cellgro目錄號(hào)98-102-CV或等同物) 貯存在-5至-30℃，由制造商指示有效日期。
實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)物制備 因?yàn)橛糜诓《靖腥静襟E的蛋白酶稀釋可根據(jù)批次變化，在使用之前滴定新的胰蛋白酶批次以建立最適水平。滴定的實(shí)施例是在含有L-谷氨酰胺的DMEM中系列稀釋IX型胰蛋白酶，用半對(duì)數(shù)稀釋(10-1、10-1.5、10-2、10-2.5等)。用含有新鮮匯合單層Vero細(xì)胞的96孔板，用280μL的PBS將板的每個(gè)孔洗滌2次。洗滌后立即按行加入200μL每個(gè)稀釋倍數(shù)的IX型胰蛋白酶至板中。然后將所述板在37℃加或減2℃下在5％CO2中孵育，并在4天后觀察細(xì)胞。選擇那些顯示對(duì)細(xì)胞健康狀況沒有或很少影響的胰蛋白酶的最低稀釋倍數(shù)作為胰蛋白酶的適合濃度，以用于流感感染的分離和優(yōu)化。令人滿意和常見的是每個(gè)濃度內(nèi)接種的孔之間很少或沒有變化。
對(duì)于在Vero細(xì)胞中的病毒有限稀釋克隆來(lái)說(shuō)，用單層細(xì)胞匯合，通常為3-4天齡的細(xì)胞；在96孔Falcon微測(cè)定板中生長(zhǎng)。所述細(xì)胞源自ATCCCCL 81并用第132和156代之間的細(xì)胞。
Vero細(xì)胞從液氮(LN2)中如下制備從LN2中取出1安瓿Vero細(xì)胞并在36℃加或減2℃下水浴融解。將小瓶中的全部?jī)?nèi)容移至25cm2含有補(bǔ)充10％胎牛血清的10mL細(xì)胞培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。該瓶在36℃加或減2℃下，在4-6％CO2中孵育。1小時(shí)后輕輕取出上清液和未附著的細(xì)胞，并加入10mL新鮮組織培養(yǎng)基。細(xì)胞在36℃加或減2℃下，在4-6％CO2中孵育直至達(dá)到90-100％的匯合。
Vero細(xì)胞傳代如下用10-20mL PBS將單層細(xì)胞洗滌約3分鐘。輕輕倒出PBS并換成3mL EDTA-胰蛋白酶(Cellgro，目錄號(hào)98-102-CV)，將單層細(xì)胞孵育約3分鐘或直至細(xì)胞從瓶中脫離。加入17mL制備的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含有FBS)稀釋懸浮液，以稀釋并中和胰蛋白酶。然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定每mL懸浮液中的細(xì)胞數(shù)。瓶的數(shù)量可通過如下計(jì)算的懸浮液準(zhǔn)備每mL細(xì)胞數(shù)(懸浮液)×所需懸浮液的mL數(shù)＝每個(gè)容器的板的mL數(shù)。每mL細(xì)胞數(shù)(所需)計(jì)算懸浮液mL數(shù)的總和，懸浮液總mL數(shù)必須少于可用的體積。如果不是如此，則鋪板細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至適應(yīng)這個(gè)情況，然而，應(yīng)當(dāng)注意，鋪板時(shí)細(xì)胞密度較低時(shí)細(xì)胞匯合的時(shí)間長(zhǎng)度將比較長(zhǎng)。容器通常以細(xì)胞密度為每mL 1×104至1×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液鋪板。細(xì)胞孵育3-4天或直至匯合。
這些維持和繁殖Vero細(xì)胞的技術(shù)可相似地應(yīng)用于所用的其他細(xì)胞系，如馬-達(dá)氏犬腎(MDCK)和HEK 293。
克隆尤其適于繁殖病毒分離物的HEK 293細(xì)胞。這種HEK 293亞克隆稱為GT-D22(或D22)，從最初的HEK 293細(xì)胞(ATCC號(hào)CRL-1573；ATCC批號(hào)F-11285，第33代)制劑中分離。亞克隆HEK 293細(xì)胞，并根據(jù)攜帶有表達(dá)p53基因的5型重組腺病毒的改進(jìn)產(chǎn)率選擇。對(duì)有正常形態(tài)和足夠的生長(zhǎng)率的克隆進(jìn)行胰蛋白酶消化，并以每孔1-2×106個(gè)細(xì)胞接種以用于進(jìn)一步分析。最能產(chǎn)生克隆的克隆經(jīng)受進(jìn)一步亞克隆和選擇。最后選擇D22亞克隆。D22亞克隆繁殖流感的能力已用豬流感病毒(SIV)證實(shí)。
當(dāng)研究活的流感病毒時(shí)，采取生物安全預(yù)防措施。流感是2級(jí)病原微生物，并應(yīng)該遵守CDC-NIH，HS出版號(hào)(CDC)88-8395(Biosafety inMicrobiological and Biomedical Laboratories)中對(duì)在實(shí)驗(yàn)室中操作病毒的建議。
實(shí)施例3有限稀釋克隆 有限稀釋克隆的稀釋管準(zhǔn)備和樣品稀釋如下。在試管架上設(shè)置測(cè)試管(12×75mm)并貼上標(biāo)簽。每板檢測(cè)一個(gè)樣品，每個(gè)樣品的稀釋系列為10-1至10-10。稀釋培養(yǎng)基用血清移液器以1.8mL的量分裝至每個(gè)測(cè)試管。第一個(gè)試管標(biāo)為病毒鑒別。其他幾個(gè)試管準(zhǔn)備用作稀釋對(duì)照，并在稀釋期間有誤差發(fā)生的情況下替換。將樣品震蕩混合約5秒，然后將200μL樣品移至10-1稀釋管制備起始稀釋物。繼續(xù)系列稀釋至10-10。對(duì)于每個(gè)稀釋，樣品震蕩混合并在稀釋物之間更換移液器吸頭。
稀釋物如下轉(zhuǎn)入細(xì)胞平板中。在使用之前即時(shí)從細(xì)胞平板中按無(wú)菌操作倒出培養(yǎng)基。用12道移液器用280μL無(wú)菌PBS將每個(gè)孔清洗2-3次。將平板無(wú)菌倒空，但不能干涸。將平板標(biāo)上病毒鑒別、日期和稀釋方案。每個(gè)稀釋物在加至平板之前都短暫震蕩。用監(jiān)控的Finnpipette或其它合適的移液器和1000μL吸頭，將每孔200μL樣品接種至平板的一行。根據(jù)病毒濃度加樣。首先，將2行稀釋對(duì)照加入平板，然后是最高稀釋的病毒(10-10)，接著是余下的樣品。從10-10至10-1連續(xù)加樣。
實(shí)施例4病毒制劑 收獲病毒并如下評(píng)估CPE。孵育4天后，用顯微鏡檢查讀取致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。用細(xì)胞碎片的存在、死細(xì)胞和缺乏活性的細(xì)胞的出現(xiàn)來(lái)鑒定CPE，因?yàn)樗鼈兪橇鞲胁《镜牡湫同F(xiàn)象。偶爾會(huì)在起始病毒稀釋物中觀察到非特異性干擾，因此檢查數(shù)個(gè)稀釋物的CPE很重要。當(dāng)評(píng)估CPE時(shí)，檢查顯示CPE的最高倍稀釋物的孔中CPE程度很重要。通過選擇呈現(xiàn)CPE的最高倍樣品稀釋物的孔來(lái)達(dá)成取得最高水平的成功，但在這些孔中，優(yōu)選呈現(xiàn)最小程度的CPE的那些孔。一旦被選擇，通過用單道1000μL移液器吸出液體來(lái)收集所述孔中的內(nèi)容物。通常重復(fù)吸出液體，以去除在孔底松散附著的細(xì)胞，并幫助打散懸浮液中的細(xì)胞或病毒塊。然后用收集的液體進(jìn)行下一輪或幾輪的有限稀釋克隆，或有時(shí)用于接種新鮮單層細(xì)胞以生產(chǎn)克隆后種子。一般來(lái)說(shuō)立即連續(xù)地進(jìn)行2至3輪有限稀釋克隆以產(chǎn)生均一的病毒群。過程中每一步都分析HA效價(jià)，結(jié)果顯示在表1中。A/Indonesia/05/2005(INDOH5N1)、A/Vietnam/1203/04(VNH5N1)、A/NewCaledonia/20/99(A/NC/20/99(R))和A/Wisconsin/67/05(A/Wis/67/05R)是由CDC提供的重配流感病毒。對(duì)于重配病毒，編碼表面糖蛋白HA和NA的基因來(lái)自流感株(INDOH5N1、VNH5N1、A/New Caledonia/20/99和A/Wis/67/05)，而其余的內(nèi)部基因來(lái)自A/PR/8/34。有限稀釋克隆也適用于野生型(未進(jìn)行PR8重配)流感株A/New Caledonia/20/99(A/NC/20/99)、A/Wisconsin/67/05(A/Wis/67/05)和B/Malaysis/2506/04。病毒通過反向遺傳技術(shù)產(chǎn)生并在含雞胚的雞蛋中傳代。雞蛋材料直接用于在Vero細(xì)胞中的有限稀釋克隆(用于HA效價(jià)的步驟顯示在實(shí)施例5中)。
