引物各2 y L(引 物的終濃度均為0. 4 y mol/L)，模板DNA 1 y L，最后再加入醋酸鎂溶液2. 5 y L(280mmol/ L)〇
[0056] RPA擴(kuò)增反應(yīng)條件：將上述RPA擴(kuò)增體系充分混勾，置于37°C的金屬浴上反應(yīng) 40min，得到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0057] (2)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0058] RPA反應(yīng)結(jié)束后，向上述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 y L苯酚/氯仿（1:1)溶液，充分 混勾后12000rpm離心2min，取5 y L上清液于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀 察結(jié)果。并對RPA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。
[0059] 若RPA擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為284bp的條帶，則待測病毒為或候選為葡萄卷葉伴隨 病毒2號；
[0060] 若RPA擴(kuò)增產(chǎn)物不含有大小為284bp的條帶，則待測病毒不為或候選不為葡萄卷 葉伴隨病毒2號。
[0061] 三、用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑盒的應(yīng)用
[0062] 1、RNA的提取及cDNA的合成
[0063] 參照試劑盒操作（植物總RNA提取試劑盒，貨號為DP432,天根生物科技有限公 司）提取感染了葡萄卷葉伴隨病毒2號的葡萄葉片的RNA。并參照試劑盒（PrimeScript RT-PCR Kit，貨號為RR014A，TaKaRa)的操作，以獲得的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將 獲得的cDNA保存于-20 °C備用。
[0064] 2、RPA 擴(kuò)增
[0065] 以步驟1獲得的cDNA為模板，采用GLRaV2-F和GLRaV2-R引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增。同 時設(shè)置空白對照（DNA模板為超純水）。
[0066]RPA擴(kuò)增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp反應(yīng)管中加入 再水化緩沖液（Rehydration Buffer) 29. 5 yL，去離子水12. 5 yL，上、下游引物各2 yL，模 板DNA 1 y L，最后再加入醋酸鎂溶液2. 5 y L (280mmol/L)。
[0067] 將RPA擴(kuò)增體系充分混勻，置于37°C的金屬浴上反應(yīng)40min，得到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0068] 3、RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0069] RPA反應(yīng)結(jié)束后，向RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 y L苯酚/氯仿（1:1)溶液，充分混勻 后12000rpm離心2min，取上清液5 y L于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié) 果。并對RPA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序
[0070] 結(jié)果如圖1所示：葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物含有1個條帶，大小為 284bp，而陰性對照無條帶。說明本發(fā)明的用于檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA引物及 RPA試劑盒可以有效檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號。
[0071 ] 實(shí)施例2、RPA引物的特異性檢測
[0072]1、RNA的提取及cDNA的合成
[0073] 參照實(shí)施例1的步驟三中的RNA的提取及cDNA的合成方法，分別從感染了葡萄卷 葉伴隨病毒2號的葡萄葉片、感染了葡萄卷葉伴隨病毒3號的葡萄葉片、感染了沙地葡萄莖 痘伴隨病毒的葡萄葉片、感染了葡萄斑點(diǎn)病毒的葡萄葉片和感染了葡萄病毒A的葡萄葉片 中制備得到葡萄卷葉伴隨病毒2號的cDNA、葡萄卷葉伴隨病毒3號的cDNA、沙地葡萄莖痘 伴隨病毒的cDNA、葡萄斑點(diǎn)病毒的cDNA和葡萄病毒A的cDNA。
[0074] 2、RPA擴(kuò)增
[0075] 分別以步驟1獲得的葡萄卷葉伴隨病毒2號的cDNA、葡萄卷葉伴隨病毒3號的 cDNA、沙地葡萄莖痘伴隨病毒的cDNA、葡萄斑點(diǎn)病毒的cDNA和葡萄病毒A的cDNA為模板， 采用GLRaV2-F和GLRaV2-R進(jìn)行RPA擴(kuò)增，分別得到葡萄卷葉伴隨病毒2號、葡萄卷葉伴隨 病毒3號、沙地葡萄莖痘伴隨病毒、葡萄斑點(diǎn)病毒和葡萄病毒A的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。同時設(shè)置 空白對照（DNA模板為超純水）。
[0076] RPA擴(kuò)增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp反應(yīng)管中加入 再水化緩沖液（Rehydration Buffer) 29. 5 yL，去離子水12. 5 yL，上、下游引物各2 yL，模 板DNA 1 y L，最后再加入醋酸鎂溶液2. 5 y L (280mmol/L)。
[0077] 將RPA擴(kuò)增體系充分混勻，置于37°C的金屬浴上反應(yīng)40min，得到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0078] 3、RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
[0079] RPA反應(yīng)結(jié)束后，向RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 y L苯酚/氯仿（1:1)溶液，充分混勻 后12000rpm離心2min，取5 y L上清液于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié) 果。
[0080] 結(jié)果如圖2所示：從圖中可以看出：只有葡萄卷葉伴隨病毒2號的擴(kuò)增產(chǎn)物含有1 個大小為284bp的條帶，葡萄卷葉伴隨病毒3號、沙地葡萄莖痘伴隨病毒、葡萄斑點(diǎn)病毒和 葡萄病毒A均無條帶。說明本發(fā)明的RPA引物特異性高。
[0081] 實(shí)施例3、RPA引物的靈敏度檢測及與普通PCR靈敏度的對比
[0082]1、RNA的提取及cDNA的合成
[0083] 參照實(shí)施例1步驟三中的RNA的提取及cDNA的合成方法，分別從感染了葡萄卷葉 伴隨病毒2號的葡萄葉片樣品中制備得到葡萄卷葉伴隨病毒2號的cDNA，并將葡萄卷葉伴 隨病毒2號的cDNA進(jìn)行梯度稀釋，分別得到稀釋度為10°、10 \ 10 2、10 3、10 4和10 5的葡萄 卷葉伴隨病毒2號的cDNA。
