用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的熒光定量pcr特異性引物、探針及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢驗(yàn)和生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)肉制品中羊源性 成分的熒光定量PCR引物、探針及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊肉具有天然的滋補(bǔ)功效，長期以來都受到廣大消費(fèi)者的青睞。隨著市場(chǎng)流通的 日益發(fā)達(dá)，羊肉經(jīng)過冷凍、加工后再銷售已成為現(xiàn)代市場(chǎng)營銷的主要手段，但是羊肉一般經(jīng) 過冷凍，特別是經(jīng)過加工后的熟羊肉通過感官檢查已很難區(qū)分真?zhèn)?，因而一些不法商販?高額利潤的驅(qū)使下，在肉制品的生產(chǎn)與銷售中使用雞肉、鴨肉、豬肉等以假充真、以次充好， 引起了廣大消費(fèi)者的強(qiáng)烈憤慨。這不僅僅涉及到了經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)等問題，更直接影響著消費(fèi)者 的健康，尤其是對(duì)某些事物過敏的消費(fèi)者。
[0003] 目前，采用免疫學(xué)方法可以對(duì)不同的生鮮肉進(jìn)行鑒定，但是對(duì)于熱加工處理的肉 類制品，由于其中的蛋白質(zhì)成分或免疫原性成分遭破壞而無法對(duì)其來源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。因 此，建立一種對(duì)肉類制品準(zhǔn)確、特異和靈敏度高的鑒別方法，對(duì)食品監(jiān)管部門而言已迫在眉 睫。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，食品中肉類成分的鑒別與分析已逐步形成了分別以蛋白質(zhì)和核 酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法體系，其鑒別精度可達(dá)屬或亞屬水平，靈敏度也達(dá)到了納克級(jí)，其中以 PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測(cè)技術(shù)最為突出。
[0004] Cytb基因是編碼線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素b氧化酶的基因的一個(gè)亞基，由mtDNAH 鏈所編碼。幾乎所有的真核生物和許多原核生物的細(xì)胞中都存在細(xì)胞色素b，它不但在屬 間、種間存在多樣性，而且在品種間、品種內(nèi)個(gè)體間都存在多樣性，因此，它對(duì)闡明生物間的 親緣關(guān)系以及在物種鑒定方面都具有極其重要的意義。在進(jìn)化的過程中，Cytb基因序列 變異率相對(duì)較高，種間差異較大，因此，Cytb基因是研究種間進(jìn)化關(guān)系最佳的基因，可以將 Cytb基因檢測(cè)作為物種鑒定的一種重要的手段。本申請(qǐng)根據(jù)羊特異性線粒體Cytb基因，設(shè) 計(jì)一種特異性的熒光定量PCR引物、探針及其試劑盒，利用特異性引物和探針建立一種運(yùn) 用熒光定量PCR技術(shù)鑒定真假羊肉的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)肉制品中羊源性 成分的特異性引物、探針；本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)肉制品中羊源性成分的熒光 定量PCR檢測(cè)試劑盒。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的熒光定量PCR特異性引物，所 述特異性引物的核苷酸序列為：
[0008] 上游引物：5' -GCATAATATTCCGMCCAATCAG-3'（SEQIDNO. 1);
[0009] 下游引物：5'-AGITGTCCAATAATRATGTAGGG-3'（SEQIDNO. 2);其中，M和R為簡(jiǎn)并 堿基，M = A或C，R = A或G。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種與上述引物配合使用的熒光探針，所述熒光探針的核苷酸序 為熒光淬滅基團(tuán)，M為簡(jiǎn)并堿基，M = A或C。
[0011] 優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。
[0012] 本發(fā)明所述的引物和探針是通過核酸比對(duì)軟件DNAMAN對(duì)GenBank中公布的羊 線粒體Cytb基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出羊Cytb基因保守序列，其核苷酸序列如SEQID NO. 4 (其中，Y、R和M為簡(jiǎn)并堿基，Y=C或T，R=A或G，M=A或〇,并利用Primer5. 0 設(shè)計(jì)特異性引物。所有引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的方法：以樣品總DNA為模 板，利用本發(fā)明上述提供的引物和熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，同時(shí)設(shè)立無模板對(duì)照和 陽性對(duì)照，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0014] 本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，當(dāng)為25 y L反應(yīng)體系時(shí)，其優(yōu)選配置見 表1。
[0015] 表1熒光定量PCR反應(yīng)體系
[0016]
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR
的反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)； 95°C變性10s，58°C退火45s，40個(gè)循環(huán)。
[0018] 本發(fā)明每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)須設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，在檢測(cè)中兩種對(duì)照為有效擴(kuò) 增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0019] Ct值< 37時(shí)樣品結(jié)果為陽性；
[0020] Ct值彡40時(shí)樣品結(jié)果為陰性；
[0021] Ct值在37~40之間時(shí)，樣品需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于37判定為陽性 擴(kuò)增，高于40判定為陰性擴(kuò)增。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的試劑盒，所述試劑盒包括上 述特異性引物和與上述特異性引物配合使用的探針，其中，所述特異性引物的核苷酸序列 為：
[0023] 上游引物：5 ' -GCATAATATTCCGMCCAATCAG-3 ' ；
[0024] 下游引物：5 ' -AGITGTCCAATAATRATGTAGGG-3 ' ；其中，M 和R為簡(jiǎn)并堿基，M =A或 C，R=A或G〇
[0025] 所述探針的核苷酸序列為：
[0026] 5' -F-TCACATGAATTGGAGGMCAGCCAG-Q-3' ；其中，F(xiàn)為熒光報(bào)告基團(tuán)，Q為熒光淬滅 基團(tuán)，M為簡(jiǎn)并堿基，M=A或C。
[0027] 優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。
[0028]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒還包括：2 XPremix Ex Taq (Probe qPCR)、R0X Reference Dye(50X)、陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為 羊肉基因組 DNA，其中 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)和 ROX Reference Dye(50X)從 TaKaRa購買得到。
[0029] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的試劑盒的工作反應(yīng)體系見表 1 ;其工作程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；95°C變性10s，58°C退火45s，40個(gè)循環(huán)。
[0030] 上述的試劑盒在檢測(cè)肉制品中羊源性成分中的應(yīng)用。
[0031 ] 本發(fā)明的積極有益效果：
[0032] (1)本發(fā)明提供了用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的熒光定量PCR特異性引物和與 該引物配合使用的熒光探針，該引物具有很高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)羊源性成分的檢測(cè)下限為 6pg/yL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)限；而且檢測(cè)特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，因此，可以實(shí)現(xiàn) 對(duì)肉及肉制品中羊源性成分精確的物種鑒定。
[0033] (2)本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)體系包含了上述引物、探針和陰性、陽性對(duì) 照，利用該試劑盒檢測(cè)肉制品中羊源性成分，操作簡(jiǎn)單，大大縮短檢測(cè)周期，該試劑盒有助 于對(duì)肉制品的生產(chǎn)與銷售中使用雞肉、鴨肉、豬肉等以假充真、以次充好現(xiàn)象的監(jiān)測(cè)，適合 推廣應(yīng)用，為監(jiān)管部門提供有利的科學(xué)依據(jù)。
【附圖說明】
[0034] 圖1為本發(fā)明所述用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的熒光定量PCR方法的特異性檢 測(cè)圖：其中，1代表陽性對(duì)照（羊肉DNA提取物為模板），2代表豬肉DNA提取物為模板，3代 表牛肉DNA提取物為模板，4代表雞肉DNA提取物為模板，5代表鴨肉DNA提取物為模板，6 代表鵝肉DNA提取物為模板，7代表貂肉DNA提取物為模板，8代表狐貍?cè)釪NA提取物為模 板，9代表小麥DNA提取物為模板，10代表玉米DNA提取物為模板，11代表水稻DNA提取物 為模板，12代表陰性對(duì)照（H 20為模板）。
[0035] 圖2為本發(fā)明所述用于檢測(cè)肉制品中羊源性成分的熒光定量PCR方法的敏感性檢 測(cè)圖：1-6分別為600ng/ y L羊肉DNA提取物做10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6稀釋后為模板 的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，7為陰性對(duì)照（H20為模板）。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)該理解為對(duì)本發(fā)明的限 制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換， 均屬于本發(fā)明的范圍。
[0037] 除非特別說明，本發(fā)明采用的除引物、探針之外的試劑、方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī) 試劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，本發(fā)明使用的試劑和試劑盒均為市購。
[0038] 主要儀器設(shè)備：ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司； HermLe Z36HK高速冷凍離心機(jī)購自HERMLE;DT500電子天平購自江蘇常熟長青儀器廠；島 津BioSpec-nano紫外可見分光光度計(jì)購自日本。
[0039] 主要試劑：組織裂解液（lmol/L Tris-HCL、0.5mol/L EDTA、10% SDS)、氯仿 / 異 戊醇（24:1)、3M醋酸鈉、1XTE緩沖液（自配試劑）；20mg/mL蛋白酶K(TAKARA)Tris平 衡酸（索萊寶生物科技有限公司）；2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)和ROX Reference Dye(50X)(從TaKaRa購買得到）；引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。
[0040] 實(shí)施例1 :引物和探針的設(shè)計(jì)與合成
[0041 ] 通過核酸比對(duì)軟件DNAMAN對(duì)GenBank中公布的10個(gè)羊線粒體Cytb基因（GenBank 中的登錄號(hào)分別為 DQ459341、JX567831. 1、JX567772. 1、DQ903215. 1、DQ097410. 1、 DQ514544、EU130780. 1、AB736131. 1、JX010746. 1、AB044308. 1)進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出羊 Cytb基因保守序列，其核苷酸序