一種流感病毒的濃縮、純化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種流感病毒的濃縮、純化方法，其特征在于：（1）應(yīng)用0.8～0.65um的濾芯進(jìn)行澄清；（2）750KD的中空纖維超濾濃縮；（3）Sepharose4FF層析純化技術(shù)進(jìn)行純化。本發(fā)明采用0.65um的膜對(duì)流感病毒液進(jìn)行澄清，采用中空纖維750k超濾膜進(jìn)行濃縮，分子篩層析技術(shù)進(jìn)行純化徹底解決了目標(biāo)蛋白純度低，雜蛋白高、DNA殘留量高、抗原回收率低的問(wèn)題。對(duì)于提供疫苗質(zhì)量，降低副反應(yīng)提供了很好的技術(shù)手段，有利于生產(chǎn)出高品質(zhì)、安全性好的高質(zhì)量疫苗。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種流感病毒的濃縮、純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒的純化方法，特別是涉及一種流感病毒的濃縮、純化方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)于流感病毒的濃縮方法比較常用的有紅細(xì)胞吸附釋放法、膜包法、中空纖維法。紅細(xì)胞吸附釋放法是濃縮和純化流感病毒的方法中比較簡(jiǎn)便、快速而又不造成病毒顆粒蛋白結(jié)構(gòu)改變的一種方法，但它易受毒株種類(lèi)的影響。病毒超濾濃縮通常使用100-300k膜包，膜包篩網(wǎng)剪切力易造成病毒顆粒聚集和表面蛋白的脫落，從而影響病毒活性收率，因此對(duì)操作要求極高；此外，膜包篩網(wǎng)剪切力還容易加速雜蛋白的聚集(如牛血清白蛋白，卵清蛋白等)，而100-300k較小的膜包孔徑不利于濃縮過(guò)程中雜蛋白透過(guò)，因此濃縮液雜蛋白含量在濃縮過(guò)程中不斷增加，蛋白凝膠層顯著影響濃縮處理速度，較高的黏度也不利于后期分離純化和填料壽命。中空纖維750k超濾膜采用先進(jìn)的膜加工制造工藝，具有均一的孔徑分布，有效截留病毒的同時(shí)避免病毒在膜上的沉積，速度快、收率高，同時(shí)較大的孔徑使得DNA和雜蛋白等雜質(zhì)透過(guò)而加以去除，降低濃縮后的料液黏度，提聞廣品質(zhì)量。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外大部分生產(chǎn)流感疫苗的企業(yè)主要是采用雞胚作為流感病毒增殖基質(zhì)進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)，這種 生產(chǎn)方式有很大的局限性:均存在對(duì)SPF雞胚的依賴性，質(zhì)量難于控制；方法難于標(biāo)準(zhǔn)化。
[0004]常用于疫苗生產(chǎn)的病毒純化方法有蔗糖密度梯度離心法和凝膠層析法，這兩種方法在雜蛋白去除率、抗原回收率等方面均可取得較好的效果。對(duì)于純化產(chǎn)物而言，層析法的純度、及雜蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度離心法，而蔗糖密度梯度離心法的病毒回收率優(yōu)于層析法。鑒于各地藥審部門(mén)近年要求提高疫苗的安全性，以降低副作用，紛紛強(qiáng)制改進(jìn)病毒疫苗的生產(chǎn)和純化方法。流感病毒疫苗的生產(chǎn)正開(kāi)始用VERO細(xì)胞取代雞胚培養(yǎng)。純化方法已放棄蔗糖密度梯度離心這類(lèi)傳統(tǒng)方法，而走向自動(dòng)化程度更高、更易于在位清洗的超濾和分子篩層析技術(shù)。
[0005]2007年世界首個(gè)細(xì)胞流感疫苗Optaflu(諾華)經(jīng)歐盟批準(zhǔn)已經(jīng)成功上市，除了諾華以外，Baxter的Celvapan是另外一個(gè)被歐盟批準(zhǔn)采用細(xì)胞培養(yǎng)制備的流感疫苗,該公司用Vero細(xì)胞非洲綠猴的腎上皮細(xì)胞模擬制備流感疫苗，取得成功。細(xì)胞類(lèi)流感疫苗在濃縮、純化等方面采用了自動(dòng)化程度更高、更易于在位清洗的超濾和分子篩層析技術(shù)。
[0006]美國(guó)默克公司將中空纖維過(guò)濾膜用于多種疫苗的生產(chǎn)，如使用300k中空纖維膜進(jìn)行重組酵母乙肝疫苗的濃縮和洗濾，使用0.65Mffl中空纖維膜澄清酵母裂解液，生產(chǎn)HPV疫苗等。Bernd Kalbfuss等人將750k中空纖維膜用于MDCK細(xì)胞流感病毒培養(yǎng)液的濃縮，發(fā)現(xiàn)中空纖維750k超濾膜可以有效去除宿主DNA等雜質(zhì)。C.Peixoto等使用中空纖維750k超濾膜濃縮輪狀病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液，優(yōu)化后的濃縮收率達(dá)86%，濃縮的同時(shí)去除97%的DNA。最終得到高純度的輪狀病毒VLP類(lèi)病毒顆粒，工藝總收率37%。
