專利名稱：β－欖香烯用于抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及植物提取物β-欖香烯的新的藥物用途。
背景技術(shù)：
腦腫瘤，其中在成人最為常見的是腦膠質(zhì)瘤，是顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，由于對化療敏感性低，臨床治療中，主要采用手術(shù)切除，術(shù)后輔助化療，只有患者體力狀況較好，則可采用氯乙亞硝腺、環(huán)己亞硝腺、甲環(huán)亞硝腺等藥。近年來，用新一代鬼臼類藥物，例如VM-26治療也獲得一定的療效，但是，一般說來，緩解期通常是3-6個(gè)月，預(yù)后極為惡劣。
至于腦轉(zhuǎn)移瘤例如肺癌、乳腺癌等腫瘤的腦轉(zhuǎn)移，一般可看作是腫瘤晚期的表現(xiàn)?，F(xiàn)在用放射治療取得一定療效，而化療僅僅是作為輔助治療，在患者一般狀況良好的情況下方才進(jìn)行，療效不顯著，有效率低，緩解期短。
欖香烯在臨床應(yīng)用已有多年，有嚴(yán)格對照的臨床試驗(yàn)證明除胸腹水及淺表性腫瘤瘤內(nèi)注射以外，欖香烯對其他各個(gè)部位的實(shí)體瘤療效不明顯?？墒墙陙砼R床研究表明，欖香烯對腦膠質(zhì)瘤glioma的有效率(CR+PR)竟高達(dá)46％，對腦轉(zhuǎn)移瘤也取得了類似的結(jié)果。并且在病人反復(fù)應(yīng)用后，也沒有顯示對該藥的耐藥性。而β-欖香烯是欖香烯的主要的活性組成部分，其制備方法和抗癌活性研究在文獻(xiàn)中已有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞有很好的抑制作用，并且具有高選擇性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯通過對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的高選擇性抑制作用，可以有效的抑制腦腫瘤的生長和腦轉(zhuǎn)移腫瘤的生長。因此，我們發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯可以用作藥物，用于抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，進(jìn)而用于抑制腦腫瘤的生長和腦轉(zhuǎn)移腫瘤的生長，因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供了β-欖香烯的一種新的用途，即用于抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的用途；本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了β-欖香烯用于制備治療腦腫瘤的藥物的用途；本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了β-欖香烯用于制備治療腦轉(zhuǎn)移腫瘤的藥物的用途。
本發(fā)明的β-欖香烯可以單獨(dú)使用也可以與其它藥物配伍，制成藥物組合物，用于腦腫瘤，尤其是腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，和腦轉(zhuǎn)移瘤，尤其是肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤。這種藥物組合物可以采用普通的劑型，如注射劑等形式。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
一、β-欖香烯的體外抗腫瘤作用1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康腗TT法實(shí)驗(yàn)測定β-欖香烯對多種動(dòng)物及人體腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用2、儀器設(shè)備2.1CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，PHARMA SCIENTIFIC2.2酶聯(lián)免疫檢測儀，Labsystems，wellscan，MK.22.3垂直單面雙人超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠2.4倒置生物顯微鏡，37XB/37×BTV，上海光學(xué)儀器六廠3、實(shí)驗(yàn)材料及配制3.1人體腫瘤腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(SHG44)、胃癌細(xì)胞(MGC)、人肝癌細(xì)胞(QGY)、白血病細(xì)胞(HL-60)、肺癌細(xì)胞(LAX)、小鼠黑色素瘤(K111)、人乳腺癌細(xì)胞株(Bcap-37)、人慢性髓原白血病(K562)、人大細(xì)胞肺癌(NCI-H460)。
3.2RPMI(1640)細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO)含10％滅活新生小牛血清(上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司)；L-谷氨酰氨(進(jìn)口分裝，SANGON)；丙酮酸鈉；1×105U.L-1青霉素，100mg.L-1鏈霉素；無菌過濾，4℃保存。
3.3 0.25％胰蛋白酶溶液(Trypsin)購自Invitrogen公司，-20℃保存。
3.4磷酸緩沖液(PBS)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，溶于1L雙蒸水，121℃高壓消毒20min，4℃保存。
3.5MTT(AMRESCO)溶液用PBS配成5mg/ml溶液。
3.6溶解液每100ml去離子雙蒸水含SDS10g，異丁醇5ml，濃硫酸0.12ml。
4、實(shí)驗(yàn)方法β-欖香烯對上述腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性通過MTT法測得。具體步驟如下4.1樣品制備將β-欖香烯溶解于二甲亞砜中，得到濃度為10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀釋，得到濃度分別為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml的稀釋樣品。
4.2將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10μl，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測試。將DMSO相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對照。
4.3取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)胎盤藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2×105細(xì)胞/ml。
4.4在平底96孔板中，每孔加入90微升細(xì)胞，于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
4.5將加入細(xì)胞的平底96孔板在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫48小時(shí)。
4.6每孔中加入10μl5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3～4小時(shí)。
4.7每孔加入100μl DMSO，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過夜，使生成的甲簪晶體充分溶解。測定492nm光吸收值。
4.8根據(jù)光吸收值計(jì)算β-欖香烯處理后細(xì)胞相對存活率。計(jì)算公式如下

