一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒。本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中類風(fēng)濕因子檢測(cè)過程操作復(fù)雜、以及測(cè)定準(zhǔn)確度低的問題，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是：一種測(cè)定透明質(zhì)酸的試劑盒，該試劑盒由試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，其中R1試劑包含Tris緩沖液30~230 mmol/L、吐溫?80 2.0~6.0 mL/L、聚乙二醇?8000 5~15 g/L、EDTA 30~50 mmol/L、疊氮鈉0.4~1.0 g/L其溶劑為純化水；R2試劑包含Tris緩沖液50~150 mmol/L、甘油5~25 mmol/L、疊氮鈉0.4~1.0 g/L、牛血清白蛋白20~60 g/L乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體0.5~4.0%、其溶劑為純化水。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)可分為]^]\1、]^六、]^6、]^0、]^￡五型，是類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎血清中針對(duì)IgG Fc片段上抗原表位的一類自身抗體，類風(fēng)濕因子陽性患者較多伴 有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如皮下結(jié)節(jié)及血管炎等。IgM型RF陽性率為60%-78%。
[0003] 類風(fēng)濕因子(RF)是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病人血清中發(fā)現(xiàn)，是一種以變性IgG為 靶抗原的自身抗體，主要存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中，它是一種抗變性 IgG的抗體，屬IgM型。可與IgG Fc段結(jié)合。RA病人和約50%的健康人體內(nèi)都存在有產(chǎn)生RF的B 細(xì)胞克隆，在變性IgG(或與抗原結(jié)合的IgG)或EB病毒直接作用下，可大量合成RF。健康人產(chǎn) 生RF的細(xì)胞克隆較少，且單核細(xì)胞分泌的可溶性因子可抑制RF的產(chǎn)生，故一般不易測(cè)出。RF 主要為IgM類自身抗體，但也有IgG類、IgA類、IgD類和IgE類。各類RF臨床意義有所不同。測(cè) 定I gG、I gA、I gM類RF通常用ELI SA間接法，即用熱凝集兔I gG包被反應(yīng)板微孔，加入檢樣后， 再分別加抗人IgG、IgA、IgM酶標(biāo)記抗體，使反應(yīng)后再與底物呈色。為防止各Ig類別RF相互干 擾，酶標(biāo)記抗體使用標(biāo)記的抗體F (ab ) 2片段。
[0004] 但酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜，對(duì)操作者有較高的專業(yè)技能要求，且只 能定性或者半定量檢測(cè)。膠乳凝集實(shí)驗(yàn)只可定性檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中類風(fēng)濕因子檢測(cè)過程操作復(fù)雜、以及測(cè)定準(zhǔn)確 度低的問題，提供一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，包 括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 30~230 mmol/L 吐溫-80 2.0-6.0 mL/L 聚乙二醇-8000 5~15 g/L EDTA 30~50 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 試劑R2: Tris緩沖液 50~150 mmol/L 甘油 5~25 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 牛血清白蛋白 20~60 g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 0.5~4.0 % 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: Tris 緩沖液 130mmol/L 吐溫-80 4.0 mL/L 聚乙二醇-8000 10 g/L EDTA 40 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 試劑 R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 15 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 40g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 2.5 % 其溶劑為純化水。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體為含有能與抗人類風(fēng)濕因子抗體 特異性結(jié)合的Fab功能部位的單克隆完整抗體或抗體片段。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的乳膠抗人類風(fēng)濕因子抗體的粒徑在40~500nm之間。
[0012] 作為優(yōu)選，本測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒的制備方法和使用方法包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 30~230 mmol/L 吐溫-80 2.0-6.0 mL/L 聚乙二醇-8000 5~15 g/L EDTA 30~50 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0013] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 甘油 5~25 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 牛血清白蛋白 20~60 g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 0.5~4.0 % 其溶劑為純化水。
[0014] (c)將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)選的R1與試劑R2 的體積比為4:1，待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:80之間； (d) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (e) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的類風(fēng)濕因子的值。
[0015] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為4%，超聲分散，邊攪拌邊加入等體積的 含抗人類風(fēng)濕因子抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終濃度為2 g/ L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清，制得乳膠包被抗人類 風(fēng)濕因子抗體。
[0016] 本發(fā)明所采用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是抗原抗體反應(yīng)，樣品中類風(fēng)濕 因子(RF)可與試劑中RF致敏乳膠結(jié)合發(fā)生凝集反應(yīng)，產(chǎn)生一定濁度。該濁度高低與RF的含 量成正比。在一定波長(zhǎng)下測(cè)定濁度并通過多點(diǎn)定標(biāo)曲線可進(jìn)行類風(fēng)濕因子的定量測(cè)定。
[0017] 樣本中類風(fēng)濕因子(RF)的活性
式中：A AT以空白管吸光度作對(duì)照的樣品管吸光度值 A AS以空白管吸光度作對(duì)照的校準(zhǔn)管吸光度值 CS校準(zhǔn)液中RF的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明在試劑R1液中添加了聚乙二醇_ 8000，能夠加速反應(yīng);在試劑R2中采用乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體，對(duì)類風(fēng)濕因子的檢測(cè) 靈敏度更高，檢測(cè)準(zhǔn)確性更好，因此檢測(cè)準(zhǔn)確度高，另外檢測(cè)也比較方便。
[0018]
【附圖說明】： 圖1為本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0020] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris 緩沖液 130mmol/L 吐溫-80 4.0 mL/L 聚乙二醇-8000 10 g/L EDTA 40 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 其溶劑為純化水。
