一種檢測人類前列腺癌特異性基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速定性檢測人類前列腺癌特異性基因PCA3的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌(Prostate cancer，Pca)是常見的泌尿系惡性腫瘤，據(jù)美國腫瘤學(xué)會報道，Pca在美國的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌成為第一位，死亡率也高居第2。隨著生活節(jié)奏的加快和飲食結(jié)構(gòu)的西化，在我國及其他亞洲國家，Pca的發(fā)病率也在逐年升高，且發(fā)病年齡也趨于年輕化。早期診斷Pca可通過根治性切除術(shù)徹底治愈。因此，早期診斷對Pca的治療和患者的預(yù)后至關(guān)重要。
[0003]目前在臨床上仍根據(jù)前列腺特異性抗原(PSA)是否異常，指導(dǎo)前列腺穿刺活檢用來診斷Pca，具有一定的應(yīng)用價值，但是血清PSA為前列腺特異性抗原，只具備組織特異性而不具備腫瘤特異性。前列腺增生、前列腺炎等良性病變也可使PSA表達(dá)升高，導(dǎo)致許多患者遭受了不必要的活檢，暴露出PSA在Pca診斷中的局限性。因此，探尋敏感性及特異性更加優(yōu)越的Pca腫瘤標(biāo)志物，對提高Pca的早期診斷有著十分重要的意義。
[0004]PCA3被認(rèn)為是Pca的特異性基因，研究表明其在前列腺癌組織中高度表達(dá)，在正常前列腺組織或者前列腺增生組織中無表達(dá)或低表達(dá)，在其他腫瘤組織及器官中也無表達(dá)。但由于PCA3基因為非編碼基因，不表達(dá)為蛋白質(zhì)，檢測起來有一定難度。目前用于檢測PCA3基因最常用的方法為核酸擴(kuò)增技術(shù)(PCR)，雖然擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠，但檢測時程長，成本較高，操作繁瑣，不利于缺少技術(shù)設(shè)備的基層單位進(jìn)行檢測。
[0005]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，它采用4條特異性引物及I條環(huán)引物識別靶基因，其可在等溫條件下I小時可將目的序列擴(kuò)增10~9倍以上。LAMP反應(yīng)會產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，它們與LAMP反應(yīng)體系中的鎂離子(Mg2+)結(jié)合產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，引起濁度變化，十分便于觀察，且整個擴(kuò)增過程只需要一臺水浴鍋，大大加快了擴(kuò)增進(jìn)程并節(jié)省了實驗成本。如在LAMP反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素(一種熒光指示劑)，那么在反應(yīng)結(jié)束后會產(chǎn)生黃綠色熒光。不僅如此，隨著LAMP技術(shù)的逐漸發(fā)展，實時濁度檢測儀器也于今年來問世，將配置好的LAMP反應(yīng)體系置于濁度儀上進(jìn)行反應(yīng)可實時觀測濁度曲線，了解反應(yīng)進(jìn)程。
[0006]目前，公開的試劑盒反應(yīng)體系不夠穩(wěn)定，不利于檢測結(jié)果的快速獲取且假陽性結(jié)果較多，因此使得該試劑盒的商業(yè)使用受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明通過設(shè)計合適的引物并優(yōu)化檢測條件，提供一種快速、定性檢測人類前列腺癌特異性基因PCA3的試劑盒。該試劑盒包括以下試劑:引物、2倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、陽性對照、陰性對照、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和顯色劑，所述的引物由一對外引物、一對內(nèi)引物和一組環(huán)引物組成，所述的引物序列如下:
F3 (外引物):TGGATAITTAITTGAACGGGAT ；
B3 (外引物):AACGCACAGITTAGGCAG ；
LB (環(huán)引物):GGGAGGAGATAACCACGGG ；
FIP(內(nèi)引物):AGCCATCAAGAITTTCTCGTCTGITITTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG ;
BIP(內(nèi)引物):TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。
[0008]上述各引物量濃度分別為:FIP/BIP40 μΜ、F3/B3 5 μ MaB 20 μ Mo
[0009]本發(fā)明所述的2倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液(2XLAMP反應(yīng)液)由40mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tr i s-HCL )、20mM氯化鉀(KCL )、16mM硫酸鎂(MgS04 )、20mM硫酸銨((NH4 )2S04) 1.6mM 甜菜堿(Betaine)、2.8mM 的 dNTPs 和 0.2% 質(zhì)量百分濃度的吐溫 20(Tween20)組成。其中mM是摩爾濃度的單位，指的是每升溶液中所含有溶質(zhì)的摩爾數(shù)。
[0010]本發(fā)明的所述陽性對照可以由以下方法制備得到:按常規(guī)的Trizol法由前列腺癌組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，PCR法擴(kuò)增包含等溫擴(kuò)增部分的一段序列，擴(kuò)增結(jié)束經(jīng)測序鑒定后，裝入T載體克隆后抽提質(zhì)粒DNA，測定DNA濃度，然后調(diào)整濃度為每微升10~6拷貝作為陽性對照。
