專利名稱：：已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于一種含有酶的葡萄糖檢測方法的試劑盒，特別是涉及一種已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
：葡萄糖的測定方法已知的就有12種之多，在這些方法中，有的方法易受反應(yīng)液中還原性物質(zhì)、其它糖類干擾而產(chǎn)生偽陰性與偽陽性偏差而很少應(yīng)用。目前，國內(nèi)外檢測葡萄糖最常用的方法是酶法，以酶為試劑可以提高特異性，臨床實(shí)驗(yàn)室常使用葡萄糖氧化酶(G0D)法和己糖激酶(HK)法測定葡萄糖。葡萄糖氧化酶法易受維生素C、尿酸、尿素、膽紅素、肌酐的干擾，而以上各物質(zhì)對己糖激酶法無干擾。己糖激酶法測定血液中的葡萄糖因其特異性強(qiáng)、精密度和準(zhǔn)確度非常高是目前國際上公認(rèn)測定葡萄糖的參考方法而被廣大實(shí)驗(yàn)室采用。目前各實(shí)驗(yàn)室使用的己糖激酶法試劑盒，雖由多家單位生產(chǎn)，但其中各種試劑盒的試劑基本相似，緩沖液PH都在7.5±0.2，可使還原型輔酶I(NADH)或還原型輔酶n(NADPH)活性最高；差異在于已糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、三磷酸腺苷(ATP)、輔酶I(NAD+)或輔酶II(NADP+)加入濃度不同。下面是幾種廠家己糖激酶法試劑盒配方《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中配方三乙醇胺鹽酸緩沖液(PH7.5)50mmol/LMgSCk2.0畫1/LATP2.0,1/LNADP+2.0咖ol/LHK》1500U/LG6PD2500U/L使用方法樣品試劑=1:ioo，混勻后io分鐘檢測。日本0LYPUS配方PIPES緩沖液24.0mmol/LMg2+2.37咖ol/LATP2.0畫1/L彥1.32,1/LHK600U/LG6PD1600U/L3穩(wěn)定劑適量使用方法樣品試劑I:試劑n-i:100:20，混勻后5分鐘檢測。德國LEADMEN生化技術(shù)有限公司配方緩沖液100mmol/L(PH7.6)ATP4.0畫1/L騰+3.0畫ol/LHK>100U/mLG6PD>300U/mL疊氮鈉0.09%使用方法樣品試劑I:試劑11=1:ioo:20，混合后5分鐘檢測。上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司配方-三乙醇胺鹽酸緩沖液50mmol/LATP1.5畫1/L薩+0.7畫1/LHK2000U/LG6PD3000U/L使用方法樣品試劑I:試劑n二i:120:30，混勻后3分鐘檢測。上海長征-康仁醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司配方三乙醇胺鹽酸緩沖液50mmol/L(PH7.5±0.2)(25°C)ATP1.3腸1/L,+0.65,1/L服》1500U/LG6PD》2500U/L使用方法樣品試劑=1:150，混勻后3分鐘檢測。己糖激酶(服)法檢測葡萄糖的過程包括兩步偶聯(lián)反應(yīng)，己糖激酶催化葡萄糖與ATP之間的反應(yīng)，生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖與NAD+(或皿DP+)在G6PD的催化下反應(yīng)生成NADH(或NADPH)與等摩爾的6-把ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給葡萄糖的反應(yīng)是由HK催化，并需要鎂離子參加，使服被充分齄活，己糖激酶對葡萄糖的米氏常數(shù)Km為0.01mmol?！度珖R床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中報(bào)道，己糖激酶法測定葡萄糖所用的G6PD是從哺乳動(dòng)物中提取的NADP+作底物，而目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用細(xì)菌產(chǎn)生的G6PD作為底物。細(xì)菌酶的優(yōu)點(diǎn)在于，因?yàn)榧t細(xì)胞中以NADP+和葡萄糖-6-磷酸作底物，在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化下的反應(yīng)不影響葡萄糖測定結(jié)果，這樣就減少了溶血的干擾，目前的試劑盒多是以NAD+為底物的配方。.從己糖激酶法的反應(yīng)機(jī)制看，在健康人群血清檢測時(shí)，各種檢測方法的數(shù)值相差不大。