[0021] 試劑 R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 15 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 40g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 2.5 % 其溶劑為純化水。
[0022] 實(shí)施例2 試劑盒的制備和使用方法 1、將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散;然后在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下 離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為 4%，超聲分散，邊攪拌邊加入等體積的含抗人類風(fēng)濕因子抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫 反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終濃度為2 g/L;然后在在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄 上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清， 制得乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體。
[0023] 2、按照下列組分含量配制好試劑： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 30~230 mmol/L 吐溫-80 2.0-6.0 mL/L 聚乙二醇-8000 5~15 g/L EDTA 30~50 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0024] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 甘油 5~25 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 牛血清白蛋白 20~60 g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 0.5~4.0 % 其溶劑為純化水。
[0025] 3、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長(zhǎng):主波長(zhǎng)600nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、檢測(cè)步驟 (a)取224yl試劑R1與4yl待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入56yl試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 A A = A2-A1； (d)樣本中類風(fēng)濕因子(RH的活性
（U/mL)計(jì)算出樣本中的類風(fēng) 濕因子的活度。
[0026]參照附圖1，附圖1為用實(shí)施例1所制得的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒多次測(cè)定 不同樣本中類風(fēng)濕因子的測(cè)定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測(cè)定結(jié)果的對(duì)比分 析。從相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方程y = 0.9693x+1.755，R2=0.9907,從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好，可以 應(yīng)用于類風(fēng)濕因子的檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其特 征在于:所述的彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: Tris緩沖液 30~230 mmol/L 吐溫-80 2.0-6.0 mL/L 聚乙二醇-8000 5~15 g/L EDTA 30~50 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 50~150 mmol/L 甘油 5~25 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 牛血清白蛋白 20~60 g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 0.5~4.0 % 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的 試劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: Tris 緩沖液 130mmol/L 吐溫-80 4.0 mL/L 聚乙二醇-8000 10 g/L EDTA 40 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 甘油 15 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 40g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 2.5 % 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被 抗人類風(fēng)濕因子抗體為含有能與抗人類風(fēng)濕因子抗體特異性結(jié)合的Fab功能部位的單克隆 完整抗體或抗體片段。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠抗人 類風(fēng)濕因子抗體的粒徑在40~500nm之間。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于:試劑盒的制備方 法和使用方法包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好Rl試劑： Tris緩沖液 30~230 mmol/L 吐溫-80 2.0-6.0 mL/L 聚乙二醇-8000 5~15 g/L EDTA 30~50 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 其溶劑為純化水； (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 甘油 5~25 mmol/L 疊氮鈉 0.4~1.0 g/L 牛血清白蛋白 20~60 g/L 乳膠包被抗人類風(fēng)濕因子抗體 0.5~4.0 % 其溶劑為純化水； (c) 將待測(cè)樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (d) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (e) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的類風(fēng)濕因子的值。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被 抗人類風(fēng)濕因子抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到2 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為4%，超聲分散，邊攪拌邊加入等體積的 含抗人類風(fēng)濕因子抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)，膠乳顆粒最終濃度為2 g/ L； (C)將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4°C封閉過夜;離心去上清，制得乳膠包被抗人類 風(fēng)濕因子抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒的制備方法和使用方法，其特 征在于:步驟(c)中，所述的試劑Rl與試劑R2的體積比為4:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種測(cè)定類風(fēng)濕因子的試劑盒的制備方法和使用方法，其特 征在于:步驟(c)中，所述的待測(cè)樣本與試劑Rl和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:80之 間。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK105911285SQ201610359608
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請(qǐng)人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司