表1
＊HA效價(jià)表示為單位/mL。＊＊CDC提供的卵胚材料的HA效價(jià)。＊＊＊CDC提供的用卵胚材料直接感染的Vero細(xì)胞的HA效價(jià)。
如上表1所示，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能產(chǎn)生與蛋中產(chǎn)生的病毒效價(jià)同樣高的病毒效價(jià)。另外，最初在Vero細(xì)胞上顯示不可檢測(cè)的生長(zhǎng)的病毒株VNH5N1和B/Malaysia/2506/04可通過有限稀釋克隆而適于Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)。有限稀釋克隆之前VNH5N1和B/Malaysia/2506/04在雞蛋羊膜上的繁殖增強(qiáng)了這些病毒在Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)的適應(yīng)性。
用SRID(單向輻射免疫擴(kuò)散)定量血細(xì)胞凝集素，在濃縮的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中的B/Malaysia/2506/04得到多達(dá)132μg/mL的血細(xì)胞凝集素蛋白。產(chǎn)率(每mL培養(yǎng)物的HAμg數(shù))較公布的用Vero細(xì)胞的已知方法高10倍。目前，一個(gè)人疫苗的劑量相當(dāng)于約15μg/病毒株。因此，可從1mL濃縮的Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中得到約8-9個(gè)劑量。
實(shí)施例5流感通過羊膜傳代增強(qiáng)病毒在組織培養(yǎng)細(xì)胞上生長(zhǎng)的能力 從CDC收到流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-RG。這是一種重配病毒，由在PR8病毒骨架上的禽H5N1流感病毒越南株H5和N1基因組成。這種病毒在通過尿囊腔接種的11天齡含胚雞蛋中擴(kuò)增。接種后2-3天收集尿囊液，病毒產(chǎn)率為2560血細(xì)胞凝集素單位(HAU)/ml。
在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀釋尿囊液(～200μl)，并使得匯合單層Vero細(xì)胞(ATCC CCL號(hào)81，第147代)在36±2℃下吸收60分鐘。將含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的25mL DMEM加入培養(yǎng)物中，孵育3天，收集培養(yǎng)上清液。在收集的液體中沒有可檢測(cè)的血細(xì)胞凝集素活性。
將含病毒的尿囊液以1∶10,000稀釋，將100μl接種至11天齡的含胚雞蛋的尿囊腔和羊膜上。將雞蛋在約39℃下孵育三天，分別收集尿囊和羊膜液。
Vero細(xì)胞(第132至152代)在含5％胎牛血清的DMEM中以1×104至1×105個(gè)細(xì)胞/ml、200μl/孔接種至96孔板，并在36±2℃、3-5％CO2下孵育3-4天(直至匯合)。在尿囊液或羊膜液中的VNH5N1病毒在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的DMEM中以10-1至10-10系列稀釋。從Vero細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用280μl的磷酸鹽緩沖液清洗每個(gè)孔，然后將200μl的每種病毒稀釋物接種至8個(gè)重復(fù)的孔中。平板在36±2℃，3-5％CO2下孵育4天。與尿囊來(lái)源病毒的10-7稀釋相比，羊膜來(lái)源的病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)高達(dá)10-9稀釋，其可證實(shí)羊膜液導(dǎo)致在Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)的病毒效價(jià)更高(見表2)。收獲來(lái)自顯示致細(xì)胞病變相應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)的孔的病毒，通過第二次有限稀釋進(jìn)行克隆。再一次，與尿囊來(lái)源病毒所見相比，羊膜液來(lái)源的病毒顯示了在較高稀釋倍數(shù)下的致細(xì)胞病變效應(yīng)(病毒約多10倍)。
表2 有限稀釋傳代1 尿囊液病毒 ↓稀釋致細(xì)胞病變效應(yīng)(+出現(xiàn)) 收獲H7孔中的病毒 羊膜液病毒 ↓稀釋致細(xì)胞病變效應(yīng)(+出現(xiàn)) 收獲G9孔中的病毒 有限稀釋傳代2 尿囊液H7克隆 ↓稀釋致細(xì)胞病變效應(yīng)(+出現(xiàn)) 收獲H3孔中的病毒 羊膜G9克隆 ↓稀釋致細(xì)胞病變效應(yīng)(+出現(xiàn)) 收獲G4孔中的病毒 有限稀釋傳代3 尿囊H7H3克隆 ↓稀釋致細(xì)胞病變效應(yīng)(+出現(xiàn)) 收獲B4和F4孔中的病毒 羊膜G9G4克隆 ↓稀釋致細(xì)胞病變效應(yīng)(+出現(xiàn)) 收獲C5和G5孔中的病毒 表2中的流感克隆在列名為A-H和行1-10(稀釋系列分別為10-1至10-10)結(jié)合的基礎(chǔ)上鑒定。例如，克隆名為B4代表從第B列和第4行發(fā)現(xiàn)的孔中收獲的病毒(10-4稀釋)。
從第三次有限稀釋收獲的病毒(～100μl)在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀釋并接種在匯合的Vero細(xì)胞上(第132-152代)，并在36±2℃下孵育60分鐘。吸收后加入含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的45mL DMEM，在36±2℃下孵育培養(yǎng)物四天。檢測(cè)收獲的培養(yǎng)物上清液的血細(xì)胞凝集素，從羊膜擴(kuò)增的病毒得來(lái)的兩種克隆得到四至八倍高的HA產(chǎn)率(見表3)。
表3 G9G4C5病毒隨后通過在滾動(dòng)瓶中(得到5120HAU/ml)和在5L生物反應(yīng)器中(得到7680HAU/ml)的Vero細(xì)胞中生長(zhǎng)來(lái)擴(kuò)增。
用B型流感病毒B/Malaysia/2506/04可得到相似結(jié)果。當(dāng)?shù)米阅蚰乙旱牟《驹赩ero細(xì)胞中繁殖時(shí)，這種病毒也不能產(chǎn)生任何可測(cè)的血細(xì)胞凝集素。然而，來(lái)源于羊膜的病毒擴(kuò)增在兩次有限稀釋克隆后得到640HAU/ml，并在5升生物反應(yīng)器中擴(kuò)增后得到5120HAU/ml。
實(shí)施例6血細(xì)胞凝集素定量 本步驟的目的是在終產(chǎn)物中的病毒液中定量流感病毒血細(xì)胞凝集素活性。