如圖2、圖3為檢測正常對照組血清，使用本發(fā)明己糖激酶法試劑盒單一試劑和上海豐匯公司己糖激酶法試劑盒單一試劑測定同一標(biāo)本，其乳酸脫氫酶(LDH)為136.0U/L,a-羥丁酸敗氫酶(a-HBDH)為107.0U/L，葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖值為5.87mmol/L?，F(xiàn)有己糖激酶法試劑盒測定值為5.78mmol/L，本發(fā)明己糖激酶法試劑盒測定值為5.82mmmol/L，均為正常反應(yīng)曲線，準(zhǔn)確度和精密度都很高。但現(xiàn)有的己糖激酶法測定葡萄糖時(shí)，易受內(nèi)源性心肌酶及有機(jī)酸的干擾而使檢測結(jié)果偏低。特別是測定在肝轉(zhuǎn)移癌、惡性貧血、急性心肌梗塞等患者血液中LDH、a-HBDH活性高的葡萄糖時(shí)，易導(dǎo)致誤診誤治。在肝轉(zhuǎn)移癌、惡性貧血、急性心肌梗塞患者中，血液中LDH、a-HBDH活性都很高，同時(shí)伴有丙酮酸、a-酮丁酸升高，用己糖激酶法測定其葡萄糖時(shí)，一旦有NADH生成，它將會(huì)產(chǎn)生干擾反應(yīng)在LDH催化下，NADH與丙酮酸反應(yīng)，生成L-乳酸和NAD+;在a;-HBDH催化下，NADH與a-酮丁酸反應(yīng)生成a-羥丁酸和NAD+，見圖l。干擾指示反應(yīng)不同程度地消耗了NADH，有時(shí)甚至?xí)谋M生成的NADH，使反應(yīng)曲線下降或變?yōu)槠教梗筃ADH的生成與葡萄糖不成等量關(guān)系。干擾反應(yīng)的結(jié)果使葡萄糖測定結(jié)果偏低。LDH、a-HBDH活性越高，干擾反應(yīng)速度越快，偏差越大。己糖激酶法測定急性心肌梗塞(急性心肌梗死、肝轉(zhuǎn)移癌、惡性貧血等)患者的葡萄糖，內(nèi)源性干擾可通過與葡萄糖氧化酶法或其它血糖測定方法比較而被發(fā)現(xiàn)，己糖激酶法測定葡萄糖結(jié)果明顯偏低。也可以通過在自動(dòng)化分析儀上查看實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線獲知，心肌酶活性越高，樣品體積分?jǐn)?shù)增加，反應(yīng)時(shí)間延長，內(nèi)源性干擾越大，反應(yīng)曲線下降越陡，葡萄糖結(jié)果偏差越大，準(zhǔn)確度越低。在測定肝轉(zhuǎn)移癌、惡性貧血、急性心肌梗死病人血清時(shí)，隨著樣品體積分?jǐn)?shù)(SVF，樣品與試劑使用比例)的改變，反應(yīng)液中LDH及丙酮酸、a-HBDH及酮丁酸濃度隨著改變。SVF增大，準(zhǔn)確度下降(內(nèi)源性干擾反應(yīng))精密度也下降(因反應(yīng)尚未達(dá)到終點(diǎn)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行)，特別是在測定血清中LDH、a-HBDH酶活性高的患者葡萄糖時(shí)，其結(jié)果偏低。SVF降低，對低葡萄糖標(biāo)本，儀器分析中的信噪比(噪音/信號)增大，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性下降，精密度CV下降。因此急需一種既能適應(yīng)各種患者的血液葡萄糖測定，提高己糖激酶法測定葡萄糖的準(zhǔn)確度、精密度，又能適應(yīng)一定的檢測儀器，不增加檢測成本，使檢測人員容易掌握使用方法的己糖激酶法試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中己糖激酶法測定葡萄糖存在內(nèi)源性干擾的問題，提供一種能抗內(nèi)源性干擾，提高臨床實(shí)驗(yàn)室采用已糖激酶法測定葡萄糖的準(zhǔn)確性的已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒及制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒包括4瓶試劑i、i瓶試劑n及1支葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，試劑I中包含有50.0mraol/L濃度的三乙醇胺鹽酸緩沖液，8.0mmol/L濃度的草酸鹽、4.38mmol/L濃度的三磷酸腺苷、2500U/L濃度的已糖激酶、1.88mmol/L濃度的無水硫酸鎂及防腐劑適量；試劑II中含有10.0mmol/L濃度的輔酶I、1800U/L濃度的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及防腐劑適量。