[0007]分子篩層析或凝膠過(guò)濾，具有分子篩的作用，可以分級(jí)分離各種抗原與抗體，去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時(shí)，分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運(yùn)動(dòng)，而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達(dá)到分離的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，給出新的一種流感病毒的濃縮、純化方法。本發(fā)明采用層析技術(shù)純化流感病毒，分子篩層析介質(zhì)為Sephar0Se-4FF。Sepharose-4FF是由4%高度交聯(lián)瓊脂糖(成球后)制備而成。瓊脂糖本身有少量硫酸根和羧基，可能導(dǎo)致在低離子強(qiáng)度的情況下堿性蛋白的吸附。具有清洗、消毒方便、分辨率高、介質(zhì)穩(wěn)定、可重復(fù)使用、易保存等優(yōu)點(diǎn)。
[0009]鑒于流感病毒屬于正粘病毒科，包括人流感病毒和動(dòng)物流感病毒，人流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，流感病毒呈球形，新分離的毒株則多呈絲狀，其直徑在80至120納米之間，絲狀流感病毒的長(zhǎng)度可達(dá)400納米。應(yīng)用Sepharose-4FF介質(zhì)純化可以更有效的完成目標(biāo)蛋白和雜蛋白的分離，提高抗原純度和抗原回收率，并能很好的去除雜蛋白和VeiO細(xì)胞殘留DNA、宿主蛋白，達(dá)到一個(gè)很好的分離效果。
[0010]本發(fā)明給出的技術(shù)方案是:這種流感病毒的濃縮、純化方法，其特征在于有以下步驟。
[0011](I)應(yīng)用0.8~0.65um的濾芯進(jìn)行澄清。
[0012](2) 750KD的中空纖維超濾濃縮。
[0013](3) Sepharose 4FF層析純化技術(shù)進(jìn)行純化。
[0014]所述步驟(1)應(yīng)用0.8~0.65um的濾芯進(jìn)行澄清，采取如下措施:應(yīng)用0.8 —
0.65um的濾芯進(jìn)行澄清，首先用L-15液體平衡濾芯，之后對(duì)病毒液進(jìn)行澄清。
[0015]所述步驟(2)應(yīng)用750KD的中空纖維超濾濃縮，采取如下措施:應(yīng)用0.5N NaOH對(duì)750KD的中空纖維超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行在線消毒清洗，用L-15液體平衡設(shè)備。濃縮20~30倍數(shù)，之后用L 一 15沖洗設(shè)備。定容到預(yù)定體積。超濾濃縮結(jié)束后，應(yīng)用0.5N NaOH對(duì)超濾設(shè)備進(jìn)行在線清洗，清洗后應(yīng)用0.1N NaOH保存。
[0016]所述步驟(3)應(yīng)用Sepharose 4FF層析純化技術(shù)進(jìn)行純化,采取如下措施:應(yīng)用
0.5N NaOH液在線清洗純化系統(tǒng)，純化應(yīng)用S印harose 4FF基質(zhì)。應(yīng)用0.01N PBS緩存液平衡，上樣體積為層析柱凝膠體積的5%。收取第一峰。
[0017]上述技術(shù)方案中提及的L 一 15是指=Leibovitz L_15培養(yǎng)基，是為無(wú)CO2緩沖條件下細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)。配方中加有碳酸氫鈉緩沖體系。L-15培養(yǎng)基的緩沖體系由鹽、自由基氨基酸以及半乳糖構(gòu)成，因此可以用于無(wú)CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)及病毒培養(yǎng)。采用L-15液平衡濾芯、沖洗設(shè)備主要作用是潤(rùn)濕濾芯，并且使濾芯里面的液體和病毒培養(yǎng)收獲的液體盡可能保持一致，并利用L-15液中的緩沖鹽體系達(dá)到平衡及保護(hù)病毒抗原的作用。
[0018]與蔗糖密度梯度離心法相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用層析技術(shù)純化流感病毒，分 子篩層析介質(zhì)為Sepharose_4FF,該介質(zhì)是由4%高度交聯(lián)瓊脂糖(成球后)制備而成，瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6位脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，在溫度100°C時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)下降至45°C以下時(shí)，它們之間相互連接成線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖；再凝聚即呈瓊脂糖凝膠。