所用的材料包括PBS、Cambrex、517-16Q或等同物；Alsevers溶液、E8085或等同物；在Alsevers溶液中的新鮮公雞紅細(xì)胞(1∶1比例)。使其在Alsevers中過夜以穩(wěn)定受體。洗滌2次并以在PBS中的10％懸浮液貯存，或以在Alsevers中的50％懸浮液貯存。用4天之內(nèi)的采集樣品；微滴定板，F(xiàn)alcon U-底平板，目錄號(hào)3911或等同物；8道微量移液器5-50μL或等同物；離心機(jī)Beckman TJ-6或等同物；20-200μL微量移液器或等同物；一次性200μL移液器吸頭；已知效價(jià)的陽(yáng)性對(duì)照病毒；滅活抗原。貯存在2-7℃并在測(cè)試當(dāng)天使用。
A.制備標(biāo)準(zhǔn)化的在PBS中的0.5％的公雞紅細(xì)胞(rRBC)懸浮液，這通過首先使得rRBC溶液與室溫平衡(15-30℃)達(dá)成。從采集日起公雞RBC在Alseveres中有效期為4天。將在Alsevers中的足夠體積的rRBC轉(zhuǎn)移到50mL錐形離心管中。用PBS或Alsevers注入離心管至45mL刻度處并且通過翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次來(lái)混合，然后在4℃下以400×g離心10分鐘，以此洗滌rRBC。用移液器移除上清液。如果上清液中有任何溶血現(xiàn)象，則重復(fù)該洗滌步驟多達(dá)三次。最后的洗滌之后，將0.25mL聚集的公雞RBC加入49.75mL PBS中并翻轉(zhuǎn)混合。將細(xì)胞懸浮液標(biāo)上制備日期、所用PBS批號(hào)和在PBS中的0.5％公雞紅細(xì)胞，并貯存在2-7℃(最長(zhǎng)貯存時(shí)間為4天)。
B.確定測(cè)試樣品材料所需的微滴定板數(shù)量。用兩行分別為1∶2和1∶3的稀釋方案測(cè)試所有測(cè)試樣品。也用以1∶2稀釋方案的兩行陽(yáng)性對(duì)照病毒和兩行PBS對(duì)照。其他樣品根據(jù)需要測(cè)試。用永久黑色記號(hào)筆標(biāo)記微滴定板上的行名。下表2所示為一個(gè)實(shí)例。
表2微滴定板
在微滴定板的每個(gè)孔中加入50μL的PBS。另外在用1∶3稀釋方案的那些行和PBS對(duì)照行的第一個(gè)孔中再加入50μL的PBS。每個(gè)微滴定板完成從加樣點(diǎn)直至加入RBC完成，然之后再繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)微滴定板。將50μL樣品和陽(yáng)性對(duì)照病毒加入到所稱的指定行的第一個(gè)孔中加入50μL樣品和陽(yáng)性對(duì)照病毒。樣品系列兩倍稀釋用多道移液器制備，轉(zhuǎn)移50μL等分樣品。將適合的吸頭無(wú)菌地安裝至多道移液器，以確保將移液量設(shè)定為50μL。通過抽吸和排出材料至少七次來(lái)混合一列的孔的內(nèi)容物。丟棄用于混合的吸頭。安裝更多吸頭，將每孔中50μL材料轉(zhuǎn)移至下一列的孔中。重復(fù)這些步驟直至所有行按順序稀釋。確保從微滴定板的第十二行移除50μL。用多道移液器將50μl的0.5％rRBC懸浮液移送至每個(gè)孔中。rRBC懸浮液從最高稀釋的孔至最低稀釋的孔中加入。輕輕搖動(dòng)每個(gè)板以混合其中的內(nèi)容物。在微滴定板頂端放上蓋子，并將板堆起來(lái)，在室溫下(大約20-25℃)孵育45-60分鐘。
孵育階段之后，將平板放置在酶標(biāo)儀上讀取并測(cè)定PBS對(duì)照孔是否滿足要求(PBS孔不應(yīng)顯示任何血細(xì)胞凝集現(xiàn)象)。也進(jìn)行定性測(cè)定。rRBC必須設(shè)定為沒有任何防護(hù)的完全按鈕(complete button)。防護(hù)反應(yīng)分散rRBC。如果PBS對(duì)照孔滿足要求，則其他孔根據(jù)血細(xì)胞凝集評(píng)分。如果PBS對(duì)照孔不滿足要求，則測(cè)試無(wú)效，重復(fù)測(cè)試。將血細(xì)胞凝集結(jié)果記錄為陽(yáng)性(+)(有血細(xì)胞凝集)、部分(+/-)和陰性(0)。陽(yáng)性反應(yīng)表明rRBC完全防護(hù)或細(xì)胞全部分散。陰性反應(yīng)表明顯示“+/-”的rRBC孔形成的完全按鈕(total button)，為了端點(diǎn)計(jì)算的目的認(rèn)為其是陰性。對(duì)每個(gè)稀釋(即1∶2和1∶3)的每個(gè)重復(fù)鑒定凝集發(fā)生(沒有按鈕(no button))的最高稀釋倍數(shù)，并且其效價(jià)計(jì)算為顯示完全凝集的最后稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。鑒定測(cè)定的樣品和陽(yáng)性對(duì)照病毒的效價(jià)水平。測(cè)定每組重復(fù)稀釋倍數(shù)的端點(diǎn)效價(jià)的數(shù)學(xué)平均值。也測(cè)定每0.5mL(50μL)樣品、PBS和陽(yáng)性對(duì)照病毒的HA單位。將0.05mL數(shù)值乘以20計(jì)算得到每1mL的HA單位。
按如下計(jì)算對(duì)每一個(gè)1∶2和1∶3的測(cè)試樣品稀釋，記錄重復(fù)樣品的數(shù)學(xué)平均值。記錄最高效價(jià)。進(jìn)行HA/0.05mL×20＝HA/1mL相乘。記錄測(cè)試停止日期和每1mL(病毒液)的HA單位的結(jié)果或每劑量(終產(chǎn)物)的HA單位結(jié)果。母液或終產(chǎn)物的有效測(cè)試含有在最低稀釋倍數(shù)下的完全凝集(沒有按鈕(no button))和最高稀釋倍數(shù)下的不凝集(按鈕(button))。陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)在所建立的范圍內(nèi)。所列參數(shù)之外的效價(jià)范圍組成“未測(cè)試”或無(wú)效測(cè)試，應(yīng)在無(wú)偏差條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例7疫苗生產(chǎn) 病毒株是WHO、CDC或其他政府組織命名的大流行株或季節(jié)性株。為了驗(yàn)證人疫苗生產(chǎn)過程，使用CDC提供的流感病毒重配VNH5N1-PR8/CDC-RG參考株。用磷酸鹽緩沖液作為疫苗制備的稀釋劑，ISCOM作為佐劑。用等份數(shù)的膽固醇和磷脂酰膽堿的脂質(zhì)混合物來(lái)促進(jìn)ISCOM形成中的親水/疏水混合過程。通過滲濾去除用于破壞病毒的非離子去污劑。ISCOM的形成經(jīng)電子顯微鏡證實(shí)。使用二乙烯亞胺(BEI)來(lái)滅活病毒，然后用硫代硫酸鈉中和BEI。下面的步驟1-19更詳細(xì)地說(shuō)明所述過程。
在Vero(非洲綠猴腎)中細(xì)胞生產(chǎn)流感株，用氮丙啶化合物二乙烯亞胺(BEI)滅活，濃縮，純化，并用過濾和凝膠層析純化。用含有Quil A的佐劑和脂質(zhì)混合物配制病毒以制備藥物產(chǎn)品。
步驟1A-Vero細(xì)胞從工作細(xì)胞庫(kù)(WCB)復(fù)蘇Vero細(xì)胞。傳代數(shù)限制在主細(xì)胞庫(kù)(MCB)的20代，從主細(xì)胞庫(kù)(MCB)開始。融解1安瓿來(lái)自液氮中的WCB，以4-5×104個(gè)細(xì)胞/cm2在25cm2 Nunc瓶中在含有20％v/v經(jīng)照射的來(lái)源于新西蘭或澳大利亞的胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺(一般地)的Dulbecco的改良極限必需培養(yǎng)基(Modified Minimum Essentialmedium，DMEM)中接種。在36℃加或減2℃下孵育所述瓶，約1小時(shí)后去除上清液和未附著的細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基重新加入瓶中并如前孵育。
