專(zhuān)利名稱(chēng)：N-連接糖鏈分析用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分析領(lǐng)域，特別是指一種N-連接糖鏈分析用試劑。

背景技術(shù)：
近十年來(lái)，繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，糖組學(xué)正成為生命科學(xué)研究中又一新的前沿和熱點(diǎn)。研究表明，糖鏈參與了各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞識(shí)別、粘連與融合、信號(hào)傳遞、免疫與應(yīng)答、細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生都離不開(kāi)糖鏈的參與。如果糖基化修飾出現(xiàn)缺陷，就會(huì)發(fā)生先天性糖基化缺陷疾病，目前在人類(lèi)中已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種此類(lèi)疾病。細(xì)胞惡變?nèi)绨┌Y的發(fā)生與糖基化異常也有密切關(guān)系，癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移就是由糖鏈介導(dǎo)的糖鏈與蛋白相互作用完成的。因此，糖鏈在生命活動(dòng)調(diào)節(jié)中扮演著非常重要的作用，糖鏈的結(jié)構(gòu)研究有助于最終闡明參與糖鏈合成的有關(guān)糖基化轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶表達(dá)基因的功能，也有助于闡明相關(guān)疾病發(fā)生的機(jī)理。
根據(jù)與糖鏈連接方式不同，蛋白質(zhì)主要有N-連接(寡糖中的N-乙酰葡糖胺與多肽鏈中的天冬酰胺殘基的酰胺氮連接)和O-連接(寡糖中的乙酰半乳糖胺與多肽鏈中的絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基相接)兩種糖基化形式。這兩種連接糖蛋白主要定位于細(xì)胞膜表面。近年，因N-連接糖鏈對(duì)細(xì)胞癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、以及造血功能起著重要作用而其結(jié)構(gòu)與生物功能之間關(guān)系研究倍受人們的關(guān)注。為了這些研究得到順利進(jìn)行，不僅需要研制開(kāi)發(fā)相關(guān)糖類(lèi)分析儀器，而且更急需開(kāi)發(fā)糖鏈相關(guān)試劑和新的高靈敏、高選擇性、簡(jiǎn)便的N-連接糖鏈分析方法。
研究糖蛋白糖鏈的傳統(tǒng)方法一般是將糖鏈切掉(化學(xué)法和酶法)并分離純化后進(jìn)行分析。如何分離、純化從糖蛋白糖鏈中釋放的糖鏈，是糖鏈結(jié)構(gòu)分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但糖鏈的分離、純化卻是一項(xiàng)復(fù)雜和摸索性很強(qiáng)的工作，其原因主要有以下因素造成(1)糖鏈自身在組成、連接、衍生化、微觀(guān)不均一性等方面具有高度復(fù)雜性。組成糖鏈的單糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙?；肴樘堑染哂邢嗨频慕Y(jié)構(gòu)，這使從糖蛋白中釋放的寡糖的結(jié)構(gòu)具有相似性。(2)生物來(lái)源的糖蛋白的樣品含量往往很少，在分離、純化從糖蛋白中釋放的寡糖鏈時(shí)，要求對(duì)糖鏈具有高靈敏的檢測(cè)。由于糖鏈本身沒(méi)有發(fā)色基團(tuán)，盡管示差、脈沖檢測(cè)可以用于非衍生化糖鏈的檢測(cè)，但對(duì)含量低的生物來(lái)源的樣品來(lái)說(shuō)，它的檢測(cè)靈敏度并不能滿(mǎn)足上述微量樣品的要求。為了在分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程中能夠更有效地檢測(cè)到糖鏈，往往要對(duì)糖鏈進(jìn)行衍生化，這對(duì)于微量糖鏈的分離分析是十分必要的。目前，已開(kāi)發(fā)的幾種糖鏈柱前衍生化方法中，與糖鏈還原端反應(yīng)的還原胺化HPLC實(shí)用范圍較廣，應(yīng)用較多。常用的衍生化試劑有對(duì)氨基苯甲酸乙酯(ABEE)、8-氨基奈-1，3，6-三磺酸(ANTS)和2-氨基吡啶(2-AP)等。但是，這些方法包括糖鏈切掉、糖鏈與衍生化試劑的反應(yīng)等幾步程序，其操作繁瑣費(fèi)時(shí)，而且在糖鏈衍生化過(guò)程中還可能發(fā)生還原端異構(gòu)化、β-消除反應(yīng)、唾液酸丟失等。近十年來(lái)，生物質(zhì)譜軟電離技術(shù)在糖鏈物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方面有了長(zhǎng)足進(jìn)展，高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜(MS)串連技術(shù)已成為糖鏈結(jié)構(gòu)解析的強(qiáng)大工具，特別是質(zhì)譜具有微量、快速、準(zhǔn)確和高通量的特點(diǎn)，與柱前衍生化的HPLC純化方法相配合，有望實(shí)現(xiàn)糖鏈結(jié)構(gòu)研究的突破。但目前的衍生化方法往往引起質(zhì)譜靈敏度的降低，因此，發(fā)展操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和、選擇性高的衍生化方法，既能提高HPLC檢測(cè)靈敏度，又能提高后續(xù)質(zhì)譜靈敏度的方法，這將是柱前衍生化發(fā)展的重要內(nèi)容。
近年，有人報(bào)道了糖鏈轉(zhuǎn)移酶endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)。Endo-M切斷N-連接糖鏈五糖核心最內(nèi)側(cè)的兩個(gè)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc-GlcNAc)之間的糖苷鍵，將其中一個(gè)GlcNAc留在多肽鏈上，并把釋放出來(lái)的糖鏈轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)含有GlcNAc殘基的受體。為了利用Endo-M酶水解和糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，已開(kāi)發(fā)了Fmoc-Asn-GlcNAc、DNS-Asn-GlcNAc(DNS-5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl；Asn-GlcNAcasparaginyl-N-acetyl-D-glucosamine)等熒光受體，一步完成糖鏈的酶切和糖鏈的衍生化反應(yīng)。