所述的草酸鹽為分析純的草酸鈉、草酸鉀。所述的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為5.55mmol/L。所述的防腐劑為ProClin300。一種已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒的制備方法a.三乙醇胺鹽酸緩沖液的制備方法在蒸餾水中溶解三乙醇胺形成三乙醇胺緩沖液，25""C時(shí)用鹽酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH至7.5±0.2;b.試劑I的制備方法將已糖激酶加入制備好的三乙醇胺鹽酸緩沖液中，依次溶解草酸鹽、三磷酸腺苷、無水硫酸鎂，充分混勻，使各成分的濃度達(dá)到使用荽求；c.試劑n的制備方法將輔酶I、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶解在三乙醇胺鹽酸緩沖液中，混合均勻，使各成分的濃度達(dá)到使用要求；d.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法稱取葡萄糖(分析純，分子量為180.16)溶解在蒸餾水中，使其濃度為5.55iranol/L,混勻后靜置30分鐘，分裝備用。在本發(fā)明試劑盒的試劑中，草酸鹽為抑制劑，NAD+為指示酶，無水硫酸鎂為己糖激酶的激活劑，服、G6PD為工具酶。ATP參與葡萄糖磷酸化反應(yīng)。防腐劑為ProClin300，成分主要為2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMCI)。加入ProClin300為解決生物樣本處理過程中保存期短的問題，可以有效地控制體外診斷試劑中微生物的生長。當(dāng)濃度達(dá)到0.02%條件下，ProClin系列防腐劑具有廣譜抗菌活性，能在比較長的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌、真菌和酵母菌等微生物的生長；同時(shí)，它又能保持體系中酶的活性。草酸鹽對乳酸脫氫酶、a-羥丁酸脫氫酶活性有明顯抑制作用，卻不影響己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，本發(fā)明采用將適宜濃度的草酸鈉加入到己糖激酶法所用的試劑中，起到抑制干擾反應(yīng)的效果。所用的草酸鈉、草酸鉀、均為試劑純產(chǎn)品，純度在99.97%。在本發(fā)明試劑盒的試劑中加入草酸鹽，其對試劑中的其他成分的影響、對自動(dòng)化儀器的檢測的影響、其最佳濃度、其檢測結(jié)果的精確性、準(zhǔn)確性都需要進(jìn)行驗(yàn)證，下面以草酸鈉為代表通過對草酸鈉濃度選擇、有關(guān)檢測數(shù)據(jù)的選擇，己有的己糖激酶法試劑盒與本發(fā)明的己4試劑盒的檢測結(jié)果等一些實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明。實(shí)驗(yàn)儀器OLYMPUSAU2700全自動(dòng)分析儀電熱恒溫水浴箱戰(zhàn)DDS-11AW酸度計(jì)分析天平試劑，,三乙醇胺ATP服G6PD輔酶I草酸鈉無水MgS04ProClin300鹽酸實(shí)驗(yàn)條件.溫度37°C波長340nm比色光徑1.Ocm曰本上海醫(yī)用儀器二廠上海理達(dá)儀器廠上海分析儀器二廠(美國Sigma公司批號T1377)(美國Sigma公司批號A7699)(美國Sigma公司批號EC0025)(美國Sigma公司批號G7750)(美國Sigma公司批號117809)(分析純，純度99.97%，北京市通廣精細(xì)化工公司)(分析純，純度99.97%，北京市通廣精細(xì)化工公司)(上海閃晶生物公司批號P050817)(分析純，北京市通廣精細(xì)化工公司)試劑用量樣品用量反應(yīng)時(shí)間3.0ml0.02ml3min樣品試劑比為1:150在反應(yīng)曲線圖中，橫軸為反應(yīng)時(shí)間，縱軸為吸光度。測定時(shí)間每點(diǎn)間隔18秒，測定時(shí)間180秒(第10點(diǎn))。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果1.草酸鈉對M,的影響三乙醇胺鹽酸緩沖液被測定的pH值為7.5±0.2，G6PD活性3.0±0.2KU/L，該試劑在加入草酸鈉試劑前，測Mg:濃度為1.32mmol/L，加入草酸鈉試劑經(jīng)離心后，取上清液檢測，試劑中2+Mg2+濃度未發(fā)生改變，證明無草酸鎂形成。