一種測(cè)定d-3-羥丁酸的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定D?3?羥丁酸的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為：試劑R1：緩沖液20~180mmol/L、D?3?羥丁酸脫氫酶0.1~4.9KU/L、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物0.1?6.0mL/L、防腐劑0.01~0.059 mmol/L，其溶劑為純化水，試劑R2：草酸鹽10~40mmol/L、NAD+0.1~4.9mmol/L、防腐劑、0.01~0.059 mmol/L，其溶劑為純化水，本發(fā)明還公開了上述測(cè)定D?3?羥丁酸的試劑盒的制備方法和使用方法，包括以下步驟：按照組分含量配制好試劑：將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的D?3?羥丁酸的濃度。本發(fā)明具有無污染、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。當(dāng)機(jī)體代謝紊亂發(fā)展 至脂肪分解加速，血清酮體積聚超過正常水平時(shí)稱為酮血癥，其臨床表現(xiàn)成為酮癥；當(dāng)酮酸 積聚而發(fā)生代謝性酸中毒時(shí)稱為酮癥酸中毒，如病情嚴(yán)重至發(fā)生昏迷時(shí)，則成為"糖尿病性 昏迷"。而酮體的主要成分是D-3-羥丁酸，約占酮體總量的78%，是糖尿病酮癥酸中毒的主要 物質(zhì)，早期缺乏典型的臨床癥狀，而傳統(tǒng)的酮體檢測(cè)法為亞硝基鐵氰化鈉法，此方法是半定 量的，其檢測(cè)方法雖然具有特異性，然而其主要測(cè)定的是乙酰乙酸和丙酮，敏感性低及不能 定量，為了及時(shí)、準(zhǔn)確地判斷病情，需要有一個(gè)靈敏度高且特異性強(qiáng)的指標(biāo)，D-3-羥丁酸測(cè) 定方法的建立和應(yīng)用，使其逐漸成為糖尿病酮癥早期診斷的重要手段。
[0003] -般，D-3-羥丁酸檢測(cè)方法有酶法、氣相色譜法、放射化學(xué)法等，放射化學(xué)法有放 射性污染，氣相色譜法操作復(fù)雜，且耗時(shí)較長，均不能快速且大量的應(yīng)用于臨床檢測(cè);酶法 的試劑穩(wěn)定性不佳，因此需要改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服放射化學(xué)法有放射性污染、氣相色譜法操 作復(fù)雜和耗時(shí)較長以及酶法的試劑穩(wěn)定性不佳的缺陷，而提供一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑 盒及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測(cè)定D-3-羥丁酸 的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含 量為： 試劑Rl: 緩沖液 20~180mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 0.1~4.9KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.1_6.0mL/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0006] 試劑R2: 草酸鹽 10~40mmol/L NAD+ 0.l~4.9mmol/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0007] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl 和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: 緩沖液 IOOmmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 2.5KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 3.0mL/L 防腐劑 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0008] 試劑R2: 草酸鹽 25mmol/L NAD+ 2.5mmol/L 防腐劑 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0009]作為優(yōu)選，所述的試劑Rl中，所述的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷 緩沖液、1，4-哌嗪二乙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖 液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或多 種任意比例的混合，所述的試劑Rl中，所述的防腐劑為疊氮鈉，所述的試劑R2中，所述的防 腐劑為疊氮鈉。
[0010]作為優(yōu)選，所述的試劑Rl中，所述的緩沖液的pH值為6~9。
[0011] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒的制備方法和使用方 法，包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 緩沖液 20~180mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 0.1~4.9KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.1_6.0mL/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0012] 試劑R2: 草酸鹽 10~40mmol/L NAD+ 0.l~4.9mmol/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0013] (b)將待測(cè)樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d)根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的D-3-羥丁酸的濃度。
[0014] 本發(fā)明的檢測(cè)原理是:本試劑通過D-3-羥丁酸在D-3-羥丁酸脫氫酶的催化下，D-3-輕丁酸被氧化，生成乙酰乙酸，同時(shí)NAD+被還原成NADH，NADH在340nm波長下有特定吸收 峰，因此在340nm波長下檢測(cè)NADH的吸光度變化率，計(jì)算出血清中D-3-羥丁酸的濃度。
[0015] AA-W / min： D-3-輕丁酸濃度(mmol/L)=Cs X '.盒.廣mmol/L) AAs rrnn ： ΔAu/min為待測(cè)樣品平均每分鐘的吸光度變化值 Δ AB/min為校準(zhǔn)液平均每分鐘的吸光度變化值 Cs為校準(zhǔn)液中D-3-羥丁酸的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)： 發(fā)明所采用的酶法，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，且可快速大量的應(yīng)用于臨床診斷，沒有放射性 化學(xué)元素產(chǎn)生的放射性污染，并且改進(jìn)了酶法試劑保存時(shí)間短，不穩(wěn)定的現(xiàn)象，在穩(wěn)定性上 有了更進(jìn)一步的提高，通過添加聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物，使得D-3-羥丁酸脫氫酶穩(wěn)定性 得到了提高，從而使得整個(gè)試劑的穩(wěn)定性得到了提高，繼而也就有效的提高的整個(gè)試劑的 測(cè)量準(zhǔn)確度。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0017] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 lOOmmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 2.5KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 3.0mL/L 疊氮鈉 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0018] 試劑R2: 草酸鹽 25mmol/L NAD+ 2.5mmol/L 疊氮鈉 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0019] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液90mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 3.1KU/L 聚氧丙稀聚氧乙稀共聚物 5.0mL/L 疊氮鈉 0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0020] 試劑R2: 草酸鹽 20mmol/L NAD+ 3.Ommol/L 疊氮鈉 0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0021] 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 lOOmmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 2.5KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 3.0mL/L 疊氮鈉 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0022] 試劑R2: 草酸鹽 25mmol/L NAD+ 2.5mmol/L 疊氮鈉 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0023] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長：主波長340nm、副波長700nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度A1， 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)方向。
