專利名稱：用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶測(cè)定痕量葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶的電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)快速測(cè)定痕量葡萄糖的方法，可用于人血液中葡萄糖含量的測(cè)定。
背景技術(shù)：
葡萄糖是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。它的氧化反應(yīng)放出的熱量是人類生命活動(dòng)所需能量的重要來(lái)源。作為人體的基本元素和最基本的醫(yī)藥原料，它的作用和用途十分廣泛，既可直接應(yīng)用于人體，又可用于食品加工和醫(yī)藥化工。它能迅速增加人體能量、耐力、可用作血糖過(guò)低、感冒發(fā)燒、頭暈虛脫、四肢無(wú)力及心肌炎等癥的補(bǔ)充液，對(duì)癌癥也有一定的治療作用。
實(shí)現(xiàn)葡萄糖的快速定量檢測(cè)在生物化學(xué)、臨床化學(xué)以及食品分析等領(lǐng)域具有重要意義。迄今為止，已有許多有關(guān)葡萄糖檢測(cè)方法的報(bào)道，如電化學(xué)檢測(cè)，表面增強(qiáng)拉曼散射光譜檢測(cè)，光度法檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和電致發(fā)光檢測(cè)等。但采用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶(GOD)的電致發(fā)光檢測(cè)葡萄糖的傳感器未見報(bào)道。電致化學(xué)發(fā)光也稱為電化學(xué)發(fā)光，它是通過(guò)電化學(xué)反應(yīng)直接或間接引發(fā)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，是一類電位控制的電極氧化還原反應(yīng)。近年發(fā)展起來(lái)的電致化學(xué)發(fā)光分析方法，是將電化學(xué)技術(shù)與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相結(jié)合的一種分析方法，兼?zhèn)涠叩膬?yōu)點(diǎn)靈敏度高，線性范圍寬，反應(yīng)和時(shí)空可控性好。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、選擇性好的傳感器，對(duì)痕量(如lymol/L)的葡萄糖進(jìn)行測(cè)定的方法。
構(gòu)思如下研究發(fā)現(xiàn)魯米諾與雙氧水體系在電極電壓的作用下能產(chǎn)生非常強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光，而魯米諾和雙氧水的濃度對(duì)該發(fā)光有顯著的正線性關(guān)系。當(dāng)固定魯米諾的濃度，通過(guò)葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖間接產(chǎn)生雙氧水時(shí)，電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度僅與一定濃度范圍內(nèi)的葡萄糖呈線性關(guān)系，在此基礎(chǔ)上采用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶(GOD)從而建立了一種測(cè)定微量葡萄糖的電致化學(xué)發(fā)光分析方法。
本發(fā)明涉及酶促反應(yīng)，屬于酶?jìng)鞲衅?。?dāng)電極表面生成雙氧水時(shí)，溶液中的魯米諾與之發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生能發(fā)出一定波長(zhǎng)的光的激發(fā)態(tài)物質(zhì)而發(fā)光。光的峰強(qiáng)度ip 在一定范圍內(nèi)與葡萄糖的濃度成正比。
具體步驟如下
(1)分別截取鐵棒和玻璃管，并把鐵棒和玻璃管的兩端磨平、洗凈；將固體石蠟和碳粉按質(zhì)量比為2 4 1比例混合，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻，填入玻璃管中；將鐵棒插入玻璃管的一端中，用石蠟固定住，冷卻后，除去管外多余雜物，并在光滑紙上拋光表面， 為保證足夠大的磁力；玻璃管的另一端電極端為石蠟碳糊薄層，制得固體石蠟碳糊電極； 最后玻璃管石蠟碳糊的薄層的一端碳糊電極在使用前分別用體積比為11的硝酸和無(wú)水乙醇清洗，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；