4.9通過Xlift軟件計(jì)算β-欖香烯對各腫瘤細(xì)胞的IC50。
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，β-欖香烯所測試腫瘤細(xì)胞的IC50都等于或大于50μg/ml，對外周血管內(nèi)皮細(xì)胞的IC50都在30--60μg/ml，對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的IC50在0.6--0.8μg/ml。
表1、β-欖香烯對多種腫瘤細(xì)胞株的體外生長抑制作用

6、結(jié)論β-欖香烯在體外對所測試的動(dòng)物和人體腫瘤結(jié)果顯示基本上沒有明顯的抗腫瘤作用。
二、β-欖香烯抗腫瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、受試藥物1.1名稱β-欖香烯乳注射液。相應(yīng)空白乳劑。
1.2提供單位大連遠(yuǎn)大制藥有限公司1.3批號(hào)0211201.4含量、制劑標(biāo)示量含β-欖香烯10mg/ml。
1.5配制方法精確量取β-欖香烯乳加入相應(yīng)空白乳劑稀釋至所需濃度即可。給藥體積0.5ml/20g鼠。
2、實(shí)驗(yàn)材料2.1溶劑相應(yīng)空白乳劑。
2.2陽性對照品注射用環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥集團(tuán)出品，每天腹腔給藥一次，連續(xù)七天。
2.3瘤源人體腫瘤肺癌A549、人體肝癌QGY、人體腫瘤卵巢癌ao10/17、人體前列腺癌PC-3M、人體腫瘤腸癌HCT-8、人體乳腺癌Bcap-37、人體腫瘤腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG44裸鼠體內(nèi)模型及小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤G422模型；人體腫瘤腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞、MGC胃癌細(xì)胞、QGY肝癌細(xì)胞、HL-60白血病細(xì)胞及LAX肺癌細(xì)胞均由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。
3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3.1來源裸小鼠由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第005號(hào)。昆明小鼠本院動(dòng)物房供給，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第107號(hào)。
3.2體重裸小鼠為6周齡。小鼠18-20克。
3.3性別雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。
3.4動(dòng)物數(shù)試驗(yàn)組及陽性對照組裸小鼠每組6只小鼠，昆明小鼠每組10只小鼠，陰性對照各為兩組。
4劑量設(shè)置欖香烯乳50、25及12.5mg/kg次。
5給藥方案靜脈注射給藥(i.v)，每天2次(B.i.d)，連續(xù)10天，共給藥二十次。
6試驗(yàn)對照陰性對照給以與試驗(yàn)組高劑量等體積等濃度的相應(yīng)空白乳劑，給藥方案均為靜脈途徑，每天2次，連續(xù)10天。陽性對照環(huán)磷酰胺CTX 30mg/kg，每天一次(q.d)，腹腔注射(i.p)，連續(xù)七天。體外試驗(yàn)陽性對照注射用絲裂霉素，(協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社出品)。
7試驗(yàn)主要步驟7.1腋皮下接種模型無菌條件下取生長旺盛的瘤源，以勻漿法制備成約1×10/ml細(xì)胞懸液，于裸小鼠腋皮下接種0.2ml/每鼠，次日按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥，三周左右處死各組動(dòng)物，剖取腫瘤稱重，按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率腫瘤抑制率％＝[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100人體腫瘤異種移植模型操作相同，但所用的飼料、墊料、籠具及接觸的器械等均應(yīng)高壓消毒后使用，裸鼠置于層流架中飼養(yǎng)。
7.2顱內(nèi)接種動(dòng)物腫瘤模型取生長旺盛的G-422或SHG44瘤源，無菌條件下勻漿法制備成約2×107/ml細(xì)胞懸液，相應(yīng)宿主每鼠顱內(nèi)接種0.05ml，次日按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥，觀察各組動(dòng)物30天內(nèi)生存期，求得各組的平均生存天數(shù)，與陰性對照組比較，按下列公式求出生命延長率。
生命延長率＝[(對照組平均生存天數(shù)-給藥組平均生存天數(shù))/對照組平均生存天數(shù)]×1008試驗(yàn)結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抗腫瘤以50、25、12.5mg/kg/次，iv×10bid方案的高、中、低三個(gè)劑量給藥，對A549肺癌模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為43.08％、40.00％、31.28％。對裸小鼠膠質(zhì)瘤SHG-44G癌模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為44.89％、39.02％、32.20％。對QGY肝癌模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為45.89％、37.20、30.92％。對小鼠膠質(zhì)瘤G422模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為44.62％、40.00％、32.31％。對人體腫瘤卵巢癌ao10/17模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為46.42％、36.25％、31.08％。對前列腺癌PC-3M模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為46.58％、34.78％、27.95％％。對腸癌HCT-8模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為54.20％、46.01％、35.10％。對乳腺癌Bcap-37模型皮下接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為48.08％、43.23％、33.08％。
以60、30、15、7.5mg/kg/d，iv×10qd方案的高、中、低三個(gè)劑量給藥，對小鼠膠質(zhì)瘤G422原位接種模型，生命延長率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為162.84％、154.10％、143.17％、134.97％。對裸小鼠膠質(zhì)瘤SHG-44原位接種模型，生命延長率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為160.36％、148.69％、139.31％、128.72％。以60、30、15、7.5mg/kg/d，it×10qd方案的高、中、低三個(gè)劑量給藥，對小鼠膠質(zhì)瘤G422皮下接種模型，抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為60.89％、47.11％、32.00％。對裸小鼠膠質(zhì)瘤SHG-44皮下接種模型，抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為63.24％、51.35％、37.83％。對小鼠肉瘤S180皮下接種模型，抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為42.35％、23.47％、4.59％。對小鼠Lewis肺癌模型皮下接種模型，抑瘤率實(shí)驗(yàn)結(jié)果為41.74％、19.92％、10.59％。
表2 β-欖香烯乳對人體肺癌 A549(皮下接種)的療效試驗(yàn)

***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同表3 β-欖香烯乳對人體肝癌QGY(皮下接種)的療效試驗(yàn)

***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同表4 β-欖香烯乳對人體卵巢癌ao10/17(皮下接種)的療效試驗(yàn)

***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同表5 β-欖香烯乳對人體前列腺癌PC-3M(皮下接種)的療效試驗(yàn)

***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同表6 β-欖香烯乳對人體腸癌HCT-8(皮下接種)的療效試驗(yàn)

***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同表7 β-欖香烯乳對人體乳腺癌Bcap-37(皮下接種)的療效試驗(yàn)

***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同表8 β-欖香烯乳對裸小鼠膠質(zhì)瘤SHG-44(皮下接種)的療效試驗(yàn)

表9 β-欖香烯乳對小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤G422(皮下接種)的療效試驗(yàn)

表10 β-欖香烯乳注射液對S180(腋皮下接種)的療效

與陰性對照組相比***P＜0.01
表11 β--欖香烯乳注射液對Lewis(腋皮下接種)的療效

與陰性對照組相比***P＜0.01表12 β--欖香烯乳注射液對G422(腋皮下接種)的療效試驗(yàn)

與陰性對照組相比***P＜0.01表13 β--欖香烯乳注射液對SHG-44G(腋皮下接種)的療效

與陰性對照組相比***P＜0.01
上述結(jié)果顯示，腫瘤接種于腋皮下，靜脈注射給藥，需要很高的劑量才顯示其輕度的抗腫瘤作用，甚至，腋皮下接種，瘤內(nèi)局部給藥即在瘤內(nèi)產(chǎn)生非常高的濃度時(shí)，也只有在60mg/kg.d時(shí)才產(chǎn)生輕度到中度的抗腫瘤作用，用氣相色譜方法檢測β-欖香烯靜脈注射后血中藥物濃度和組織分布的結(jié)果，均顯示β-欖香烯無論在血中還是在組織中，藥物的濃度均是很低的，即在這種濃度，β-欖香烯是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到其抗腫瘤效果的濃度。
表14 β-欖香烯乳對小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤G422(顱內(nèi)接種)的療效試驗(yàn)