與1，3- 二溴異丙醇在強(qiáng)堿條件下反應(yīng)，即生成CL型交聯(lián)瓊脂糖，其熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均有所提高，可在廣泛PH值溶液(pH3~14)中使用。該介質(zhì)在重新組裝和填充層析柱前對(duì)其滅菌，121°C高壓滅菌20min。填充層析柱后在線消毒滅菌。停用后若需要長(zhǎng)期保存，4~25°C，勿冷凍。使用后若需要短期保存，4~8°C ?!1值6~8加入抑菌劑(如:20%乙醇，0.04%疊氮化鈉)?？芍貜?fù)使用。該凝膠介質(zhì)具有清洗、消毒方便、分辨率高、介質(zhì)穩(wěn)定、可重復(fù)使用、易保存等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1。
[0020]應(yīng)用0.8 — 0.65um的濾芯進(jìn)行澄清,首先用L_15液體平衡濾芯,之后對(duì)病毒液進(jìn)行澄清，病毒液澄清后要用L-15液體進(jìn)行沖洗，沖洗濾芯上的抗原殘留。
[0021]實(shí)施例2。
[0022]首先對(duì)750KD的中空纖維超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行在線消毒清洗，應(yīng)用的液體為0.5NNaOH。在線清洗后用無(wú)菌注射用水沖洗設(shè)備，用L-15液體平衡設(shè)備，平衡后對(duì)澄清液進(jìn)行濃縮，濃縮20~30倍，用L 一 15沖洗設(shè)備。超濾濃縮結(jié)束后，應(yīng)用0.5N NaOH對(duì)超濾設(shè)備進(jìn)行在線清洗，清洗后應(yīng)用0.1N NaOH保存。
[0023]實(shí)施例3。
[0024]應(yīng)用0.5N NaOH液在線清洗純化系統(tǒng)，純化應(yīng)用S印harose 4FF基質(zhì)。清洗體積為層析柱的I個(gè)體積。應(yīng)用0.01N PBS緩存液平衡，平衡體積為層析柱的一個(gè)體積。上樣品，上樣體積為層析柱凝膠體積的5%。在規(guī)定的壓力下應(yīng)用0.01N PBS緩存液進(jìn)行凝膠層析，收取第一峰，為抗原峰，以后各峰為雜蛋白峰。收取第一峰后，更換液體，應(yīng)用0.5N NaOH液在線清洗純化系統(tǒng)，清洗體積為層析柱的I個(gè)體積。在線清洗后應(yīng)用0.01N PBS緩存液平衡，平衡體積為層析柱的一個(gè)體積。平衡后用20%乙醇溶液保存層析凝膠。純化后樣品的抗原回收率能達(dá)到80%以上，雜蛋白去除率能達(dá)到98%以上。以下為相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.一種流感病毒的濃縮、純化方法，其特征在于有以下步驟: (1)應(yīng)用0.8~0.65um的濾芯進(jìn)行澄清； (2)750KD的中空纖維超濾濃縮； (3)Sepharose 4FF層析純化技術(shù)進(jìn)行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒的濃縮、純化方法，其特征在于:步驟(1)應(yīng)用.0.8~0.65um的濾芯進(jìn)行澄清是指:首先用L-15液體平衡濾芯，之后對(duì)病毒液進(jìn)行澄清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒的濃縮、純化方法，其特征在于:步驟(2)750KD的中空纖維超濾濃縮是指:應(yīng)用0.5N NaOH對(duì)750KD的中空纖維超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行在線消毒清洗，用L-15液體平衡設(shè)備，濃縮20~30倍數(shù)，之后用L 一 15沖洗設(shè)備，定容到預(yù)訂體積，超濾濃縮結(jié)束后，應(yīng)用0.5N NaOH對(duì)超濾設(shè)備進(jìn)行在線清洗，清洗后應(yīng)用0.1N NaOH保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒的濃縮、純化方法，其特征在于:步驟(3)Sepharose.4FF層析純化技術(shù)進(jìn)行純化是指:應(yīng)用0.5N NaOH液在線清洗純化系統(tǒng)，純化應(yīng)用Sepharose 4FF基質(zhì)，，應(yīng)用0.01N PBS緩存液平衡，上樣體積為層析柱凝膠體積的5%，收取第一峰。
【文檔編號(hào)】C12N7/02GK103923883SQ201310015169
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月16日
【發(fā)明者】周荔葆, 殷建文, 焦龍, 吳栩濤, 甄祖剛, 趙新 申請(qǐng)人:遼寧成大生物股份有限公司