步驟2A-用胰蛋白酶/EDTA溶液收獲匯合單層細(xì)胞，然后將細(xì)胞重新接種到更多的靜止瓶或滾動(dòng)瓶中繼續(xù)細(xì)胞擴(kuò)增。可用微載體以20-30g/L在生物反應(yīng)器中進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。
步驟3A-當(dāng)在生物反應(yīng)器或滾動(dòng)瓶中得到培養(yǎng)底物的所需產(chǎn)物體積時(shí)，用Dulbecco的改良極限必需培養(yǎng)基(DMEM)洗滌細(xì)胞兩次以去除滅活感染培養(yǎng)基中的胰蛋白酶的殘留血清。
步驟1B-獨(dú)立制備工作病毒種(WVS)，并在大量生產(chǎn)之前冷凍。融解并在含有IX型豬胰蛋白酶的病毒感染培養(yǎng)基中稀釋貯存在-70℃的主要種子病毒或工作種子病毒(MSV+1)，以得到所需MOI。將預(yù)定體積接種到滾動(dòng)瓶中或生物反應(yīng)器中的匯合Vero細(xì)胞單層，并在36℃加或減2℃下孵育，一般孵育40-72小時(shí)，直至鑒定高達(dá)100％致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。收獲病毒并在-50℃或更低溫下貯存。
步驟4-融解工作種子病毒(不高于MSV+2代)并在含有0.5-5.0μg/mL的IX型豬胰蛋白酶的病毒感染培養(yǎng)基中稀釋，以得到所需感染復(fù)數(shù)。在培養(yǎng)基中用胰蛋白酶有助于貼壁和病毒對(duì)細(xì)胞的穿透。
步驟4A-用生物反應(yīng)器生產(chǎn)流感病毒。用SoloHill Plastic Plus微載體以30g/L的密度制備5升生物反應(yīng)器。在加入含5％v/v經(jīng)照射的來(lái)源于新西蘭或澳大利亞的胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中以2×105個(gè)Vero細(xì)胞/mL接種生物反應(yīng)器，并在36℃加或減2℃下孵育。細(xì)胞匯合達(dá)到80-100％后，靜置含Vero細(xì)胞的微載體并洗滌兩次，每次洗滌用2升不含血清的DMEM。將含有2.5μg/mL IX型胰蛋白酶的感染培養(yǎng)基加入到生物反應(yīng)器中。病毒種子(例如VNH5N1)也以0.0001-0.0003MOI加入到生物反應(yīng)器中。病毒制備進(jìn)行5天。每天對(duì)生物反應(yīng)器取樣，用于CPE觀察和HA滴定。CPE達(dá)到80-100％后收獲病毒。
步驟5-在收獲的病毒中加入二乙烯亞胺(BEI)，得到1.5mM的終濃度，在36℃加或減2℃和pH7.3加或減0.3下維持1小時(shí)(邊攪拌)。
步驟6-完成步驟5后，將收獲物轉(zhuǎn)移到第二個(gè)瓶中，并在36℃±2℃下進(jìn)行滅活步驟，持續(xù)48小時(shí)(邊攪拌)。這段時(shí)間后加入硫代硫酸鈉至終濃度為3mM，以中和任何殘留BEI。
步驟7-將培養(yǎng)物通過7μ和1μ過濾器凈化并貯存在2℃-8℃待測(cè)安全清除率。安全測(cè)試需10天進(jìn)行。
步驟8-用分子量截留(MWCO)為100K的聚砜膜，用切向流超濾系統(tǒng)濃縮抗原。得到高達(dá)約50倍濃縮物。
步驟9-將所得到的濃縮培養(yǎng)液在適合的緩沖液中平衡，用DNA酶(Benzonase)處理以降解細(xì)胞DNA。
步驟10-用尺寸排阻凝膠層析純化濃縮物。目前使用的凝膠是交聯(lián)瓊脂糖(CL-2B，Pharmacia)。柱子長(zhǎng)度為90cm以得到所需分離。CL-2B是一種“軟”膠，其依靠柱壁的支持。一般90cm長(zhǎng)度可用2×45cm或3×30cm(如，高30-32cm，直徑30cm)柱串聯(lián)達(dá)到。濃縮病毒以柱體積的約5-7％上柱。
步驟11-用100K MWCO聚砜膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室小型切向流超濾來(lái)重新濃縮病毒峰材料。
步驟12-通過加入5ml 10％(w/v)的去污劑(壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylglucamide))Mega 9溶液至200ml抗原溶液中來(lái)溶解重新濃縮的病毒峰材料。將溶液在20-25℃下，在玻璃容器中邊進(jìn)行磁力攪拌邊緩慢混合1小時(shí)。
步驟13-以每20mL重新濃縮的病毒峰加入50μl脂質(zhì)混合物。所述脂質(zhì)混合物含有10mg/mL雞蛋源的磷脂酰膽堿和膽固醇。在20-25℃下繼續(xù)攪拌，確保脂質(zhì)在重新濃縮的病毒中平均分布。加入Quil A(從10％w/v的貯存溶液中得到)使得終濃度為0.05％。將溶液在20-25℃下攪拌約30分鐘。
步驟14-用50mM醋酸銨通過滲濾從混合物中去除Mega 9去污劑。這使用有100K MWCO聚砜膜的實(shí)驗(yàn)室小型切向流超濾系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。所用醋酸銨的體積最少約為10倍重新濃縮的病毒峰混合物的體積。通過平衡加入和滲透流動(dòng)以維持全程定容來(lái)達(dá)到滲濾。去污劑干擾ISCOM形成。電子顯微鏡證實(shí)典型籠狀結(jié)構(gòu)形成。
步驟15-重新濃縮ISCOM作為滲濾的最后一步。
步驟16-滿意的QC釋放后，配制數(shù)批ISCOM以制備每1mL劑量含1至20μg人流感HA的疫苗。用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋劑。
步驟17-在A級(jí)條件下將共混的疫苗裝入單劑量的最終容器中。取樣檢測(cè)無(wú)菌性、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中的安全、可提取體積和視覺外觀。給疫苗貼上標(biāo)簽并堆放，在2℃至7℃下隔離放置。
步驟18-最后QA完成后，將產(chǎn)品釋放進(jìn)行成品冷藏(2℃至7℃)待派送。
實(shí)施例8源自Vero細(xì)胞的疫苗在白鼬中效力 評(píng)估源自Vero得到的流感疫苗對(duì)血清轉(zhuǎn)變白鼬的能力?；?006-2007季節(jié)性流感株(A/NC/20/99、A/Wis/67/05的兩個(gè)PR8重配株和B/Malaysia，都得自CDC)的三價(jià)人流感疫苗在有限稀釋克隆后在Vero細(xì)胞中生產(chǎn)。將所得到的疫苗，“SPflu0607”(含或不含ISCOM佐劑)，注射入4-6月齡雌性白鼬的左后腿。市售的人流感疫苗

(Sanofi-Pasteur生產(chǎn))和

(Chiron生產(chǎn))作為對(duì)照比較與SPflu0607一起檢測(cè)。用單輻射免疫擴(kuò)散(SRID)測(cè)量疫苗中的血細(xì)胞凝集素(HA)蛋白的量。通過血細(xì)胞凝集素抑制(HI)測(cè)量白鼬的血清轉(zhuǎn)變的白鼬的血細(xì)胞凝集抑制(HI)。認(rèn)為大于或等于1∶40的HI效價(jià)是陽(yáng)性的。參見表3。
表3
GMT＝幾何平均抗體效價(jià) ％陽(yáng)性＝HI抗體水平≥1∶40的動(dòng)物百分比 以上結(jié)果表明Vero細(xì)胞源的疫苗與市售雞蛋源的疫苗相當(dāng)。
實(shí)施例9制備CIV疫苗的犬流感病毒繁殖方法 從病犬的鼻分泌物中分離犬流感。取鼻拭子并放置在含慶大霉素和兩性霉素的2mL組織培養(yǎng)基中。將0.8mL所得拭子材料接種到在含有1.3μg/mL IX型胰蛋白酶的10mL DMEM組織培養(yǎng)基中的匯合馬-達(dá)氏犬腎(MDCK)細(xì)胞中，并在36±2℃下孵育2天。通過倒出培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)瓶，用標(biāo)準(zhǔn)抗血清通過美國(guó)獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(National Veterinary Serviceslaboratory)用標(biāo)準(zhǔn)抗血清鑒定病毒為H3N8。MDCK傳代病毒含每ml 160血細(xì)胞凝集素單位。通過在96孔板中的匯合MDCK細(xì)胞上接種10倍系列稀釋，并收獲顯示致細(xì)胞病變效應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)的單個(gè)孔(組織培養(yǎng)基是含1.3μg/mL IX型胰蛋白酶的DMEM)，以克隆病毒。重復(fù)此過程兩次。然后將所述克隆在75cm2瓶中的MDCK細(xì)胞上擴(kuò)增。生成的病毒(第4代)產(chǎn)率為每ml 640血細(xì)胞凝集素單位。然后通過所述病毒用300mL含0.8μg/mL IX型胰蛋白酶的DMEM，通過將0.23MOI接種至1050cm2滾動(dòng)瓶中的匯合單層細(xì)胞上，在馬-達(dá)氏牛腎細(xì)胞上傳代。所述將滾動(dòng)瓶在36±2℃下孵育3天。收獲的病毒產(chǎn)率為2560HAU/ml。因?yàn)樵贛DBK上的HA產(chǎn)率增加，這種細(xì)胞系被選為按比例增加擴(kuò)增用于疫苗制備的病毒。所述病毒在生物反應(yīng)器中繁殖。以3.0×105個(gè)細(xì)胞/mL在5L生物反應(yīng)器中接種以5g/L附著Cytodex III微載體的MDBK細(xì)胞，所述細(xì)胞以5g/L附著Cytodex III微載體。細(xì)胞在36±2℃下在含5％胎牛血清且沒有抗體的DMEM中生長(zhǎng)4天。安置靜置微載體后，去除90％的培養(yǎng)基，以用不含血清的DMEM替換。加入IX型胰蛋白酶至最后的5,000mL中的濃度為10μg/mL。所述細(xì)胞用0.01MOI的病毒感染。將病毒與微載體上的MDBK細(xì)胞一起在36±2℃下孵育2天，然后收獲上清液。得到的病毒產(chǎn)率為10,240HAU/ml。
實(shí)施例10在雞蛋中未傳代的臨床分離物的有限稀釋克隆產(chǎn)生均一群和改進(jìn)的TCID50/mL和HA效價(jià) 犬流感病毒H3N8(野生型)從診斷實(shí)驗(yàn)室得到并從鼻拭子分離。在收到之后處理鼻拭子，并將其用于接種含有匯合單層MDCK細(xì)胞的25cm2培養(yǎng)瓶。感染培養(yǎng)基由以下成分組成DMEM、4mM L-谷氨酰胺/ml、1.3μg/mlIX型和慶大霉素。將培養(yǎng)瓶在36±2℃和3-5％CO2下孵育，并在CPE開始時(shí)收獲。在收獲液中進(jìn)行HA測(cè)定，其結(jié)果是160HAU/ml和TCID50/ml效價(jià)為7.94。
MDCK細(xì)胞在含5％胎牛血清的DMEM中以1×104至1×105個(gè)細(xì)胞/ml，200μl/孔種在96孔板中，并在36±2℃，3-5％CO2下孵育3-4天(直至匯合)。在這部分按指定稀釋CIV H3N8病毒有限稀釋第1輪。在含有1.3μg/mL IX型胰蛋白酶、4mM L-谷氨酰胺和慶大霉素的DMEM中進(jìn)行稀釋。從MDCK細(xì)胞中去除培養(yǎng)基，用280μl磷酸鹽緩沖液清洗孔，然后將200μl的每種病毒稀釋接種至8個(gè)重復(fù)孔中。平板在36±2℃，3-5％CO2下孵育4天。進(jìn)行兩輪有限稀釋克隆，有限稀釋第2輪緊接著有限稀釋第1輪。所述過程產(chǎn)生的病毒分離物能產(chǎn)生較高TCID50/ml和血細(xì)胞凝集效價(jià)。收獲顯示最低程度致細(xì)胞病變效應(yīng)的較高稀釋倍數(shù)的孔，第二次用有限稀釋克隆。
有限稀釋第1輪 將第1代材料滴定得到7.5 TCID50/ml的結(jié)果。用這個(gè)值稀釋病毒產(chǎn)生5個(gè)樣品。
A.10-4 B.10-5 C10病毒顆粒/孔(10-6.5) D.3病毒顆粒/孔(10-7.02) E.1病毒顆粒/孔(10-7.5)
收獲孔A11以準(zhǔn)備有限稀釋克隆第2輪。
有限稀釋第2輪
收獲孔A5的病毒 使用從有限稀釋克隆(～200μl)第二輪中收獲的病毒接種含匯合單層MDCK細(xì)胞和補(bǔ)充1.3μg/mL IX型胰蛋白酶、4mM L-谷氨酰胺/ml和25μg/ml慶大霉素的DMEM的75cm2瓶中。滴定收獲的培養(yǎng)上清液以測(cè)定TCID50/ml和血細(xì)胞凝集效價(jià)(見表4)。
表4 在實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)，病毒在5L生物反應(yīng)器中在MDBK細(xì)胞上生長(zhǎng)，得到的血細(xì)胞凝集效價(jià)為10,240HAU/ml。
實(shí)施例11滅活犬流感疫苗對(duì)狗的效力 犬流感病毒(CIV)血清型H3N8在狗中引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。然而，目前沒有抗CIV的有效疫苗可用。本研究的目的是評(píng)估通過有限稀釋和CIV在組織培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖制備的滅活CIV疫苗在預(yù)防由有毒CIV感染誘導(dǎo)的臨床疾病和肺損傷中的效力。所述疫苗由二乙烯亞胺(BEI)滅活的CIV抗原輔以

佐劑構(gòu)成，抗原輸入水平為每劑量500血細(xì)胞凝集單位(HAU)。肌肉注射此疫苗接種一組8只7周齡CIV血清陰性狗，并在初次接種后21天給予加強(qiáng)劑。加強(qiáng)接種后兩周，與未接種的對(duì)照相比，接種狗顯示顯著較高水平的HA抑制抗體效價(jià)，未接種的對(duì)照狗顯示有疫苗的免疫反應(yīng)刺激。未接種的對(duì)照和接種狗在加強(qiáng)接種后16天均用異種有毒CIV分離物感染，并在感染后10天內(nèi)每天監(jiān)測(cè)臨床征象、直腸溫度和鼻CIV釋出。所有對(duì)照狗(100％)發(fā)展的臨床征象包括表明感染病毒毒性的眼和鼻排出物、噴嚏和咳嗽。與對(duì)照組(中值評(píng)分＝6.8，p＝0.0051)相比，接種組顯示明顯較低的臨床征象(中值評(píng)分＝4.3)。在接種組中僅有一只狗(12.5％)顯示鼻CIV釋出，且其僅存在一天，然而，與接種組相比，對(duì)照組的所有狗(100％)有顯著較高的病毒釋出(p＝0.0003)。在對(duì)照組中，感染后病毒釋出持續(xù)7天。感染后10天所有狗施以無(wú)痛致死，進(jìn)行尸體剖檢評(píng)估肺損傷。對(duì)照組中所有狗(100％)顯示不同程度的肺實(shí)變，然而，接種組僅有一只(12.5％)顯示輕度肺實(shí)變。當(dāng)與接種狗(中值評(píng)分＝0，p＝0.0005)對(duì)比時(shí)，對(duì)照狗肺評(píng)分明顯較高(中值評(píng)分＝4.9)。這些結(jié)果明確證明在此研究中的所測(cè)疫苗制劑通過明顯減少臨床征象，降低病毒釋出和預(yù)防CIV誘導(dǎo)的肺實(shí)變而保護(hù)狗抗CIV感染。
研究綜述 本研究的目的是測(cè)試

-輔助的CIV疫苗制劑在狗中預(yù)防CIV感染的效力。
起初使狗適應(yīng)環(huán)境8天。對(duì)于測(cè)試組，第一次接種在第0天進(jìn)行，加強(qiáng)劑在第21天進(jìn)行。對(duì)照組不接種。在第37天兩組狗均用CIV感染。在研究全程按如下所述監(jiān)測(cè)和觀察狗。狗在感染后10天施以無(wú)痛致死，進(jìn)行尸體剖檢。
測(cè)試動(dòng)物 測(cè)試動(dòng)物在第0天平均約48.25天齡。對(duì)照組有8只狗，測(cè)試組有8只狗。平均重量為1.8kg。研究中所用的狗沒有呼吸道感染病史或CIV接種史。為了證實(shí)狗為CIV抗體陰性(HA效價(jià)＜10)，在第-1天取血樣，通過血細(xì)胞凝集抑制測(cè)定檢測(cè)。在第-1天也取鼻拭子以確保狗在接種時(shí)沒有CIV感染。
預(yù)接種監(jiān)測(cè) 為了證實(shí)狗為CIV抗體陰性，在給藥第一次疫苗前一天取所有狗的血樣，并收集到抽空的血清分離管中。在同一天取鼻拭子以證實(shí)狗沒有CIV感染。