(2)稱取 FeCl3 · 6H20 和 FeSO4 · 7H20,以 Fe2+/Fe3+ =1:2 的摩爾比溶解在二次蒸餾水中得混合溶液，滴加體積百分比為25%的氨水使混合溶液pH = 9 12，室溫下攪拌 20 40分鐘，然后升溫到80°C并保持溶液pH = 9 12不變，加熱熟化20 40分鐘；制備的黑色懸浮液超聲10 30分鐘，在磁鐵分離下，用熱水洗滌到中性得磁性納米!^e3O4粒子；
(3)稱取45-55mg步驟⑵所得的磁性納米狗304粒子超聲分散在15_25mL無(wú)水乙醇中，攪拌下加入0. 1 0.3mL體積百分濃度為98% Y -氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌反應(yīng)9 20小時(shí)，收集的磁性粒子分別用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗后定容得氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子；
(4)用磁鐵吸住步驟(1)制得的固體石蠟碳糊電極的鐵棒端，取步驟C3)制得的氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子滴加在步驟(1)制得的電極表面，晾干后，滴加體積百分濃度為0. 25%的戊二醛在修飾電極表面，放入4°C冰箱1小時(shí)后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中過(guò)夜；使用前，把電極置于攪動(dòng)的蒸餾水中清洗5 10分鐘；每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去磁性納米復(fù)合葡萄糖氧化酶粒子以便更新電極；電極不用時(shí)放入4°C冰箱中保存；
(4)檢測(cè)方法
室溫下，選取掃描速率為50mV/s，掃描范圍為+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)，光電倍增管高壓600v，采樣速率10T/S，放大級(jí)數(shù)3，測(cè)量時(shí)間60s進(jìn)行循環(huán)伏安法試驗(yàn)，測(cè)量不同濃度葡萄糖在含0. 5mmol/L魯米諾的pH為8. 00.的lmol/L硼酸鈉緩沖溶液的電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，繪制工作曲線；葡萄糖在1.0X10—5 1.0X10-2mol/L濃度范圍內(nèi)與電致化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系ip = 65. 4C+23.9，相關(guān)系數(shù)R = 0. 9987，檢測(cè)限為1 μ mol/L。
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在過(guò)于復(fù)雜等諸多缺點(diǎn)，靈敏度高，對(duì)于葡萄糖的檢測(cè)易于自動(dòng)化。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例葡萄糖含量與電致化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度ip的關(guān)系圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例溶液pH值對(duì)電致化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度ip的影響。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例魯米諾的含量與電致化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度ip的關(guān)系圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
(1)分別截取鐵棒和玻璃管，并把鐵棒和玻璃管的兩端磨平、洗凈；將固體石蠟和碳粉按質(zhì)量比為3 1比例混合，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻，填入玻璃管中；將鐵棒插入玻璃管的一端中，用石蠟固定住，冷卻后，除去管外多余雜物，并在光滑紙上拋光表面，為保證足夠大的磁力；玻璃管的另一端電極端為石蠟碳糊薄層，制得固體石蠟碳糊電極；最后玻璃管石蠟碳糊的薄層的一端碳糊電極在使用前分別用體積比為11的硝酸和無(wú)水乙醇清洗，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；
(2)稱取 FeCl3 ·6Η20 和 FeSO4 ·7Η20，以 Fe2+/Fe3+ =1:2 的摩爾比溶解在二次蒸餾水中得混合溶液，滴加體積百分比為25%的氨水使混合溶液pH = 11，室溫下攪拌30分鐘，然后升溫到80°C并保持溶液pH = 11不變，加熱熟化30分鐘；制備的黑色懸浮液超聲 20分鐘，在磁鐵分離下，用熱水洗滌到中性得磁性納米!^e3O4粒子；
