一種牛乳脂代謝相關(guān)基因c4bpa定量pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種定量PCR檢測方法，特別涉及一種牛乳脂代謝相關(guān)基因C4BPA定 量PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，焚光定量PCR技術(shù)是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新 定量試驗方法，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤， 實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，由于在PCR擴增的指數(shù)時 期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。熒光定量PCR 所使用的熒光化學(xué)有兩種，一種是熒光探針，如TaqMan熒光探針，在PCR擴增時加入一對 引物同時也加入一個特異性的熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光 基團(tuán)，當(dāng)探針完整時報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，不發(fā)射熒光，但當(dāng)PCR擴增 時，Taq酶的外切酶活性將探針酶切使其降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)相互分離， 從而熒光檢測系統(tǒng)就可以接受到熒光信號，從而實現(xiàn)了對熒光信號的累積。另一種是SYBR 熒光染料，將SYBR熒光染料非特異性的插入DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號，而不能插入的 SYBR染料分子則不能發(fā)射熒光，這樣保證熒光信號和PCR產(chǎn)物同步增加。
[0003] 轉(zhuǎn)錄組測序是基因功能及結(jié)果研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，通過高通量測序，能全面的 獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，而C4BPA基因是通過 對高乳脂奶牛及低乳脂奶牛的乳腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序選擇出的差異基因。
[0004] C4(Complement 4)是補體系統(tǒng)中補體激活第一途徑中的一個重要成分，1977年 Ferreira等報道了小鼠血清中的一種蛋白質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)模式現(xiàn)多以Dahlback等描述的 蜘蛛樣結(jié)構(gòu)來進(jìn)行分析，能與補體C4成分特異性結(jié)合，同時也發(fā)現(xiàn)人中也有該種物質(zhì)，而 這種物質(zhì)被稱為C4結(jié)合蛋白。
[0005] C4BP (complement component 4binding protein)是參與控制補體活化的抑制因 子，對維持補體在體內(nèi)的平衡起重要的調(diào)節(jié)作用。C4BP也是作為I性因子的一種輔因子，促 進(jìn)I性因子對C4b的裂解，也有抑制C3轉(zhuǎn)化酶的活性的作用。C4BP是由7條相同的a鏈 和1條0鏈組成，并且C4b的結(jié)合位點是位于a鏈，而0鏈?zhǔn)堑鞍踪|(zhì)S的結(jié)合位點。2012 年Hillarp A等發(fā)現(xiàn)兔子和牛的血清中缺乏C4BP蛋白質(zhì)S的復(fù)合體，0鏈基因未表達(dá)，而 鼠的0鏈基因也被進(jìn)化成一種假基因。2014年Strickland DK等發(fā)現(xiàn)C4BP的a鏈上有 結(jié)合LRP的結(jié)合位點。LRP能夠與多種結(jié)構(gòu)及功能各異的配體相互作用，不僅可以對血脂 的動態(tài)平衡及纖溶系統(tǒng)功能的穩(wěn)定進(jìn)行調(diào)節(jié)的作用，而且能參與多種生長因子、細(xì)胞激酶、 生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。C4BP可以通過結(jié)合孔蛋白，可以穩(wěn)定調(diào)節(jié)血清對淋球菌的抵抗性，人 類的C4BP可以選擇性的與淋病奈瑟氏菌相互作用，而造成物種間特異性的感染。2006年 Jenkins HT等發(fā)現(xiàn)C4BP與淋病奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏桿菌、化膿性鏈球菌、大腸桿 菌的相互作用，是定位于C4BP的a鏈的不同區(qū)域，a鏈上有與其結(jié)合的相應(yīng)位點，并使其 表達(dá)出相應(yīng)的性狀。因此進(jìn)一步研究C4BP的a鏈具有重要的意義，研究其他功能和作用 也具有很大的價值。但目前對于C4BPA基因的研究還比較少，關(guān)于C4BPA基因與奶牛乳脂 代謝相關(guān)性的研究尚未有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了提供一種牛乳脂代謝相關(guān)基因C4BPA定量PCR檢測方法。
[0007] 本發(fā)明提供的牛乳脂代謝相關(guān)基因C4BPA定量PCR檢測方法，其方法如下所述：
[0008] 第一步、設(shè)計特異性的定量引物，得到的引物序列如下所示：
[0009] C4BPA 正向引物F: 5 ' AGATACACCTGTCGTCCTGGC 3 '
[0010] C4BPA 反向引物 R :5，TCTGTCTTAACTATCACTTGCCCA 3，