第一次接種之前兩天給狗體檢，評(píng)估狗的大致健康狀況。從最初接種和加強(qiáng)接種前兩天至接種日進(jìn)行臨床評(píng)估和直腸溫度檢測(cè)。
接種 在此研究中用犬流感病毒疫苗CIV H3N8-

犬流感病毒(H3N8)從有嚴(yán)重呼吸道疾病的狗中分離。用MCS+19代水平(即主細(xì)胞庫(kù)中第19代以后)的馬-達(dá)氏牛腎(MDBK)-KC細(xì)胞，繁殖CIV H3N8。然后在36℃下用6mM BEI滅活病毒60小時(shí)。用60mM硫代硫酸鈉中和BEI。
用于本研究的疫苗以用于等分成800個(gè)1mL劑量的800mL原液制備。800mL溶液如表5中制備。
表5
滅活的CIV H3N8病毒在生理鹽水中稀釋，然后輔以氫氧化鋁。水相中的殘留成分加入輔助的抗原中。分別制備油相，然后在10分鐘內(nèi)加至水相中，并持續(xù)混合1小時(shí)。用Silverson勻化器勻化系列稀釋30分鐘。
在室溫下平衡貯存在2-7℃的CIV疫苗小瓶至少30分鐘。將疫苗裝入3mL注射器(每個(gè)注射器1mL)，用于免疫。在第0天將疫苗的第一劑肌肉內(nèi)注射至右后腿，在第21天將第二劑肌肉內(nèi)給藥至左后腿。
接種后步驟 在每次接種后3-6小時(shí)內(nèi)對(duì)所有的狗進(jìn)行完全臨床評(píng)估以測(cè)量任何直接反應(yīng)，完全臨床評(píng)估包括直腸溫度和注射部位觀察。在每次接種后持續(xù)7天，每天進(jìn)行臨床評(píng)估，并根據(jù)以下臨床評(píng)估指南評(píng)分。在第20天和36天取血樣，并用所述血清樣品通過血細(xì)胞凝集抑制測(cè)量CIV抗體。
預(yù)感染步驟 在感染之前2天(第35和36天)和感染當(dāng)天(第37天)給予感染之前對(duì)所有的狗進(jìn)行臨床評(píng)估并記錄直腸溫度。根據(jù)臨床評(píng)估指南給臨床征象評(píng)分。
感染 感染材料從MDCK細(xì)胞分離CIV14-06A病毒，并用其感染接種的狗，這種病毒最初是從經(jīng)受犬呼吸道疾病的狗中現(xiàn)場(chǎng)收集的樣品中分離。感染病毒的平均效價(jià)是7.7 Log10TCID50/mL。在感染當(dāng)天，感染材料以1∶4在無(wú)菌、冷的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中稀釋至每只狗7.4Log10TCID50的目標(biāo)感染劑量。
給予感染在第37天給予所有的狗感染。四只狗放在Plexiglas小間，并且大約20分鐘內(nèi)用8mL感染病毒(2mL/狗)在生成噴霧劑。將狗暴露在噴霧劑中共40分鐘。
感染后監(jiān)測(cè) 感染后每天對(duì)每只狗記錄直腸溫度和進(jìn)行臨床評(píng)估，持續(xù)10天。感染后每天對(duì)每只狗收集鼻拭子，持續(xù)10天。每次收集后，鼻拭子按如下所述進(jìn)行處理和滴定。在感染后第10天將血樣收集在排空的血清分離管中，緊接著進(jìn)行無(wú)痛致死。
尸體剖檢 所有感染狗在感染后第10天(第47天)用AVMA認(rèn)證的方法(氯胺酮雞尾酒和Beuthanasia-D)無(wú)痛處死，進(jìn)行尸體剖檢。無(wú)痛處死后立即進(jìn)行肺的評(píng)估。評(píng)估可見的實(shí)變區(qū)，并按每個(gè)肺葉的實(shí)變百分比評(píng)分。百分比轉(zhuǎn)變?yōu)榉Q重評(píng)分，計(jì)算每只狗的總評(píng)分。在尸體剖檢中，收集肺組織，用于病毒分離和滴定，以及組織病理學(xué)用途。
病毒滴定 進(jìn)行病毒效價(jià)的血細(xì)胞凝集(HA)測(cè)定。將病毒在V底微滴定板中系列兩倍稀釋，并將等體積0.5％的火雞紅細(xì)胞(RBC)懸浮液加至病毒懸浮液中。將板放置在室溫下孵育30分鐘，讀取HA結(jié)果。顯示HA活性的病毒最高稀釋倍數(shù)稱為1HA單位。所有測(cè)定重復(fù)進(jìn)行兩次，并測(cè)量HA效價(jià)端點(diǎn)。
通過在MDCK細(xì)胞中滴定測(cè)定感染材料、鼻拭子和肺組織中的病毒效價(jià)，以證實(shí)在給予感染的狗中感染材料的效力并測(cè)量病毒釋出。MDCK細(xì)胞接種在96孔組織培養(yǎng)板中2天，然后用10倍系列稀釋病毒懸浮液或從肺組織和鼻拭子制備的樣品接種。將板在36±2℃的溫度和5％CO2下孵育。感染七天后，觀察板的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，用Spearman-Karber方法計(jì)算50％感染率端點(diǎn)。病毒效價(jià)以Log10TCID50/mL表示。
血清學(xué)反應(yīng)檢測(cè) 通過血細(xì)胞凝集抑制(HAI)測(cè)定來(lái)測(cè)量狗血清樣品中的抗CIV抗體。簡(jiǎn)言之，在V底96孔微滴定板中用PBS進(jìn)行測(cè)試血清的系列兩倍稀釋。在含測(cè)試血清的每個(gè)孔中加入含4-8HAU的CIV25-06B的等體積病毒懸浮液，將板在室溫下孵育30分鐘，使抗原抗體發(fā)生反應(yīng)。然后，加入等體積的0.5％火雞RBC懸浮液。將板在室溫下孵育30分鐘，讀取HAI結(jié)果。顯示HA抑制的血清最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)被認(rèn)為是測(cè)試樣品的HAI效價(jià)。所有測(cè)試重復(fù)進(jìn)行兩次，并測(cè)定端點(diǎn)HAI效價(jià)。
結(jié)果臨床評(píng)分 從感染前兩天至感染后10天，每天監(jiān)測(cè)所有狗的臨床征象，包括眼排出物、鼻排出物、噴嚏、咳嗽、呼吸困難和抑郁。對(duì)感染后10天的眼排出物、鼻排出物、噴嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困難的每天臨床評(píng)分求和，得到每只狗的臨床評(píng)分總數(shù)。用Wilcoxon Exact秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon Exact RankSum Test)對(duì)比接種組和對(duì)照組的臨床評(píng)分總數(shù)，并計(jì)算雙側(cè)P值。
對(duì)照組和接種組的狗從感染后2天起均顯示一定范圍的臨床征象(圖1)。對(duì)照組的所有8只狗(100％)顯示不同程度的咳嗽，在10天的感染后觀察期內(nèi)持續(xù)多達(dá)5天。另一方面，接種組僅有2只狗(25％)在整個(gè)10天的感染后觀察期內(nèi)顯示輕微咳嗽，并僅觀察到1天?？人允菍?duì)照組的狗顯示的主要征象。相反，接種組的狗顯示的主要臨床征象僅僅是輕微的眼排出物。與接種狗(中值評(píng)分＝4.3)相比對(duì)照組的臨床評(píng)分(中值評(píng)分＝6.8)明顯較高(p＝0.0051)。這些數(shù)據(jù)表明CIV疫苗保護(hù)狗預(yù)防CIV誘導(dǎo)的臨床征象。
結(jié)果鼻病毒釋出 通過在感染前一天(第-1天)，然后從感染后第1天至第10天收集和處理鼻拭子，以監(jiān)測(cè)所有狗的鼻病毒脫落。測(cè)定鼻拭子的病毒效價(jià)(Log10TCID50/mL)并對(duì)時(shí)間作圖。用Wilcoxon Exact秩和檢驗(yàn)比較對(duì)照組和接種組曲線下的面積。將每組的平均病毒效價(jià)(表示為L(zhǎng)og10 TCID50/mL)對(duì)感染后天數(shù)作圖(圖2)。
