專利名稱：H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種rRT-PCR檢測技術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)品的制備，尤其涉及一種H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品。
背景技術(shù)：
流感病毒基因組由8條(甲、乙型)或者7條(丙型)負鏈RNA節(jié)段構(gòu)成。根據(jù)病毒的核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同分為甲型、乙型、丙型。其中A型流感病毒根據(jù)血凝素(HA)基因分為HA1-16亞型，根據(jù)神經(jīng)氨酸酶基因(NA)分為NA1-9亞型。H7N9亞型流感病毒是A型流感病毒的一種，禽類是其天然宿主，亞洲、北美洲等地區(qū)多個國家的禽類養(yǎng)殖場中檢測到過H7N9禽流感病毒。動物實驗表明，H7N9亞型流感病毒能夠感染雪貂的上呼吸道和下呼吸道，提示其具有感染人的風(fēng)險，目前尚無一種快速、靈敏的方法用于檢測H7N9亞型流感病毒及其重配變異株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、應(yīng)用方便的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測弓I物和探針，包括以下一種或多種弓I物和探針:H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針、H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針；所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒NA基因相對保守區(qū)。本發(fā)明的應(yīng)用上述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，包括步驟:首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA ；然后，利用一步法或兩步法rRT-PCR試劑加入所述引物和探針進行核酸擴增；之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測結(jié)果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。本發(fā)明的流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品，含有H7和N9亞型的全長基因，用于上述檢測流感病毒的方法的陽性對照品。由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品，由于包括針對H7N9亞型流感病毒HA基因和NA基因相對保守區(qū)引物和探針，可以通過rRT-PCR法檢測H7N9亞型流感病毒及其變異株，操作簡單、應(yīng)用方便。
具體實施例方式本發(fā)明的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR (real-time RT-PCR)檢測引物和探針，其較佳的具體實施方式
是，包括以下一種或多種引物和探針:H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針、H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針；所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒HA基因相對保守區(qū)；所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒NA基因相對保守區(qū)。所述引物和探針包括長度為18 31bp的寡核苷酸片段。所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針包括以下兩套引物/探針組合，共計四條引物序列和二條探針序列:第一套:弓丨物序列:5’ AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3，、5，GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3，；探針序列:5’FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’ ；第二套:引物序列:5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’ TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’ ；探針序列:5’FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’ ；所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:弓丨物序列:5，TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3，、5，ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3，；探針序列:5，F(xiàn)AM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3，。所述探針序列兩端的標(biāo)記FAM、BHQl為熒光素標(biāo)記。本發(fā)明的應(yīng)用上述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，其較佳的具體實施方式
包括步驟:首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA ；然后，利用一步法或兩步法rRT-PCR試劑加入所述引物和探針進行核酸擴增；之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測結(jié)果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。所述流感病毒包括以下一種或多種病毒:禽H7N9亞型流感病毒、內(nèi)部基因變異的禽H7N9亞型流感病毒、人感染H7N9亞型流感病毒、人感染內(nèi)部基因變異的H7N9亞型流感病毒。本發(fā)明的流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品，其較佳的具體實施方式
是:含有H7和N9亞型的全長基因，用于上述的檢測流感病毒的方法的陽性對照品。進一步用于H7和N9的RNA體外轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)體外合成。
本發(fā)明中的引物和探針序列(5’ 一3’)及其檢測的靶片段如下:
權(quán)利要求
1.一種H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，包括以下一種或多種引物和探針: H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針、H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針； 所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒HA基因相對保守區(qū)； 所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒NA基因相對保守區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，所述引物和探針包括長度為18 31bp的寡核苷酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于: 所述H7N9亞型流感病毒HA基因 特異性引物和探針包括以下兩套引物/探針組合，共計四條引物序列和二條探針序列: 第一套:引物序列:5’ AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’ GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’ ； 探針序列:5’ FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’ ； 第二套:引物序列:5’ TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’ TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’ ； 探針序列:5’ FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’ ； 所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:引物序列:5’ TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3’、5’ ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3’ ； 探針序列:5’ FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，所述探針序列兩端的標(biāo)記FAM、BHQl為突光素標(biāo)記。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求1至4中任一項所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，其特征在于，包括步驟: 首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA ； 然后，利用一步法或兩步法rRT-PCR試劑加入所述引物和探針進行核酸擴增； 之后，根據(jù)Ct值判斷rRT-PCR檢測結(jié)果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一種或多種病毒: 禽H7N9亞型流感病毒、內(nèi)部基因變異的禽H7N9亞型流感病毒、人感染H7N9亞型流感病毒、人感染內(nèi)部基因變異的H7N9亞型流感病毒。
7.一種H7N9亞型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，含有H7和N9亞型的全長基因，用于權(quán)利要求5或6所述的檢測流感病毒的方法的陽性對照品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的H7N9亞型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，進一步用于H7和N9的RNA體外轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)體外合成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及H7N9亞型流感病毒標(biāo)準(zhǔn)品，包括H7N9亞型流感病毒特異性引物和探針3種共9條寡核苷酸引物和探針序列，同時包括待檢樣本的處理、rRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件、結(jié)果分析。能快速有效的甄別人和動物中的H7N9亞型流感病毒。操作簡單、應(yīng)用方便，為臨床診斷、檢驗檢疫等領(lǐng)域的流感疫情早期預(yù)警機制提供了可行的技術(shù)支持。
文檔編號C12Q1/68GK103160617SQ20131012244
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者舒躍龍, 趙翔, 王大燕, 高榮保, 李曉丹 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所