但糖鏈對(duì)該受體的轉(zhuǎn)移率低，從而限制了實(shí)際樣品的分析應(yīng)用。最近，Toyooka等人利用GlcNAc-Asn與DBD-F(4-(N，N-dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2，1，3-benzoxadiazole)等熒光衍生化試劑的反應(yīng)，合成了幾種含有GlcNAc殘基的熒光標(biāo)記受體，從中選擇糖鏈轉(zhuǎn)移率較高(大約15％)的NDA-Asn-GlcNAc(NDA2，3-naphthalene-dialdehyde)、DBD-Asn-GlcNAc受體，利用Endo-M酶反應(yīng)，建立了簡(jiǎn)便的N-連接糖鏈分離分析方法。在Endo-M酶反應(yīng)中，雖然他們所合成的NDA-Asn-GlcNAc、DBD-Asn-GlcNAc兩種熒光受體的糖鏈轉(zhuǎn)移率比DNS-Asn-GlcNAc、Fmoc-Asn-GlcNAc高一些，但難于滿(mǎn)足微量生物樣品的分析要求。目前，已開(kāi)發(fā)的Endo-M酶反應(yīng)糖鏈?zhǔn)荏w幾乎都是以Asn-GlcNAc為母體，在Asn的氨基上標(biāo)記熒光試劑而制成的。但是，這些受體的糖鏈轉(zhuǎn)移率普遍較低，其原因可能是因?yàn)镋ndo-M的糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)和酶水解反應(yīng)條件幾乎相同，以致糖鏈轉(zhuǎn)移生成物重新被Endo-M水解。當(dāng)以Boc-Asn-GlcNAc為母體，在Asn的羧基上標(biāo)記DBD時(shí)，DBD-Boc-Asn-GlcNAc受體的糖鏈轉(zhuǎn)移率比DBD-Asn-GlcNAc受體的糖鏈轉(zhuǎn)移率提高兩倍，這說(shuō)明反應(yīng)物的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與酶糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)有密切關(guān)系。雖然上述熒光標(biāo)記受體在熒光檢測(cè)器上靈敏度較高，但其質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度卻滿(mǎn)足不了微量生物樣品的分析。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種一步完成糖鏈的酶切和衍生化，然后，采用色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、高靈敏、高選擇性的N-鏈接糖鏈分析方法所使用的N-連接糖鏈分析用試劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和2-肼基-1-甲基吡啶(HMP)為起始物，反應(yīng)合成HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)，該HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉爾特試劑P(GP)為起始物，反應(yīng)合成GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)，該GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉爾特試劑T(GT)為起始物，反應(yīng)合成GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)，該GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和1-甲基-4-[2，4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(PDPZ)為起始物，反應(yīng)合成PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)，該試劑PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)具有如下結(jié)構(gòu)式
PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV) 一種N-連接糖鏈分析用試劑，在上述的PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)和碘甲烷反應(yīng)合成MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)，該MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
本發(fā)明人基于現(xiàn)有技術(shù)考慮，設(shè)想采用Boc-Asn-GlcNAc作為Endo-M酶反應(yīng)受體，再在Asn的羧基上分別標(biāo)記易離子和已帶電荷的受體，以便提高糖鏈轉(zhuǎn)移率和糖鏈衍生物在質(zhì)譜檢測(cè)器上的檢測(cè)靈敏度，并利用Endo-M酶糖鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，一步完成糖鏈的酶切和衍生化，然后，采用色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、高靈敏、高選擇性的N-鏈接糖鏈分析方法，為糖鏈生物功能的深入研究提供有效、可靠的分析檢測(cè)手段。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)的合成 24mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入48mg HMP、167mg TPP、138mgDPDS，室溫，避光條件下反應(yīng)30min，減壓抽除溶劑，然后加入10mlCH2Cl2攪拌5min，過(guò)濾分離出固體，用CH2Cl2洗滌固體數(shù)次，直到無(wú)色為止。然后用甲醇溶解，過(guò)濾，濃縮母液，得到白色晶體HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)。
ESI-MS譜圖數(shù)據(jù)(m/z)541.2(M+)
實(shí)施例2 GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)的合成 20mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入24mg(GP)、125mg TPP、105mgDPDS，室溫，避光條件下反應(yīng)30min，減壓抽除溶劑，然后加入10mlCH2Cl2攪拌5min，過(guò)濾分離出固體，用CH2Cl2洗滌固體數(shù)次，直到無(wú)色為止。然后用甲醇溶解，過(guò)濾，濃縮母液，得到白色晶體GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)。