G6PD活性仍為3.0±0.2KU/L，因此草酸鈉對G6PD活性沒有影響。同時(shí)，換為草酸鉀抑制劑的己糖激酶法試劑盒其檢測的反應(yīng)曲線都正常，準(zhǔn)確度和精確度提高，都能達(dá)到草酸鈉的同等功效。_.2.草酸鈉濃度的選擇在試劑中分別加入濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0咖ol/L的草酸鈉，分別測定標(biāo)本1和標(biāo)本2的葡萄糖值，每點(diǎn)各測10次，取其平均值，標(biāo)本1:英國RANSD0X公司350UN/5定制血清，血糖值范圍6.16+0.62腿ol/L;標(biāo)本2:LDH3862U/L，葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖值為7.85±0.75mmol/L。結(jié)果見表1。表1.不同濃度的草酸納對葡萄糖檢測結(jié)果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1看出，標(biāo)本l為定值血清，測定的血糖值在誤差范圍之內(nèi)，但隨著草酸濃度的增加，葡萄糖值呈下降的趨勢。標(biāo)本2為異常血清，從表l中可看出草酸納濃度低時(shí)不足以完全抑制干擾反應(yīng)，測得的數(shù)值偏低，當(dāng)草酸鈉濃度高時(shí)會(huì)抑制工具酶活性，也會(huì)析出結(jié)晶，葡萄糖測定數(shù)值呈下降趨勢。為了使該試劑達(dá)到準(zhǔn)確度要求，即不影響葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和己糖激酶的活性，又能抑制LDH、HBDH的干擾，因此選擇了8.0mmol/L的^度，以使檢測更完善。在己糖激酶法工作液中使用與未使用草酸鈉抑制劑工作液中L加、HBDH活性見表2表2.己糖激酶法工作液中LDH、HBDH活性的比較組別例數(shù)LDH(U/L)a-HBDH(U/L)HK本發(fā)明HK本發(fā)明惡性貧血組1816.84±12.387.24±3.2615.64土6.596.31±4.26急性心肌梗死組2228.79±8.7412.2±18.5525.72土8.2511.03±5.29肝轉(zhuǎn)移癌組1317.06±11.207.04±3.6413.34±8.596.27±4.28在己糖激酶法工作液中使用草酸鈉抑制劑的工作液中LDH、a-HBDH活性得到明顯抑制，兩組有高度顯著性差異p〈0.05，減弱了干擾反應(yīng)。3.體積分?jǐn)?shù)的選擇體積分?jǐn)?shù)的選擇在檢測中很重要，我們選擇了己糖激酶法不同樣品體積分?jǐn)?shù)測定葡萄糖，測定結(jié)果比較見表3表3.本方法不同樣品體積分?jǐn)?shù)測定急性心肌梗死患者葡萄糖結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表3中可看出，各種樣品試劑比測定結(jié)果間無顯著性的差異，t=0.5879，/7〉0.05,n=22，為了能適應(yīng)多種儀器，本發(fā)明選擇樣品試劑比為1:150。4.反應(yīng)時(shí)間和線性范圍的選擇本試劑盒的試劑反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為3分鐘與4.5分鐘測得心肌梗死組病人葡萄糖測定結(jié)果比較見表4，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為t=2.01，/M).5039，n二24，不同反應(yīng)時(shí)間設(shè)置測定急性心肌梗死患者葡萄糖結(jié)果無顯著性差異。因此，該試劑受反應(yīng)時(shí)間設(shè)置影響小。將一高值葡萄糖血清分別稀釋成1/12、2/12、3/12、4/12、5/12、6/12、7/12、8/12、9/12/、10/12、11/12、12/12倍測得的葡萄糖最高值為37.4mmol/L因此，本試劑線性范圍在37.4mmol/L。表4.本發(fā)明不同反應(yīng)時(shí)間設(shè)置測定急性心肌梗死患者葡萄糖結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.血清指數(shù)的干擾實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)，溶血、乳糜混濁、黃疸對本試劑的干擾與現(xiàn)有己糖激酶法試劑相同。所以血清指數(shù)的設(shè)置與原方法一樣。6.