[0011]本發(fā)明所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的BstDNA聚合酶，活力為8個活性單位/微升；所述逆轉(zhuǎn)錄酶采用鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，活力為10個活性單位/微升；所述的陽性對照為含人前列腺癌特異性基因PCA3的CDNA樣本；陰性對照為雙蒸水；所述顯色劑為鈣黃綠素螯合劑，所述鈣黃綠素螯合劑，為鈣黃綠素與Mg2+的螯合物，是一種熒光指示劑。LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸離子與鎂離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，發(fā)出黃綠色熒光。以上試劑均由上海生工生物技術(shù)公司提供。
本發(fā)明還提供一種檢測人類前列腺癌特異性基因PCA3的方法，具體包括以下步驟: Cl)常規(guī)方法提取組織、血液或尿液中的RNA ；
(2)配置擴(kuò)增體系，每25ul擴(kuò)增體系中，含有外引物Iul;內(nèi)引物Iul，環(huán)引物lul，2倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液12.5ul，BstDNA聚合酶0.9ul，鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶0.1ul，步驟(I)中RNA提取液I?5ul (具體用量根據(jù)提取物來源不同，組織來源I?2ul，血液、尿液來源4?5ul)，其余為去離子水及鈣黃綠素顯色劑(如采用實時濁度分析儀可不加)；63°C恒溫反應(yīng)I小時；
(3)反應(yīng)結(jié)束后，可直接肉眼觀察，反應(yīng)管內(nèi)液體變?yōu)辄S綠色說明檢測結(jié)果陽性；如采用實時濁度分析儀檢測可直接觀察反應(yīng)擴(kuò)增曲線，如有曲線記錄則為陽性。
[0012]本發(fā)明的工作原理是:LAMP反應(yīng)分為三步，即:起初反應(yīng)物模板的合成、循環(huán)擴(kuò)增階段、延伸和再循環(huán)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)過程是先由外引物擴(kuò)增出內(nèi)引物擴(kuò)增所需要的模板，即起始反應(yīng)物模板的合成；緊接著由內(nèi)引物引導(dǎo)合成靶基因DNA片段，由于內(nèi)引物擴(kuò)增的DNA片段含有該引物5’端DNA片段的反向互補(bǔ)序列，因而這些反向互補(bǔ)序列之間通過雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)另外一條內(nèi)引物與其互補(bǔ)鏈退火雜交后引導(dǎo)鏈置換合成反應(yīng)，在擴(kuò)增的DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)LAMP反應(yīng)的反應(yīng)原理，一般擴(kuò)增反應(yīng)均在I小時的擴(kuò)增時間內(nèi)達(dá)到平臺期，而如果反應(yīng)開始的時間約晚就越容易造成一些中間產(chǎn)物相互反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，影響實驗的準(zhǔn)確性。為此，我們在啞鈴狀結(jié)構(gòu)的5’末端的環(huán)狀單鏈部分導(dǎo)入具有互補(bǔ)序列的環(huán)引物，可增加DNA合成的起點，可使反應(yīng)開始的時間提升約20%，并在I小時該循環(huán)反應(yīng)可使靶DNA累積到10~9拷貝，可通過熒光染料或?qū)崟r濁度分析儀來觀察擴(kuò)增結(jié)果。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過加入環(huán)引物顯著提升反應(yīng)速率，平均反應(yīng)開始時間為19.3min，而在之前的研究中未加入環(huán)引物平均反應(yīng)開始時間為24.lmin。在實驗結(jié)果可靠性的比較中，加入環(huán)引物后假陽性結(jié)果明顯減少。與PCR技術(shù)相比，檢測時間減少約50%，在檢測成本方面也較PCR明顯減少。
【附圖說明】
[0014]圖1為自然燈光下各個樣本的LAMP結(jié)果。
[0015]圖2為各個樣本的實時濁度儀擴(kuò)增曲線。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0017]如圖所示。圖1中1~6號管為前列腺癌患者標(biāo)本經(jīng)LAMP反應(yīng)后的情況，可直觀看出產(chǎn)生黃綠色熒光，而7~8號的良性前列腺增生患者無熒光產(chǎn)生。圖2中1~5號擴(kuò)增區(qū)域為前列腺癌患者血樣，6~8號擴(kuò)增區(qū)域為前列腺增生患者血樣，平均的反應(yīng)開始時間提升約20%。一種檢測人類前列腺癌特異性基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑盒，包括:引物、2倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、陽性對照、陰性對照、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和顯色劑；所述的引物是根據(jù)DNA序列數(shù)據(jù)庫公布的人類PCA3基因序列設(shè)計的一對外引物、一對內(nèi)引物及一組