用于檢測葡萄糖的納米材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測葡萄糖的納米材料的制備方法，該方法包括如下步驟：（1）配置濃度為100-200mM的金屬鹽水溶液；（2）將葡萄糖氧化酶與過氧化物酶混合配置緩沖溶液；(3)將步驟（1）中的溶液與步驟（2）得到的溶液按體積比1∶150混合；(4)混勻步驟（3）得到的混合溶液，靜置得到沉淀物既為所述納米材料。本發(fā)明的方法可以簡單高效地合成具有高催化活性的雜合納米花，簡化了實驗操作步驟，大幅度提高了葡萄糖比色檢測體系對葡萄糖的響應信號。
【專利說明】用于檢測葡萄糖的納米材料的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米材料制備領域，尤其涉及一種多蛋白質/磷酸鹽的用于檢測葡萄 糖的納米材料的制備方法。

【背景技術】
[0002] 糖尿病是目前最常見的非傳染性疾病之一，它被認為是世界性的第三大危險疾 病，嚴重威脅著人類的健康。一般地來講，經典的比色型葡萄糖傳感器是基于葡萄糖氧化 酶（GOx)催化氧化葡萄糖產生過氧化氫，而后者在辣根過氧化物酶的催化下氧化一些生色 底物如3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺（TMB)而產生顏色變化，實現葡萄糖檢測。其檢測步驟一 般分兩步：首先葡萄糖和葡萄糖氧化酶以及氧氣在37°C下反應，葡萄糖產生葡萄糖酸和過 氧化氫；然后把前一步產生的含有過氧化氫的反應液與含有辣根過氧化物酶以及生色底物 (如TMB)的溶液混合，在37°C反應，產生顏色變化。但是這種傳統(tǒng)的葡萄糖傳感器存在一些 缺陷，首先，葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶都屬于生物酶系，它們在室溫下不穩(wěn)定，容易 失活和降解，因此這種傳感器無法長期儲存；第二，這種方法實質上是使用過氧化氫做中介 體，產生顏色變化的反應，但是過氧化氫不穩(wěn)定，在環(huán)境中很容易分解。所以這種方法的信 號強度(變色程度）和靈敏度都不高。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種用于檢測葡萄糖的納米材料的制備方法， 該方法可以簡單高效地合成具有很高催化活性的雜合納米花，由于在這種納米花上同時固 定有葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶，因而可以同時催化葡萄糖氧化生成過氧化氫反應和 過氧化氫氧化TMB變色的反應，簡化了傳統(tǒng)葡萄糖檢測過程中需要兩步酶促才能完成的反 應，簡化了實驗操作步驟，大幅度提高了葡萄糖比色檢測體系對葡萄糖的響應信號。
[0004] 本發(fā)明采用的技術方案是提供一種用于檢測葡萄糖的納米材料的制備方法，該方 法包括如下步驟：
[0005] (1)配置濃度為100_200mM的金屬鹽水溶液；
[0006] (2)將葡萄糖氧化酶與過氧化物酶按質量比1:1-1 :50混合后加入到濃度范圍為 5mM-0. 5M的磷酸鹽緩沖溶液中；
[0007] (3)將步驟⑴中的溶液與步驟⑵得到的溶液按體積比1 :50-1:200混合；
[0008] (4)混勻步驟⑶得到的混合溶液，靜置得到沉淀物即為所述納米材料。
[0009] 優(yōu)選地，步驟（1)所述金屬鹽選自氯化鈣、硫酸銅、氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鈷、硝酸 銀、氯化銫、硝酸鉛或氯化鉻。
[0010] 優(yōu)選地，步驟（2)所述磷酸鹽緩沖溶液為磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二 鈉、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀的磷酸緩沖溶液。
[0011] 優(yōu)選地，步驟（2)所述葡萄糖氧化酶選自黑曲霉的葡萄糖氧化酶或青霉的葡萄糖 氧化酶。
[0012] 優(yōu)選地，步驟（2 )所述過氧化物酶選自辣根的過氧化物酶、大豆的過氧化物酶或黑 管菌的過氧化物酶。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（2)所述葡萄糖氧化物酶與過氧化物酶按質量比為1:5的比例混合，
[0014] 優(yōu)選地，步驟（3)所述體積比為1:150。
[0015] 優(yōu)選地，步驟（4)所述靜置時間12-120小時，靜置溫度為5-50°C。
[0016] 本發(fā)明的效果是可以簡單高效地合成具有很高催化活性的納米材料即雜合納米 花，簡化了實驗操作步驟，大幅度提高了葡萄糖比色檢測體系對葡萄糖的響應信號。
[0017] 本發(fā)明使用葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶共同作為蛋白組分，與水合磷酸金屬 鹽制成了一種納米花。這種納米花具有十分規(guī)則的形貌，呈多層結構。傳統(tǒng)的兩步檢測法可 以在這種納米花上一步完成。在這個體系中，葡萄糖和氧氣在納米花上的葡萄糖氧化酶催 化下反應生成過氧化氫，過氧化氫可以立即被在同一納米花表面上相鄰的辣根過氧化物酶 催化氧化TMB完成變色反應。這種雙酶雜合的納米花結構避免了過氧化氫的擴散和分解， 因而大大提高了反應的信號強度和檢測靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明實例1中制備的納米花材料粉末衍射圖；
[0019] 圖2是本發(fā)明實例1中制備的納米花的低分辨掃描電子顯微鏡圖（SEM);
[0020] 圖3是本發(fā)明實例1中制備的納米花的高分辨掃描電子顯微鏡圖（SEM);
[0021] 圖4是本發(fā)明實施例1與對比實驗的吸收光譜圖。