從感染后第1天的鼻分泌物中，對(duì)照組開始釋出病毒。所述病毒釋出在感染后第5天達(dá)到高峰(1.25 Log10 TCID50/mL)，然后在第7天急驟下降(圖2)。在10天的感染后觀察期內(nèi)，對(duì)照組中所有的狗(100％)在一或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)為病毒釋出陽(yáng)性。另一方面，接種組僅有一只狗(ID號(hào)CXTAMM)(12.5％)在鼻分泌物中有病毒釋出，并僅持續(xù)一天(第3天)。與接種狗相比，未接種的對(duì)照狗顯示明顯較高的鼻病毒釋出(p＝0.0003)。這些結(jié)果清楚表明所述CIV疫苗通過接種狗顯著抑制鼻病毒釋出。
結(jié)果血清學(xué)反應(yīng) 在初次接種和加強(qiáng)接種后計(jì)算從HAI測(cè)定所得的計(jì)算幾何平均抗體效價(jià)(GMT)。記錄免疫之間的效價(jià)增加倍數(shù)。用Wilcoxon Exact秩和檢驗(yàn)比較對(duì)照組和接種組之間的抗體效價(jià)。在研究中登記的所有16只狗在初次接種時(shí)均為健康且血清陰性(即，CIV抗體陰性)(HAI效價(jià)＜10)。在接種前一天(第-1天)收集的鼻拭子證實(shí)所有的狗均沒有鼻CIV釋出。對(duì)照狗在感染時(shí)保持血清陰性。
將HAI抗體效價(jià)制成表格，并比較對(duì)照組和接種組。在初次接種后所有接種狗產(chǎn)生可測(cè)水平的抗體效價(jià)。HAI抗體效價(jià)范圍為10和40之間，且GMT為22，當(dāng)與對(duì)照狗相比時(shí)，這些效價(jià)是顯著的(p＝0.0070)。第二次接種加強(qiáng)了抗體效價(jià)六倍(GMT＝135)，這明顯高于對(duì)照組(p＝0.0002)。大部分顯示HAI效價(jià)為160(75％)的狗的抗體效價(jià)范圍為80和160之間。所有對(duì)照狗保持無(wú)CIV抗體直至感染時(shí)(HAI效價(jià)＜10)。感染后，接種狗的抗體效價(jià)達(dá)到非常高的水平(GMT＝546)，證明了疫苗提供在誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)抗有毒CIV的效力。這些狗中的HAI效價(jià)范圍為120和1920之間。未接種的對(duì)照狗也隨著CIV感染而生成GMT為149的抗體。
結(jié)果肺實(shí)變、病毒分離和組織病理學(xué) 在所有流感感染中，肺實(shí)變/肺炎是主要的病理性損傷。在發(fā)展感染模型的先前研究中，我們?cè)诟腥竞蟮?天和14天在狗中觀察到了嚴(yán)重肺實(shí)變。因此，為了評(píng)估CIV是否預(yù)防CIV誘導(dǎo)的肺實(shí)變，將對(duì)照組和接種組的所有狗在感染后第10天無(wú)痛處死，進(jìn)行尸體剖檢。評(píng)估肺損傷并按每個(gè)肺葉的實(shí)變百分比評(píng)分。在尸體剖檢期間，根據(jù)狗的肺評(píng)分系統(tǒng)(與Diseases ofthe Swine(1999)第8版，第61章，第913-940頁(yè)中的豬流感病毒肺評(píng)分系統(tǒng)相似)將每個(gè)肺葉的肺實(shí)變百分比評(píng)分轉(zhuǎn)變?yōu)榉Q重評(píng)分。用WilcoxonExact Rank秩和檢驗(yàn)比較接種組和對(duì)照組的中值肺評(píng)分，并計(jì)算雙側(cè)P值。也記錄疫苗效率相對(duì)于對(duì)照的緩和分?jǐn)?shù)評(píng)估(Mitigated fraction estimate)以及評(píng)估的95％置信區(qū)間。
對(duì)照組中所有的狗(100％)顯示不同程度的肺實(shí)變，而接種組僅有一只狗顯示輕微肺實(shí)變(12.5)。未接種的對(duì)照狗的肺損傷特征為出血和微紅色實(shí)變和肝樣變。對(duì)照組肺評(píng)分范圍為0.10和14.70之間，其中中值肺評(píng)分為4.9。對(duì)照組的肺評(píng)分明顯高于接種組(p＝0.0005；緩和分?jǐn)?shù)評(píng)估為93.5％)。肺評(píng)分清楚證明用于本研究中的CIV疫苗制劑保護(hù)狗預(yù)防CIV誘導(dǎo)的肺實(shí)變。
除了在尸體剖檢中評(píng)分損傷之外，也可無(wú)菌收集肺組織進(jìn)行病毒分離和在福爾馬林進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。從接種和對(duì)照狗的肺組織樣品中均未發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的CIV，這與無(wú)鼻病毒釋出相關(guān)聯(lián)。因?yàn)榱鞲胁《疽鸺毙愿腥驹谇捌咛靸?nèi)出現(xiàn)峰病毒脫落和臨床征象，這個(gè)現(xiàn)象是預(yù)期的。到感染后10天，病毒從肺組織完全清除。這些結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致。組織病理學(xué)檢查顯示對(duì)照和接種狗有不同程度的表示肺組織炎癥的組織病理學(xué)變化。這個(gè)發(fā)現(xiàn)并不意外，因?yàn)樯踔猎诓≡禺愋悦庖叩拇嬖谙?，?duì)任何病原的免疫反應(yīng)也可能導(dǎo)致一定程度的炎癥反應(yīng)。此外，對(duì)照和接種狗的組織病理學(xué)的肺損傷嚴(yán)重性不能進(jìn)行比較，因?yàn)樗鼋M織不是從肺損傷區(qū)域選擇性收集的。因此，組織病理學(xué)不能用作評(píng)估本研究中的疫苗的效力的標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)論 疫苗接種在顯示疫苗引起的免疫反應(yīng)刺激的初次接種(GMT＝22)和第二次接種(GMT＝135)后誘導(dǎo)顯著較高的抗體反應(yīng)，如通過HAI方法測(cè)定。
疫苗顯著減輕CIV誘導(dǎo)的臨床征象，特別是咳嗽，每只狗的劑量為500HAU，這證實(shí)了所述疫苗控制CIV誘導(dǎo)的臨床疾病的效率。
疫苗在接種狗中顯著減少鼻病毒釋出，這證實(shí)了所述疫苗減少感染的效力。
疫苗成功地保護(hù)狗預(yù)防CIV誘導(dǎo)的肺實(shí)變，證實(shí)了所述疫苗抗最嚴(yán)重臨床后果-肺炎的效力。
疫苗對(duì)狗不引起主要副作用，證明了所述疫苗的安全性。
臨床評(píng)估指南 鼻排出物 0＝來(lái)出現(xiàn) 0.5＝漿液排出物從鼻孔流下水性液滴。這里記錄從鼻中流出的液體。
1＝粘液膿性排出物，輕度至中度從鼻至口至少不完全流下混合有粘液的混濁液體。
2＝粘液性膿性排出物，重度粘液流過口。
眼排出物 0＝未出現(xiàn)在眼角有少量干的結(jié)痂物，不認(rèn)為是眼排出物。
0.5＝漿液排出物從眼睛流出清亮液體排出物。
1＝粘液膿性排出物，輕度至中度從眼睛至口至少不完全流下混合有粘液的混濁液體。
2＝粘液性膿性排出物，重度液體或粘液流下鼻部或在眼睛邊緣滾動(dòng)并且在眼內(nèi)角或外角滲入頭發(fā)。
咳嗽 0＝未出現(xiàn) 0.5＝輕微僅觀察到短暫咳嗽。
1.0＝中度頑固性咳嗽，在觀察期重復(fù)出現(xiàn)。
2.0＝重度咳嗽伴隨呼吸困難或干嘔聲。
噴嚏 0＝未出現(xiàn) 2＝出現(xiàn) 呼吸困難 0＝未出現(xiàn)(正常呼吸) 2＝出現(xiàn)(喘息) 抑郁 0＝未出現(xiàn)(正?；钚? 2＝出現(xiàn)與正常相比，狗的活動(dòng)或嬉戲較少。當(dāng)觀察時(shí)如果出現(xiàn)昏睡或躺下和站立勉強(qiáng)，則記錄。
盡管為了清楚理解而詳細(xì)描述了前述發(fā)明，很明顯可在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行某些改動(dòng)。對(duì)所有目的，本文所引用的所有公開物和專利文件都以全文納入作為參考，納入程度如同其中每一個(gè)都單獨(dú)表示一樣。