[0011] 用所示的特異性定量引物在奶牛的基因組中進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴增 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0012] 第二步、乳腺組織RNA的提?。?br>[0013] 取高乳脂和低乳脂奶牛的乳腺組織，利用Trizol法進(jìn)行組織RNA提取，經(jīng)過裂解、 分層、沉淀、洗滌、干燥及溶解的步驟，將獲得的RNA進(jìn)行分裝，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 后，用分光光度計測總RNA的濃度，調(diào)整濃度統(tǒng)一后，于-80°C的冰箱凍存?zhèn)溆茫?br>[0014] 第三步、將乳腺組織RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA:
[0015] 將提取的總RNA調(diào)整濃度統(tǒng)一后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的組織RNA反轉(zhuǎn) 錄成 cDNA 樣品，總 RNA 的反轉(zhuǎn)錄體系：5XRNA RT Buffer 4. 0 y 1 ;dNTP Mixture 10mm 2.0 y1 ；01ig〇-dT 1.0 y1 ；AMV Reverse Transcriptase 0.5 y1 ；RNase inhibitor 0? 5 y 1 ;Total RNA 1. 0 y 1 ;RNase Free H207. 0 y 1，反轉(zhuǎn)錄條件為：7(TC 5min ;冰浴 2min ; 42°C 60min ;75°C 15min ;冰浴lOmin，所得產(chǎn)物儲存于-80°C冰箱中備用；
[0016] 第四步、進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)：
[0017] 進(jìn)行熒光定量PCR時的反應(yīng)體系20y 1，包括2XSYBR mix，10y 1 ;cDNA模板， 1.0卩1;(1(11120 8 卩1;上下游引物各0.5卩1，反應(yīng)條件為：95。。308;95。。58,60。。308,40個 循環(huán)。
[0018] 上述第二步中裂解、分層、沉淀、洗滌、干燥及溶解的具體步驟如下：
[0019] 裂解：加入裂解液Trizol 1ml，將研磨好的組織粉末分別加入EP管中，室溫下 裂解5Min ;
[0020] 分層：加入0. 2ml的氯仿，顛倒混勾，15~30°C靜置lOmin，再用4°C大離心機進(jìn) 行離心，12000r離心15Min;
[0021] 沉淀：吸上清置新的離心管中，加0.5ml的異丙醇充分混勻后15~30°C靜置 10min，在4°C的低溫離心機以12000r離心13Min，棄上清；
[0022] 洗滌：加入1ml 75%的冷乙醇，輕輕洗滌沉淀，短暫震蕩混勻，在4°C，12000r離心 5Min，棄上清；
[0023] 干燥：室溫空氣干燥lOMinRNA沉淀至半透明；
[0024] 溶解：加入適量的DEPC 0. 02ML處理水溶解，最后將獲得的RNA進(jìn)行分裝。
[0025] 本發(fā)明的有益效果：
[0026]本發(fā)明通過對部分乳脂性狀關(guān)聯(lián)分析，尤其是對奶牛部分乳脂性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析 并預(yù)測相應(yīng)基因?qū)ζ鋫€體乳脂性狀的影響。提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高、便于 在基因組水平上篩查和檢測C4BPA基因與奶牛乳脂代謝的相關(guān)性的定量PCR方法。為進(jìn)一 步研究該基因及探討可能影響奶牛乳脂的基因提供了依據(jù)及可靠的研究方法。本發(fā)明篩查 獲得C4BPA基因與奶牛乳脂代謝相關(guān)，可用于奶牛的育種工作，以便滿足不同人群對牛奶 中乳脂含量的要求。
【附圖說明】
[0027] 圖1為奶牛乳腺組織中提取總RNA的電泳圖。
[0028] 圖2為奶牛的目的基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0029] 圖3為C4BPA基因在不同奶牛乳腺組織中的表達(dá)量差異分析的溶解曲線圖。
[0030] 圖4為內(nèi)參引物在不同奶牛乳腺組織中的表達(dá)量差異分析的溶解曲線圖。
【具體實施方式】
[0031] 一、試驗材料與方法：
[0032] 1實驗材料：
[0033] 1. 1試驗動物：
[0034] 研究選用生長在同一環(huán)境下并處于泌乳期的中國荷斯坦奶牛15頭，應(yīng)用乳成分 分析儀對奶牛的乳脂率進(jìn)行檢測，早晚各1次，連續(xù)檢測10天。選取高乳脂的中國荷斯坦 奶牛及低乳脂的中國荷斯坦奶牛各3頭，屠宰后取其乳腺組織迅速液氮保存。乳脂率的檢 測結(jié)果如下表1
[0035] 表1.高乳脂和低乳脂奶牛的乳脂率的測定
[0036]
[0037] 1. 2試驗試劑：
[0038] 瓊脂糖（BI0WEST);氯仿、異丙醇、乙醇等均為國產(chǎn)分析純；TAE、水焦磷酸二乙酯 (DEPC)、ddH20,購自 Sigma 公司；RT-PCR 試劑盒（BioRT cDNA First Strand Synthesis kit),購自杭州博日科技有限公司；2XSYBR Premix Ex taq(Tli Rnase Plus)焚光定量試 劑盒（TaKaRa)。PCR引物由上海生物工程公司合成。
[0039] 1. 3分析軟件：
[0040] PCR引物設(shè)計軟件：PrimerPremier5 ;
[0041] 數(shù)據(jù)分析軟件：SPSS 13.0 ;
[0042] 2?試驗方法：
[0043] 本實驗采用的是高乳脂和低乳脂中國荷斯坦奶牛的乳腺組織進(jìn)行的RNA提取，并 將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA