血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種包含酶的測定方法；或是利用可見光，通過測試反應的結果產生 顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測血清中葡萄糖的雙試劑測 定方法。
【背景技術】
[0002] 臨床實驗室常用GOD-PAP法測定血清葡萄糖，測定波長為520nm，但此法易受脂 血、黃疸血、溶血的干擾而造成或高或低的影響，當溶血標本采用葡萄糖氧化酶法單試劑反 應中，血紅素中過氧化氫酶會分解葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖產生的過氧化氫，從而使產生 的紅色醌亞胺與葡萄糖不成等量關系，而使葡萄糖測定結果偏低；脂血、黃疸、溶血在中測 定波長為520nm產較大吸光度，從而干擾葡萄糖測定，脂血、黃疸、溶血等對血清葡萄糖的 測定影響主要是光譜吸收；當脂血、黃疸、溶血血清指數(shù)較大時，會超過儀器設置的樣品限， 儀器會報警提示可能對結果造成影響，測定反應的光吸收遠小于血清指數(shù)的光吸收，測定 信號被"淹沒"，光信號的微小變化對測定結果產生較大波動。
[0003] 為了克服葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖干擾，特別是溶血干擾，本發(fā)明采用了雙試 劑內空白測定方法，使用3-氨基-1，2,4-三唑通過抑制血紅素過氧化氫酶活性來抑制干擾 反應；加入試劑II后，葡萄糖氧化酶氧化0 -D型葡萄糖生成過氧化氫和D-葡萄糖酸，過氧 化氫在過氧化物酶的作用下，與N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基）-3, 5-二甲氧基苯胺鈉鹽 (DAOS)和4-氨基安替比林縮合成蘭色醌亞胺，儀器在595-610nm波長處檢測，本發(fā)明檢測 時不受溶血中血紅蛋白產生的血紅素過氧化酶干擾。采用N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙 基）-3, 5-二甲氧基苯胺鈉鹽色原物，由于形成蘭色醌亞胺，其測定波長為600nm，在脂血、 黃疸、溶血等光譜吸收遠小于520nm紅色醌亞胺的光吸收，增加了反應信號和噪音的比值， 提高了測定的準確性，因此，既降低了內源性干擾，有消除了血清指數(shù)的干擾，是準確性更 高的葡萄糖檢測方法。
[0004] 本研宄采用新的酚衍生物N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3, 5-二甲氧基苯胺 鈉鹽為Tinder反應的色源，顯色反應的靈敏度高，且生成的醌亞胺染料最大吸收波長為 600nm等方法，溶血、黃疸、脂血等引起的干擾使用雙試劑和新色原物后明顯減小，各項方法 學指標滿足臨床實際應用需要，具有選擇性好、靈敏度高、測定簡便等特點，適合臨床推廣 應用，具備全自動生化分析儀的臨床實驗室使用。
【發(fā)明內容】
[0005] 為解決溶血標本中血紅素過氧化氫酶干擾問題及血清指數(shù)干擾問題，本發(fā)明設計 了雙試劑測定方法，試劑配方及使用方法如下：
[0006] 試劑I:每升0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中含有3-氨基_1，2,4_三唑0.80mol，4-氨 基安替比林 〇? 60mmol，變旋酶2KU、Proclin-300 200 yL〇
[0007] 試劑II:每升0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中含有N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙 基）-3, 5-二甲氧基苯胺鈉鹽1. 2mmol、抗壞血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶（P0D)20KU、過 氧化物酶 15KU、Proclin-300 200yL〇
