一種重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C. 1. 1. 3. 4)是一種同型二聚體糖蛋白，由兩 個(gè)相同的多肽鏈通過(guò)二硫鍵共價(jià)結(jié)合組成，同時(shí)含有兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷 酸（FAD)輔因子，該酶以分子氧作為電子受體，可以氧化0-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧 化氫。
[0003] 葡萄糖氧化酶由于底物專一性強(qiáng)、催化效率高、無(wú)毒副作用，在醫(yī)療診斷、食品加 工、飼料及紡織工業(yè)中均有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。葡萄糖氧化酶能夠特異性識(shí)別葡萄糖，因此被 廣泛應(yīng)用于臨床中葡萄糖含量的檢測(cè)，如尿糖的檢測(cè)、血糖的測(cè)定，可以有效監(jiān)測(cè)糖尿病人 的尿糖、血糖含量。同時(shí)，葡萄糖氧化酶作為一種天然的食品添加劑，可以去除葡萄糖、脫除 氧氣，而且催化反應(yīng)生成的葡萄糖酸對(duì)人體無(wú)害，生成的過(guò)氧化氫能夠起到有效的殺菌抑 菌作用，防止變質(zhì)，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。
[0004] 葡萄糖氧化酶廣泛分布于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，但是動(dòng)植物體內(nèi)的葡萄糖氧化酶 含量低而且提取純化工藝復(fù)雜；目前葡萄糖氧化酶主要來(lái)源于微生物體內(nèi)，如黑曲霉及青 霉，但是仍然存在產(chǎn)量低和提取純化難度大的問(wèn)題。葡萄糖氧化酶在其它微生物表達(dá)宿主 中的表達(dá)水平也普遍不高（表1)，雖然在巴斯德畢赤酵母及釀酒酵母中的表達(dá)量較高，但 是發(fā)酵過(guò)程中均需要轉(zhuǎn)接而且需要用大量的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，程序繁瑣，成本高，更為重要的 是巴斯德畢赤酵母不是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)認(rèn)證的安全的微生物（GRAS微生 物），生物安全性存在隱患，不適合應(yīng)用于食品和醫(yī)療領(lǐng)域中。因此，開(kāi)發(fā)產(chǎn)量高、安全性高、 發(fā)酵提純工藝簡(jiǎn)單、成本低的新的表達(dá)系統(tǒng)是十分必要的。
[0005] 表1、產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌株及其表達(dá)量
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 核酸分子，是Agod基因或RNA分子， 所述Agod基因?yàn)槿缦耡) -f)中任一所述的DNA分子或cDNA分子： a) 其編碼序列是SEQIDNo. 1的第4682-6520位的DNA分子或cDNA分子； b) 其編碼序列是SEQIDNo. 1的第4733-6520位的DNA分子或cDNA分子； c) 其編碼序列是SEQIDNo. 2的DNA分子或cDNA分子； d) 其編碼序列是SEQIDNo. 2的第52-1821位的DNA分子或cDNA分子； e) 與a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且與a)或 b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有相同功能的cDNA分子或基因組DNA分子； f) 在嚴(yán)格條件下與a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列雜交，且與a)或b)或c)或 d)具有相同功能的cDNA分子或基因組DNA分子； 所述RNA分子為如下g)-j)中任一所述的RNA分子： g) 其編碼序列是將SEQIDNo. 1的第4682-6520位中的T均替換為U，其它核苷酸不 變得到的RNA分子； h) 其編碼序列是將SEQIDNo. 1的第4733-6520位中的T均替換為U，其它核苷酸不 變得到的RNA分子； i) 其編碼序列是將SEQIDNo. 2中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子； j) 其編碼序列是將SEQIDNo. 2的第52-1821位中的T均替換為U，其它核苷酸不變 得到的RNA分子。
2. 與權(quán)利要求1所述核酸分子相關(guān)的遺傳材料，為下述B1)至B5)中至少一種： B1)含有權(quán)利要求1所述核酸分子的表達(dá)盒； B2)含有權(quán)利要求1所述核酸分子的重組載體、或含有B1)所述表達(dá)盒的重組載體； B3)含有權(quán)利要求1所述核酸分子的重組微生物、或含有B1)所述表達(dá)盒的重組微生 物、或含有B2)所述重組載體的重組微生物； B4)含有權(quán)利要求1所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基 因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； B5)含有權(quán)利要求1所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系、或含有B1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物細(xì)胞系、或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系。
3. 重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括對(duì)受體細(xì)胞中導(dǎo)入權(quán)利要求1所述Agod基因，得到產(chǎn)葡 萄糖氧化酶的重組細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng) 物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述微生物為真菌、細(xì)菌、酵母或藻。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述真菌為木霉屬真菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于：所述木霉屬真菌為里氏木霉。
8. 按照權(quán)利要求3-7中任一所述方法構(gòu)建的重組細(xì)胞。
9. 制備葡萄糖氧化酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求3-8中任一所述重組細(xì)胞，得到葡萄 糖氧化酶。
10. 下述1)或2)或3)所述的應(yīng)用： 1)權(quán)利要求1所述核酸分子在制備葡萄糖氧化酶中的應(yīng)用； 2) 權(quán)利要求2所述遺傳材料在制備葡萄糖氧化酶中的應(yīng)用； 3) 權(quán)利要求8所述重組細(xì)胞在制備葡萄糖氧化酶中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的制備方法及其應(yīng)用。將本發(fā)明的Agod基因?qū)肜锸夏久筎u6△tku70中構(gòu)建的重組里氏木霉Tu6△tku70::Agod能夠成功地表達(dá)重組黑曲霉葡萄糖氧化酶，而且表達(dá)量較高，發(fā)酵液中的酶活力可達(dá)到137U/mL，是目前產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株中搖瓶發(fā)酵酶活力的最高水平。將發(fā)酵液中的重組黑曲霉葡萄糖氧化酶通過(guò)鎳柱純化后測(cè)定的酶活力可達(dá)到342U/mL，重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力為155U/mg蛋白。采用本發(fā)明的方法制備的重組黑曲霉葡萄糖氧化酶具有很好的熱穩(wěn)定性和較好的酸堿耐受性，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，不需轉(zhuǎn)接，原料廉價(jià)易得，成本大大降低，可廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)療領(lǐng)域中。
【IPC分類】C12N15-80, C12N1-15, C12N9-04, C12R1-885, C12N15-53
【公開(kāi)號(hào)】CN104711273
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510115372
【發(fā)明人】董志揚(yáng), 馬枝枝, 陳秀珍, 林潔, 黃振邦, 秦麗娜
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
【公開(kāi)日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日