[0024] 3、檢測(cè)步驟 (a) 取200μ1試劑Rl與200μ1待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ； (d) 根據(jù)D-3-輕丁酸濃度(mmol/L)=Cs X :l^irt:_(mmol/L)計(jì)算出樣本中的D_3_ AflB :/ roi η 羥丁酸的濃度。
[0025] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 I、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液90mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 3.1KU/L 聚氧丙稀聚氧乙稀共聚物 5.0mL/L 疊氮鈉 0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0026] 試劑R2: 草酸鹽 20mmol/L NAD+ 3.Ommol/L 疊氮鈉 0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0027] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長：主波長340nm、副波長700nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度A1， 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)方向。
[0028] 3、檢測(cè)步驟 (a) 取200μ1試劑Rl與200μ1待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ； AAii11 Itiiili: (d) 根據(jù)D-3-輕丁酸濃度(mmol/L)=Cs X -'(mmol/L)計(jì)算出樣本中的D_3_ ：ΔΑ?： / min 羥丁酸的濃度。
[0029] 表1為實(shí)施例1所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品1進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的D-3-羥丁酸的濃度為 0.29mmol/L，測(cè)定結(jié)果見表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒對(duì)質(zhì)控品1的測(cè)定結(jié)果偏差較 小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0030] 表2為實(shí)施例1所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測(cè)定D-3-羥丁 酸的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品2進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的D-3-羥丁酸的濃度為 1.15mmol/L，測(cè)定結(jié)果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒對(duì)質(zhì)控品2的測(cè)定結(jié)果偏差較 小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0031] 表3為實(shí)施例3所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多次反 復(fù)測(cè)定以及實(shí)施例4所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多次反復(fù)測(cè) 定，對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下：
由表3可知本發(fā)明所制得的測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒的精密度比較好，而且由表1可 知，實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0032] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液 體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 0.1~4.9KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.1_6.0mL/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 草酸鹽 10~40mmol/L NAD+ 0.l~4.9mmol/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的 試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 100mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 2.5KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 3.0mL/L 防腐劑 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 草酸鹽 25mmol/L NAD+ 2.5mmol/L 防腐劑 0.035 mmol/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒，其特征在于:所述的試劑 R1中，所述的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩沖 液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖 液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖 液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或多種任意比例的混合，所述的試劑 R1中，所述的防腐劑為疊氮鈉，所述的試劑R2中，所述的防腐劑為疊氮鈉。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒，其特征在于:所述的試劑 R1中，所述的緩沖液的pH值為6~9。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定D-3-羥丁酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其 特征在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 20~180mmol/L D-3-羥丁酸脫氫酶 0.1~4.9KU/L 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 0.1_6.0mL/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 草酸鹽 10~40mmol/L NAD+ 0.l~4.9mmol/L 防腐劑 0.01~0.059 mmol/L 其溶劑為純化水 (b) 將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的D-3-羥丁酸的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK105842437SQ201610273294
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請(qǐng)人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司