[0008] 其測定方法為：血清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，血清中葡萄糖與試劑I 中變旋酶反應，a型葡萄糖轉化為0-D型葡萄糖，3-氨基-1，2,4-三唑抑制血紅素過氧化 氫酶活性，抑制干擾反應如反應式（1) (2);加入試劑II后于37°C溫浴4~7分鐘，葡萄糖氧 化酶氧化0 -D型葡萄糖生成過氧化氫和D-葡萄糖酸，過氧化氫在過氧化物酶的作用下，與 N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基）-3, 5-二甲氧基苯胺鈉鹽和4-氨基安替比林縮合成蘭色 醌亞胺如反應式（3) (4)，儀器在595-610nm波長處檢測，以樣品與試劑I反應為空白，由試 劑II反應產生的蘭色醌亞胺計算出葡萄糖的含量。本發(fā)明檢測時不受溶血、脂血、黃疸等血 清干擾，不受溶血中血紅蛋白產生的血紅素過氧化酶的影響，不增加工作量與試劑成本，經(jīng) 濟方便易行，是一種既能消除內源性干擾，又能消除溶血、脂血、黃疸干擾，準確性更高的葡 萄糖檢測方法。
[0009] 本發(fā)明方法葡萄糖氧化酶法測定反應公式：
[0010] 第一步反應
[0011]
[0012]
【主權項】
1. 一種血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法，其特征在于采用雙試劑內空白法進行測 定，其測定方法為：血清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，加入試劑II后于37°C溫浴4~ 7分鐘，儀器在595-610nm波長處檢測，以樣品與試劑I反應為空白，由試劑II反應產生的 蘭色醌亞胺計算出葡萄糖的含量，計算公式為： 0Dglu= 0D 2-〇〇! X [ (SV+RJi) / (SV+RJi+R^)] 葡萄糖濃度=FXODau 其中〇Dau是葡萄糖產生的吸光度，0D:是樣品加入試劑I反應后測得的吸光度，(?2是 樣品加入試劑II反應后測得的吸光度，SV是血清樣品的體積，RA是試劑I的體積，R2V2是 試劑II的體積，F(xiàn)是校正因數(shù)。
2. -種血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法，其特征在于試劑I:每升0.lmol/L磷酸 鹽緩沖液中含有3-氨基-1，2,4-三唑0. 80mol，4-氨基安替比林0. 60mmol，變旋酶2KU、 Proclin-300 200yL;試劑II:每升0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中含有N-乙基-N-(2-羥 基-3-磺丙基）-3, 5-二甲氧基苯胺鈉鹽1. 2mmol、抗壞血酸氧化酶30KU、葡萄糖氧化酶 20KU、過氧化物酶 15KU、Proclin-300 200yL。
3. -種血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法，其特征在于試劑I中3-氨基-1，2,4-三 唑為血紅素過氧化氫酶抑制劑。
4. 一種血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法，其特征在于試劑I中色原物為4-氨基安 替比林；試劑II中色原物為N-(2-羥基-3-磺丙基）-3, 5-二甲氧基苯胺鈉鹽。
5. -種血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法，其特征在于試劑I和試劑II中磷酸鹽緩 沖液的pH值為7.0 ±0.2。
6. -種血清中葡萄糖氧化酶雙試劑測定方法，其特征在于測定的體積比為：樣品：試 劑I:試劑II= 1 : 70 ~80 : 20 ~30。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清中葡萄糖氧化酶測定方法，屬于利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法。本發(fā)明的技術方案是采用雙試劑內空白法進行測定，通過試劑I中3-氨基-1，2，4-三唑抑制血紅素過氧化氫酶活性來抑制干擾反應；加入試劑Ⅱ后，葡萄糖氧化酶氧化β-D型葡萄糖生成過氧化氫和D-葡萄糖酸，過氧化氫在過氧化物酶的作用下，與N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉鹽和4-氨基安替比林縮合成蘭色醌亞胺，儀器在595-610nm波長處檢測。本發(fā)明檢測時不受溶血中血紅素過氧化酶干擾，是一種能消除溶血內源性干擾，準確性更高的葡萄糖檢測方法。
【IPC分類】G01N33-96
【公開號】CN104714040
【申請?zhí)枴緾N201510168446
【發(fā)明人】李立和, 王彥平, 常玉芝, 李錚, 丁弘, 白會倉, 郭秋紅, 閆瑞振
【申請人】天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月6日