本發(fā)明單、雙試劑使用效果實(shí)驗(yàn)使用急性心肌梗塞患者血液做標(biāo)本，其LDH為2300.2U/L，HBDH為2271.4U/L;葡萄糖氧化法測得血糖為5.67mmol/L;用本發(fā)明的己糖激酶法試劑盒單試劑和雙試劑與上海匯豐公司的己糖激酶法試劑盒的單試劑和雙試劑同測一個(gè)標(biāo)本進(jìn)行比較。在實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線圖中，橫軸為反應(yīng)時(shí)間，測定時(shí)間每點(diǎn)間隔18秒，測定時(shí)間180秒，縱軸為吸光度，樣品:試劑I:試劑n=1:120:30。本發(fā)明己糖激酶法試劑盒單試劑和雙試劑均為正常反應(yīng)曲線如圖4，6，與葡萄糖氧化法測得的葡萄糖無明顯差異，由此可見本發(fā)明己糖激酶法試劑盒準(zhǔn)確度、精確度都很高?，F(xiàn)有的己糖激酶法試劑盒為異常反應(yīng)曲線，準(zhǔn)確度降低，如圖5，7。7.臨床應(yīng)用情況研究對象健康査體成人26名，男14名，女12名，平均年齡42.5歲。經(jīng)B超檢查肝、膽、胰、脾、腎均正常，其LDH平均值為129.8±31.5U/L，a-HBDH平均值為101.3±40.13U/L;惡性貧血組18名，其中男10名，女8名，平均年齡41.5歲，其LDH平均值為2544.3±1869.5U/L，a-HBDH平均值為2347.7±994.6U/L;急性心肌梗塞組22名，其中男12名，女10名，平均年齡52.5歲，其LDH平均值為4348.9土1320.7U/L，a-HBDH平均值為3887.6土1246.5U/L;肝轉(zhuǎn)移癌組13名，其中男7名，女6名，平均年齡61.5歲，其LDH平均值為2577.2±1690.4U/L，a-HBDH平均值為2014.2土1296.6U/L。均在清晨空腹采血。通過表5可看出，正常人葡萄糖用三種試劑盒測得數(shù)據(jù)無明顯差別，其他三組數(shù)據(jù)，葡萄糖氧化酶試劑盒與本發(fā)明己糖激酶試劑盒測得數(shù)據(jù)無明顯差別而用現(xiàn)有己糖激酶法試劑盒測得的數(shù)據(jù)卻普遍比另兩種試劑盒低。直線回歸實(shí)驗(yàn)用本發(fā)明試劑盒和上海豐匯公司葡萄糖氧化酶試劑盒、現(xiàn)有己糖激酶試劑盒測試肝轉(zhuǎn)移癌組、惡性貧血組、急性心肌梗塞組與對照組的葡萄糖。結(jié)果見表5。表5.幾種測試方法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表5可以看出，1.正常對照組Y本發(fā)明法=1.002Xgod-0.4659;R2=0.9993本發(fā)明與葡萄糖氧化酶兩試劑盒相關(guān)性良好；經(jīng)配對t檢驗(yàn)，t二O.23，；〉0.05，無顯著性差異。Y本發(fā)明=0.9978Xhk+0.2429;R2=0.99974本發(fā)明與現(xiàn)有己糖激酶兩試劑盒相關(guān)性良好，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，t=0.25，〉0.05，無顯著性差異。三種試劑盒準(zhǔn)確性均較高。2.肝轉(zhuǎn)移癌組Y本發(fā)明=0.9938Xg。d+0.3835;R2=0.9994本發(fā)明與葡萄糖氧化酶兩試劑盒相關(guān)性良好，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，t二0.93，p〉0.05，無顯著性差異。本發(fā)明的試劑盒與現(xiàn)有己糖激酶法試劑盒有顯著性差異，t=7.29，；<0.05。本發(fā)明己糖激酶法試劑盒準(zhǔn)確性高于現(xiàn)有的己糖激酶法試劑盒。3.惡性貧血組Y本發(fā)明=0.9985Xgod+0.2182;R2=0.9995本發(fā)明與葡萄糖氧化酶兩試劑盒相關(guān)性良好，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，t=1.63，/〉Q.05，無顯著性差異。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有己糖激酶法試劑盒有顯著性差異，t二8.02,p<0.05。本發(fā)明己糖激酶法試劑盒的準(zhǔn)確性高于現(xiàn)有己糖激酶法試劑盒。4.急性心肌梗死組:Y本發(fā)明:1.001X咖-0.2791;R2=0.9996本發(fā)明與葡萄糖氧化酶兩試劑盒相關(guān)性良好，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，t=0.51，p〉0.05，無顯著性差異。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有的己糖激酶法試劑盒有顯著性差異，t=11.06，；K0.05。本發(fā)明己糖激酶法試劑盒測出的數(shù)據(jù)與葡萄糖氧化酶法試劑盒相近，準(zhǔn)確性高于現(xiàn)有的己糖激酶法試劑盒。精密度試驗(yàn)取惡性貧血組、急性心肌梗塞組、肝轉(zhuǎn)移癌組及對照組的血樣，用三種方法測試血糖，連續(xù)測20次求出批內(nèi)精密度。每份血樣測一次連續(xù)測20天得出批間精密度。結(jié)果見表6。葡萄糖氧化酶法試劑盒數(shù)值批內(nèi)(CWo)為1.99-2.74，批間(CWo)為3.12-3.33;現(xiàn)有己糖激酶法試劑盒數(shù)值批內(nèi)為2.66-8.11，批間為3.03-10.01;本發(fā)明的己糖激酶法試劑盒數(shù)值批內(nèi)(CV%)為2.00-2.88，批間(CV9G)為3.04-3.23?，F(xiàn)有的己糖激酶法試劑盒數(shù)值差別最大，精確度最低。表6.精密度實(shí)驗(yàn)比較組別樣品數(shù)葡萄糖氧化酶法己糖激酶法本發(fā)明己糖激酶法批內(nèi)批間批內(nèi)批間批內(nèi)批間惡性貧血組202.163.336.698.232.003.23急性心肌梗塞組202.263.267.8710.012.253.18肝轉(zhuǎn)移癌組201.993.308.119.142.273.20對照組202.743.122.663.032.883.04本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明的己糖激酶法試劑盒，通過草酸鹽抑制內(nèi)源乳酸脫氫酶、a-羥丁酸脫氫酶的活性，來控制干擾反應(yīng)的進(jìn)行，增加反應(yīng)的特異性，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。而且本發(fā)明的試劑盒檢測時(shí)受樣品試劑體積比、反應(yīng)時(shí)間設(shè)置影響小，線性范圍可達(dá)37.4mmol/L。其使用方法和范圍與原有己糖激酶法相同，不會(huì)增加實(shí)驗(yàn)人員的負(fù)擔(dān)，幾乎不增加試劑成本，經(jīng)濟(jì)方便易行，是一種準(zhǔn)確性更高的用己糖激酶法測定葡萄糖的試劑盒。圖1是現(xiàn)有己糖激酶法測定反應(yīng)和干擾反應(yīng)示意圖，圖2是本發(fā)明己糖激酶法試劑盒測定正常對照組血清葡萄糖實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線圖，圖3是上海豐匯公司己糖激酶法試劑盒測定正常對照組血清葡萄糖實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線圖，圖4是本發(fā)明己糖激酶法試劑盒使用單一試劑檢測急性心肌梗塞患者血清葡萄糖實(shí)時(shí)反應(yīng)曲線圖，圖5上海豐匯公司己糖激酶法試劑盒使用單一試劑檢測急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反應(yīng)曲線圖，圖6是本發(fā)明己糖激酶法試劑盒使用雙試劑檢測急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反應(yīng)曲線圖，圖7上海豐匯公司己糖激酶法試劑盒使用雙試劑檢測急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反應(yīng)曲線圖。具體實(shí)施例方式1.試劑盒的組成4瓶試劑I(100ml/瓶)；l瓶試劑n(100ml);葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1支(濃度5.55mmol/L，2ml);試劑盒使用說明書1份。2.試劑的配制三乙醇胺鹽酸緩沖液(濃度50mmol/L)的配制將14.92g三乙醇胺溶解在2L蒸餾水中，然后將40mgProClin300加入溶液中混合均勻，25。C時(shí)用lmol/L的鹽酸將三乙醇胺鹽酸緩沖液pH值調(diào)節(jié)到7.5±0.2。試劑I的配制將10.0gHK溶解在1L制備好的三乙醇胺鹽酸緩沖液中，將1.07g草酸鈉、2.22gATP、226.28mg無水MgS04分別加入上述三乙醇胺鹽酸緩沖混合液中，混合均勻，制得試劑I。b.試劑n的制備將6.63mgNAD+與3.60mgG6PD溶解在另外1L制備好的三乙醇胺鹽酸緩沖液中，制得試劑n。c.標(biāo)準(zhǔn)液的配制稱取100mg葡萄糖(分析純)溶解在100ml蒸餾水中，混勻靜置30分鐘，其濃度為5.55mmol/L，分裝備用。