(3)稱取48mg步驟⑵所得的磁性納米狗304粒子超聲分散在20mL無(wú)水乙醇中， 攪拌下加入0. 2mL體積百分濃度為98 % γ -氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌反應(yīng)12小時(shí)，收集的磁性粒子分別用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗后定容得氨基化后的磁性納米 Fe3O4粒子；
(4)用磁鐵吸住步驟(1)制得的固體石蠟碳糊電極的鐵棒端，取步驟C3)制得的氨基化后的磁性納米I^e3O4粒子滴加在步驟(1)制得的電極表面，晾干后，滴加體積百分濃度為0. 25%的戊二醛在修飾電極表面，放入4°C冰箱1小時(shí)后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中過(guò)夜。使用前，把電極置于攪動(dòng)的蒸餾水中清洗8分鐘。每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去磁性納米復(fù)合葡萄糖氧化酶粒子以便更新電極。電極不用時(shí)放入4°C冰箱中保存。
(4)檢測(cè)方法
室溫下，選取掃描速率為50mV/s，掃描范圍為+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)，光電倍增管高壓600v，采樣速率10T/S，放大倍數(shù)3，測(cè)量時(shí)間60s進(jìn)行循環(huán)伏安法試驗(yàn)，測(cè)量不同濃度葡萄糖在含0. 5mmol/L魯米諾的0. lmol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH 8. 0)的電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，繪制工作曲線，其結(jié)果見附圖1。葡萄糖在1X10—5 1.0X10-2mol/L濃度范圍內(nèi)與電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系ip = 65. 4C+23. 9，相關(guān)系數(shù)R = O. 9987，檢測(cè)限為 1 μ mol/L0
pH值和溫度的影響
魯米諾的ECL反應(yīng)需在堿性條件下進(jìn)行(pH 8. 5 10. 0)，考慮到葡萄糖氧化酶的生物活性受PH值影響較大，本文考察了 pH = 7. 0 9. 5的范圍內(nèi)，電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化。在魯米諾濃度為0. lmmol/L，葡萄糖濃度為lmmol/L時(shí)，pH值的影響結(jié)果見附圖2。從圖中可以看出，當(dāng)pH = 8. 0時(shí)，魯米諾的ECL強(qiáng)度最大，實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定在pH = 8. 0的硼酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行。
同時(shí)，酶的催化活性與溫度也有很大關(guān)系，實(shí)驗(yàn)用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器控制水浴溫度，考察了 20 60°C范圍內(nèi)酶電極的電流響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度達(dá)到40°C時(shí)，電流響應(yīng)最大，隨著溫度的升高，電流有下降的趨勢(shì)?？紤]到溫度過(guò)高，葡萄糖氧化酶因變性而影響酶電極的使用壽命，實(shí)驗(yàn)均在室溫25°C下進(jìn)行。
魯米諾的濃度的影響
固定其他條件不變，在0. 01 1. 2mmol/L范圍內(nèi)考察了魯米諾的濃度對(duì)電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。所得結(jié)果見附圖3。由圖可見，葡萄糖濃度是lmmol/L時(shí)，隨著魯米諾的濃度由0. Olmmol/L增大到0. 5mmol/L時(shí)，溶液的ECL值快速增大，當(dāng)魯米諾的濃度大于 0. 5mmol/L時(shí)，ECL的強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。因此，實(shí)驗(yàn)中魯米諾的用量為0. 5mmol/L。
電極在分析測(cè)試中的應(yīng)用
對(duì)人血清中葡萄糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，該方法和醫(yī)院采用的臨床分析方法所得結(jié)果相吻合。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定了樣品的回收率，結(jié)果見表1。可見，該方法用于臨床樣品的分析測(cè)定，結(jié)果令人滿意。
表1 人血清中葡萄糖的測(cè)定及回收率試驗(yàn)結(jié)果(n = 5)
權(quán)利要求
1. 一種測(cè)定痕量葡萄糖的方法，其特征在于具體步驟為(1)分別截取鐵棒和玻璃管，并把鐵棒和玻璃管的兩端磨平、洗凈；將固體石蠟和碳粉按質(zhì)量比為2 4 1比例混合，稍加熱至石蠟熔化，攪拌均勻，填入玻璃管中；將鐵棒插入玻璃管的一端中，用石蠟固定住，冷卻后，除去管外多余雜物，并在光滑紙上拋光表面，為保證足夠大的磁力；玻璃管的另一端電極端為石蠟碳糊薄層，制得固體石蠟碳糊電極；最后玻璃管石蠟碳糊的薄層的一端碳糊電極在使用前分別用體積比為11的硝酸和無(wú)水乙醇清洗，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；(2)稱取FeCl3·6Η20和FeSO4 ·7Η20，以Fe2+/Fe3+ =1:2的摩爾比溶解在二次蒸餾水中得混合溶液，滴加體積百分比為25%的氨水使混合溶液pH = 9 12，室溫下攪拌20 40分鐘，然后升溫到80°C并保持溶液pH = 9 12不變，加熱熟化20 40分鐘；制備的黑色懸浮液超聲10 30分鐘，在磁鐵分離下，用熱水洗滌到中性得磁性納米!^e3O4粒子；(3)稱取45 55mg步驟⑵所得的磁性納米狗304粒子超聲分散在15_25mL無(wú)水乙醇中，攪拌下加入0. 1 0.3mL體積百分濃度為98% Y -氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌反應(yīng)9 20小時(shí)，收集的磁性粒子分別用無(wú)水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗后定容得氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子；(4)用磁鐵吸住步驟(1)制得的固體石蠟碳糊電極的鐵棒端，取步驟C3)制得的氨基化后的磁性納米!^e3O4粒子滴加在步驟(1)制得的電極表面，晾干后，滴加體積百分濃度為 0. 25%的戊二醛在修飾電極表面，放入4°C冰箱1小時(shí)后，用水淋洗并吹干，然后滴加葡萄糖氧化酶溶液，放入4°C冰箱中過(guò)夜；使用前，把電極置于攪動(dòng)的蒸餾水中清洗5 10分鐘；每次使用后，移去磁鐵，用蒸餾水沖洗，洗去磁性納米復(fù)合葡萄糖氧化酶粒子以便更新電極；電極不用時(shí)放入4°C冰箱中保存；(4)檢測(cè)方法室溫下，選取掃描速率為50mV/s，掃描范圍為+0. 2 +1. 4V(vs. SCE)， 光電倍增管高壓600v，采樣速率10T/S，放大級(jí)數(shù)3，測(cè)量時(shí)間60s進(jìn)行循環(huán)伏安法試驗(yàn)，測(cè)量不同濃度葡萄糖在含0.5!1111101/1魯米諾的？!1為8.00.的lmol/L硼酸鈉緩沖溶液的電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度，繪制工作曲線；葡萄糖在1.0\10-5 1.0\10-2!1101/1濃度范圍內(nèi)與電致化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系ip = 65. 4C+23. 9，相關(guān)系數(shù)R = O. 9987，檢測(cè)限為 1 μ mol/L0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶測(cè)定痕量葡萄糖的方法。在碳糊電極表面，通過(guò)磁性納米粒子而修飾固定在電極表面的葡萄糖氧化酶氧化溶液中的葡萄糖生成雙氧水，雙氧水與魯米諾溶液形成電致化學(xué)發(fā)光體系。該體系在電極電壓的作用下產(chǎn)生非常強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)和電化學(xué)信號(hào)。光信號(hào)強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與溶液中的葡萄糖濃度成正比。據(jù)此建立了一種測(cè)定葡萄糖的電致化學(xué)發(fā)光分析方法。在+0.2～+1.4V(vs.SCE)電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，葡萄糖在1×10-5～1.0×10-2mol/L濃度范圍內(nèi)與電致化學(xué)發(fā)光峰強(qiáng)度ip呈良好的線性關(guān)系。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在過(guò)于復(fù)雜等諸多缺點(diǎn)，靈敏度高，對(duì)于葡萄糖的檢測(cè)易于自動(dòng)化。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102495047SQ20111039100
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者李建平, 熊志剛 申請(qǐng)人:桂林理工大學(xué)