MALDI-TOF-MS譜圖數(shù)據(jù)(m/z)569.4(M+)
實(shí)施例3 GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)的合成 20mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入21mg(GT)、125mg TPP、105mgDPDS，室溫，避光條件下反應(yīng)30min，減壓抽除溶劑，然后加入10mlCH2Cl2攪拌5min，過(guò)濾分離出固體，用CH2Cl2洗滌固體數(shù)次，直到無(wú)色為止。然后用甲醇溶解，過(guò)濾，濃縮母液，得到白色晶體GP-Boc-Asn-GlcNAc(III)。
MALDI-TOF-MS譜圖數(shù)據(jù)(m/z)549.3(M+)
實(shí)施例4 PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)的合成 34.3mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入42.3mg 1-甲基-4-[2，4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(PDPZ)、133.7mg TPP、122.9mg DPDS，室溫，避光條件下反應(yīng)30min，減壓抽除溶劑，加適量水，用CH2Cl2萃取后減壓旋干水層，經(jīng)硅膠柱(CH2Cl2/CH3OH體積比10∶1)，得橙黃色粉末PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)。
ESI-MS譜圖數(shù)據(jù)(m/z)768.3[M+H]+；790.3[M+Na]+
實(shí)施例5 MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(II)的合成 24.2mg PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc甲醇(乙腈、丙酮等)中加入適量碘甲烷，40-80℃水浴，反應(yīng)0.5-1h，N2吹干，得亮黃色晶體粉末MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)。
ESI-MS譜圖數(shù)據(jù)(m/z)782.4(M+)
本發(fā)明中的五種試劑都含有N-乙酰葡萄糖胺結(jié)構(gòu)，可以利用Endo-M切斷N-連接糖鏈五糖核心最內(nèi)側(cè)的兩個(gè)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc-GlcNAc)之間的糖苷鍵，將其中一個(gè)GlcNAc留在多肽鏈上，并把釋放出來(lái)的糖鏈轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)含有GlcNAc殘基(我們合成的五種受體受體)上。由于該五種受體易離子化或已帶電荷，所以可以提高糖鏈衍生物在質(zhì)譜檢測(cè)器上的檢測(cè)靈敏度，為糖鏈生物功能的深入研究提供高靈敏的分析試劑。
權(quán)利要求
1.一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和2-肼基-1-甲基吡啶(HMP)為起始物，反應(yīng)合成HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)，該HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
2.一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉爾特試劑P(GP)為起始物，反應(yīng)合成GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)，該GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
3.一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉爾特試劑T(GT)為起始物，反應(yīng)合成GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)，該GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
4.一種N-連接糖鏈分析用試劑，以Boc-Asn-GlcNAc和1-甲基-4-[2，4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(PDPZ)為起始物，反應(yīng)合成PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)，該P(yáng)DPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種N-連接糖鏈分析用試劑，其特征在于所述的PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)和碘甲烷反應(yīng)合成MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)，該MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)試劑具有如下結(jié)構(gòu)式
全文摘要
本發(fā)明涉及N-連接糖鏈分析用試劑，具體指HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)、GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)、GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)、PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)和MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)共五種試劑。該試劑都含有N-乙酰葡萄糖胺結(jié)構(gòu)，可以一步完成糖鏈的酶切和衍生化，然后，采用色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、高靈敏、高選擇性的N-鏈接糖鏈分析方法，可以提高糖鏈衍生物在質(zhì)譜檢測(cè)器上的檢測(cè)靈敏度，為糖鏈生物功能的深入研究提供高靈敏的分析試劑。
文檔編號(hào)C07H13/04GK101759633SQ20101003082
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者金東日, 國(guó)營(yíng) 申請(qǐng)人:延邊大學(xué)