本發(fā)明的試劑盒在4-8X:冷藏、閉光保存，有效期l年。3.試劑盒的使用方法a單試劑按試劑I:試劑n等于4:1的比例，混合配成應(yīng)用液。將樣品倒入300ri應(yīng)用液中，混合均勻，37'C孵育3分鐘，應(yīng)用全自動(dòng)分析儀在340nm波長處檢測。b.雙試劑將樣品加入240W試劑I中混勻，37'C孵育5分鐘，加入6(mi試劑n混勻，37。C孵育3分鐘，應(yīng)用全自動(dòng)分析儀在340nm波長處檢測。權(quán)利要求1.一種己糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒，包括有4瓶試劑I、1瓶試劑II及1支葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，其特征在于試劑I中包含有50.0mmol/L濃度的三乙醇胺鹽酸緩沖液、8.0mmol/L濃度的草酸鹽、4.38mmol/L濃度的三磷酸腺苷、2500U/L濃度的已糖激酶、1.88mmol/L濃度的無水硫酸鎂及適量的防腐劑；試劑II中含有10.0mmol/L濃度的輔酶I、1800U/L濃度的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及適量的防腐劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的己糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒，其特征在于試劑I中草酸鹽為分析純的草酸鈉、草酸鉀。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒，其特征在于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為5.55mmol/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒，其特征在于防腐劑為ProClin300。5.—種已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒的制備方法，其特征在于a.三乙醇胺鹽酸緩沖液的制備方法在蒸餾水中溶解三乙醇胺形成三乙醇胺緩沖液，25。C時(shí)用鹽酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH至7.5±0.2;b.試劑I的制備方法將已糖激酶加入制備好的三乙醇胺鹽酸緩沖液中，依次溶解草酸鹽、三磷酸腺苷、無水硫酸鎂，充分混勻，使各成分的濃度達(dá)到使用要求；c.試劑n的制備方法將輔酶I(NAD+)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶解在三乙醇胺鹽酸緩沖液中，混合均勻，使各成分的濃度達(dá)到使用要求；d.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法稱取葡萄糖(分析純)溶解在蒸餾水中，使其濃度為5.55mmol/L，混勻后靜置30分鐘，分裝備用。全文摘要本發(fā)明公開了一種已糖激酶法檢測葡萄糖的試劑盒，屬于一種含酶的葡萄糖檢測方法的試劑盒。本發(fā)明試劑盒包括有4瓶試劑I、1瓶試劑II及1支葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，在試劑I中包括有濃度為8.0mmol/L的草酸鹽。本發(fā)明通過草酸鹽抑制內(nèi)源性乳酸脫氫酶、α-羥丁酸脫氫酶的活性來控制干擾反應(yīng)的進(jìn)行，增加反應(yīng)的特異性，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。而且本發(fā)明的試劑盒檢測時(shí)受樣品試劑體積比、反應(yīng)時(shí)間的設(shè)置影響小，線性范圍可達(dá)37.4mmol/L。其使用方法和范圍與原有己糖激酶法相同，不會(huì)增加實(shí)驗(yàn)人員的負(fù)擔(dān)，幾乎不增加試劑成本，經(jīng)濟(jì)方便易行，是一種準(zhǔn)確性更高的用己糖激酶法測定葡萄糖的試劑盒。文檔編號C12Q1/32GK101386882SQ200810151970公開日2009年3月18日申請日期2008年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者李立和,王高生申請人:天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院