從上文顯而易見的是本發(fā)明提供一些應(yīng)用。例如，本發(fā)明提供任何新鑒別的致病流感病毒株以及已知致病株用于制備適于細(xì)胞培養(yǎng)的分離物和/或疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明提供為或能制成允許流感生長(zhǎng)的任何新鑒別的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明提供適于組織培養(yǎng)的株制備成疫苗的方法，所述疫苗具有至少減毒、亞單位、片段或死病毒；并且還有佐劑、載體、賦形劑、抗流感藥劑和增強(qiáng)對(duì)病毒的免疫反應(yīng)的其它試劑。所述疫苗可在與流感接觸之前或接觸之后應(yīng)用。
權(quán)利要求
1、通過有限稀釋克隆選擇在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的人流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟
系列稀釋流感病毒分離物，和
使每種稀釋物與培養(yǎng)細(xì)胞接觸；
使所述細(xì)胞生長(zhǎng)一段足以產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的時(shí)間；
從引起CPE的最高倍稀釋物中收獲病毒；以及
用收獲的病毒重復(fù)所述過程。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在與所述培養(yǎng)細(xì)胞接觸之前混合所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述使適于組織培養(yǎng)的分離物與所述組織培養(yǎng)細(xì)胞接觸的步驟在少于約0.01的MOI下進(jìn)行。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)細(xì)胞為哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞為人胚胎腎細(xì)胞。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流感病毒為A、B或C型流感病毒。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述A型流感病毒為H5N1株。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述流感病毒分離物最初在含胚雞蛋中生長(zhǎng)，以得到適于組織培養(yǎng)的大量接種物。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述流感病毒分離物最初在羊膜上生長(zhǎng)。
11、生產(chǎn)人流感病毒疫苗的方法，包括純化根據(jù)權(quán)利要求1所述的收獲的病毒。
12、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述純化步驟用尺寸排阻層析進(jìn)行。
13、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，還包括用有效滅活病毒的量的二乙烯亞胺(BEI)處理所述病毒。
14、免疫原性組合物，包括BEI-滅活的人流感病毒和佐劑。
15、疫苗，包括以每劑量少于4μg人流感HA配制的人流感病毒，其中至少70％的HA具有相同氨基酸序列。
16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其中所述人流感病毒通過BEI滅活。
17、根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其中所述疫苗還包括ISCOM。
18、根據(jù)權(quán)利要求15所述的疫苗，其中至少90％的HA具有相同氨基酸序列。
19、通過有限稀釋克隆選擇在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的犬流感病毒(CIV)H3N8的方法，所述方法包括
系列稀釋流感病毒分離物，和
使每種稀釋物與培養(yǎng)細(xì)胞接觸；
使所述細(xì)胞生長(zhǎng)一段足以產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的時(shí)間；
從引起CPE的最高倍稀釋物中分離病毒；以及
用收獲的病毒重復(fù)所述過程。
20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，還包括在與所述培養(yǎng)細(xì)胞接觸之前混合所述流感病毒分離物與有效量的胰蛋白酶。
21、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述胰蛋白酶為IX型胰蛋白酶。
22、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)細(xì)胞為哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞。
23、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物胚胎腎細(xì)胞為馬-達(dá)氏牛腎(MDBK)細(xì)胞。
24、免疫原性組合物，包括滅活的犬流感病毒(CIV)H3N8和佐劑。
25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑為油和水乳液。
26、根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑為氫氧化鋁。
27、根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物，其中所述滅活的CIVH3N8為二乙烯亞胺滅活的CIV H3N8。
28、疫苗，包含根據(jù)權(quán)利要求24所述的免疫原性組合物。
29、根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗，還包含免疫學(xué)上有效量的一種或多種另外的滅活CIV血清型。
30、根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗，還包含另外的病原體，其中所述另外的病原體選自犬瘟病毒、犬腺病毒、犬細(xì)小病毒、犬副流感病毒、犬冠狀病毒、鉤端螺旋體血清型、利什曼生物、包柔氏螺旋體屬、支氣管博德特氏菌、支原體屬、狂犬病病毒、犬艾希體及上述的混合物。
31、根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗，其中所述CIV H3N8以每劑量500HAU配制，且其中至少70％的HA具有相同氨基酸序列。
32、根據(jù)權(quán)利要求31所述的疫苗，其中所述佐劑為氫氧化鋁。
33、根據(jù)權(quán)利要求34所述的疫苗，其中至少90％的所述HA具有相同的氨基酸序列。
34、免疫犬類抗CIV的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求28所述的疫苗注射犬類。
35、包含與CIV H3N8結(jié)合的抗體的血清，所述抗體由根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法免疫的犬類獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇在組織培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)的流感病毒以制備適于組織培養(yǎng)的病毒分離物的方法。本發(fā)明還涉及由所述分離物制備的疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/145GK101610787SQ200780051376
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者T·L·沃斯梅恩, P·高, B·A·埃迪, O·Y·阿布德爾梅吉 申請(qǐng)人:先靈-普勞有限公司