[0084] 2、RPA 擴(kuò)增
[0085] 分別以上述步驟1得到的稀釋度為10°、10 \ 10 2、10 3、10 4和10 5的葡萄卷葉伴隨 病毒2號的cDNA為模板，采用GLRaV2-F和GLRaV2-R進(jìn)行RPA擴(kuò)增。
[0086] RPA擴(kuò)增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp反應(yīng)管中加入 再水化緩沖液（Rehydration Buffer) 29. 5 yL，去離子水12. 5 yL，上、下游引物各2 yL，模 板DNA 1 y L，最后再加入醋酸鎂溶液2. 5 y L (280mmol/L)。將RPA擴(kuò)增體系充分混勾，置于 37°C的金屬浴上反應(yīng)40min，得到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0087] 3、PCR 擴(kuò)增
[0088] 分別以上述步驟1得到的稀釋度為10°、10 \ 10 2、10 3、10 4和10 5的葡萄卷葉伴隨 病毒2號的cDNA為模板，采用V2dCPf2/V2CPrl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為515bp。引物序 列如下：
[0089] V2dCPf2：5, -ACGGTGTGCTATAGTGCGTG-3r ；
[0090] V2CPrl :5' -GCAGCTAAGTACGAATCTTC-3'。
[0091] PCR擴(kuò)增的體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)"AdvancesinthedetectionofGrapevine leafroll-associatedvirus2variants" 中的方法。
[0092] 3、電泳檢測
[0093] 1) RPA反應(yīng)結(jié)束后，分別向RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 y L苯酚/氯仿（1:1)溶液，充 分混勾，12000rpm離心2min，取5 yL上清液于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀 察結(jié)果。RPA電泳結(jié)果如圖3所示。
[0094] 2)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 yL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像 系統(tǒng)上觀察結(jié)果。PCR電泳結(jié)果如圖4所示。
[0095] 從圖3和圖4中均可以看出，本發(fā)明的RPA檢測引物和V2dCPf2/V2CPrl引物的靈 敏度均為10 4稀釋度。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA引物，由SEQ ID No. 1所示的單鏈DNA分子和SEQ ID No. 2所示的單鏈DNA分子組成。2. -種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA試劑，包括權(quán)利 要求1所述的引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的RPA試劑，其特征在于：所述引物1和所述引物2在所述RPA 試劑中的終濃度均為〇. 4 y mol/L。4. 一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的試劑盒，包括權(quán)利要 求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑。5. 權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在檢測或輔助檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在制備檢測或輔助檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號產(chǎn)品中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在檢測或輔助檢測待測樣品是否感染葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品是否感染葡萄卷葉伴隨病毒2號產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2或3所述的RPA試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在制備檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的產(chǎn)品中的應(yīng)用。7. -種檢測或輔助檢測待測病毒是否為葡萄卷葉伴隨病毒2號的方法，包括如下步 驟： (1) 用權(quán)利要求1所述引物對待測病毒進(jìn)行RPA擴(kuò)增，得到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物； (2) 檢測所述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的大??； 若所述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為284bp的片段，則所述待測病毒為或候選為葡萄卷葉 伴隨病毒2號； 若所述RPA擴(kuò)增產(chǎn)物不含有大小為284bp的片段，則所述待測病毒不為或候選不為葡 萄卷葉伴隨病毒2號。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述RPA擴(kuò)增的模板為待測病毒的cDNA。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述RPA擴(kuò)增的溫度為37°C，所述 RPA擴(kuò)增的時間為40min。10. 權(quán)利要求7-9中任一所述的方法在檢測或輔助檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA引物及試劑盒。本發(fā)明的RPA引物由SEQ？ID？No.1所示的單鏈DNA分子和SEQ？ID？No.2所示的單鏈DNA分子組成。通過試驗(yàn)證明：本發(fā)明的RPA引物特異性好、靈敏度高、檢測時間短、不需要特殊的儀器和適用范圍廣，且基于該引物建立了葡萄卷葉伴隨病毒2號的RPA檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、簡便和快速，對進(jìn)出口相關(guān)貨物及產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫具有指導(dǎo)意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/94, C12N15/11, C12Q1/70
【公開號】CN105063238
【申請?zhí)枴緾N201510551474
【發(fā)明人】張永江, 魏霜, 乾義柯, 張娜, 劉中勇
【申請人】中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月1日