【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進一步加以說明。
[0023] 實施例1
[0024] (1)使用分析天平和容量瓶配制120mM的硫酸銅水溶液。
[0025] (2)秤取lmg來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx)和lmg來源于辣根的過氧化物 酶（HRP)，加入到150mM磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7)中，使用容量瓶定容到10mL，得到含 0· 5mg/mL GOx 和 0· lmg/mLHRP 的 PBS 溶液。
[0026] (3)取 20 μ L120mM 的硫酸銅溶液加 3mL 含 0· 5mg/mL GOx 和 0· lmg/mL HRP 的 PBS溶液中，充分混勻該溶液，并在室溫下放置3天。得到的沉淀物質即為6〇1&!11^-Cu3(P0 4)2 · 3H20 納米花。
[0027] 實施例2
[0028] (1)使用分析天平和容量瓶配制100mM的氯化鐵水溶液。
[0029] (2)秤取5mg來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx)和lmg來源于大豆的過氧化物 酶（HRP)，加入到200mM磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7)中，使用容量瓶定容到10mL，得到含 0· 5mg/mL GOx 和 0· lmg/mL HRP 的 PBS 溶液。
[0030] (3)取 15 μ L120mM 的硫酸銅溶液加入 3mL 含 0· 5mg/mLG0x 和 0· lmg/mL HRP 的 PBS 溶液中，充分混勻該溶液，并在室溫下放置3天。得到的沉淀物質即為納米花。
[0031] 實施例3
[0032] (1)使用分析天平和容量瓶配制150mM的氯化鈣水溶液。
[0033] (2)秤取lmg來源于青霉的葡萄糖氧化酶（GOx)和2mg來源于黑管菌的過氧化物 酶（HRP)，加入到250mM磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7)中，使用容量瓶定容到10mL，得到含 0· 5mg/mL GOx 和 0· lmg/mL HRP 的 PBS 溶液。
[0034] (3)取 60 μ L120mM 的硫酸銅溶液加入 3mL 含 0· 5mg/mL GOx 和 0· lmg/mL HRP 的 PBS溶液中。充分混勻該溶液，并在室溫下放置3天。得到的沉淀物質即為納米花。
[0035] 應用例：
[0036] (1)在做葡萄糖測試時，將乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺 (TMB)溶液、葡萄糖標準溶液混合配成懸濁液；
[0037] (2)該懸濁液在37°C下避光反應30min。使用離心機離心上清，測吸收光譜。
[0038] 圖4表示的是用實施例1中制備的納米花催化氧化30 μ Μ葡萄糖產生過氧化氫， 后者氧化ΤΜΒ變色后測得的吸收光譜，與游離的葡萄糖氧化酶和過氧化物酶催化該反應后 的變色ΤΜΒ吸收光譜的對比。從吸收光譜可以看出，納米花催化氧化葡萄糖并導致ΤΜΒ變 色的反應效率比游離的葡萄糖氧化酶和過氧化物酶高3倍。
【權利要求】
1. 一種用于檢測葡萄糖的納米材料的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 配置濃度為100-200mM的金屬鹽水溶液； (2) 將葡萄糖氧化酶與過氧化物酶按質量比1:1-1 :50混合后加入到濃度為5mM-0. 5M 的磷酸鹽緩沖溶液中。 (3) 將步驟（1)中的溶液與步驟（2)得到的溶液按體積比1 :50-1:200混合； (4) 混勻步驟（3)得到的混合溶液，靜置得到沉淀物即為所述納米材料。
2. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（1)所述金屬鹽選自 氯化鈣、硫酸銅、氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鈷、硝酸銀、氯化銫、硝酸鉛或氯化鉻。
3. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述磷酸鹽緩沖 溶液為磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀的磷酸緩沖溶 液。
4. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述葡萄糖氧化 酶選自黑曲霉的葡萄糖氧化酶或青霉的葡萄糖氧化酶。
5. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述過氧化物酶 選自辣根的過氧化物酶、大豆的過氧化物酶或黑管菌的過氧化物酶。
6. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（2)所述葡萄糖氧化 物酶與過氧化物酶按質量比為1:1-1:10的比例混合。
7. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（3)所述體積比為 1:150。
8. 根據權利要求1所述的納米材料的制備方法，其特征在于：步驟（4)所述靜置時間為 12-120小時，靜置溫度為5-50°C。
【文檔編號】G01N21/31GK104155248SQ201310177644
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月14日 優(yōu)先權日:2013年5月14日
【發(fā)明者】汪鵬飛, 孫嘉宇, 葛介超, 劉衛(wèi)敏, 張洪艷 申請人:中國科學院理化技術研究所