注***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同按抗腫瘤藥效學(xué)規(guī)程要求，生命延長率125％以上為有效表15 β-欖香烯乳對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG44(顱內(nèi)接種)的療效試驗(yàn)

注***P值＜0.01與陰性對照組相比，下表同按抗腫瘤藥效學(xué)規(guī)程要求，生命延長率125％以上為有效表16 β-欖香烯對LEWIS肺癌顱內(nèi)接種的療效

表17 β-欖香烯對S180腫瘤顱內(nèi)接種的療效

比較上述結(jié)果可以得到小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤G-422顱內(nèi)接種，靜脈給藥共10天，低劑量7.5mg/kg生命延長率達(dá)到134％，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44裸鼠顱內(nèi)接種，靜脈給藥共10天，仍然為有效。各類腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠腋皮下接種，靜脈給藥一天兩次共十天，其低劑量中劑量實(shí)際為25mg/1kg、50mg/kg。只有在高劑量(100mgkg/d)時(shí)才出現(xiàn)效果?？梢姦?欖香烯欖對其他各個(gè)部位的實(shí)體瘤包括腦腫瘤在非腦部的接種的療效遠(yuǎn)不及β-欖香烯對腦腫瘤以及腦轉(zhuǎn)移瘤的效果。
對于這種奇特現(xiàn)象，在其他抗癌藥物，例如環(huán)磷酰胺 阿霉素等，是從未出現(xiàn)的。而那些脂溶性較高的抗癌藥物，例如VM-26等，盡管對顱內(nèi)腫瘤產(chǎn)生較好的效果，但是對腋皮下接種的腫瘤療效甚至更好，而且毒性很大。因此，β-欖香烯抗腦部腫瘤的作用是非常獨(dú)特的。
三、β-欖香烯抗腦腫瘤藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表18 大鼠靜脈注射給藥后β-欖香烯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(X±s)(n＝5)

表19大鼠腹腔注射給藥后β-欖香烯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(X±S)(n＝5)(劑量100mg/kg)

表20大鼠靜脈給藥后β-欖香烯的組織/血漿比(濃度)(n＝5)(劑量100mg/kg)

藥代動(dòng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)β-欖香烯靜脈或腹腔注射后在血中濃度是比較低的，在腦內(nèi)分布也很低，盡管進(jìn)入腦內(nèi)后，清除時(shí)間較長，但是無論在組織還是在血中，濃度遠(yuǎn)達(dá)不到在體外測試的抗腫瘤效果，這可以解釋了β-欖香烯靜脈給藥對腋皮下接種的腫瘤療效較差的原因。
四、β-欖香烯大鼠腹腔注射1個(gè)月對腦部影響大鼠腹腔注射一個(gè)月設(shè)三個(gè)劑量，即7.5、15和30mg/Kg，三個(gè)劑量組和空白乳、10％葡萄糖組作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30mg/Kg和15mg/Kg組在給藥期間各有6只和1只大鼠死亡，原因是高劑量組全部動(dòng)物和中劑量組3只大鼠出現(xiàn)腹水及腹腔粘連，7.5mg/Kg劑量組未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，各劑量組血液學(xué)、血清生化及小便均無明顯的變化，說明β-欖香烯在一定的劑量下對肝、腎等臟器均無明顯影響，但是局部刺激較嚴(yán)重。
大鼠腹腔給藥1個(gè)月，在高劑量及少數(shù)中劑量組中，腦部出現(xiàn)片狀的變性區(qū)域，疑為腦血管病變所引起的。對于這一現(xiàn)象重復(fù)研究仍得到相同的結(jié)果。對病變的腦組織進(jìn)行電鏡檢查，進(jìn)一步提示這些片狀的變性區(qū)域是由腦血管病變所引起的。
出現(xiàn)于腦部的這些病理變化在全身各臟器均未出現(xiàn)，也未見其他各臟器的血管有類似的病理變化。
我們又對β-欖香烯高劑量大鼠腹腔注射一個(gè)月的大腦進(jìn)行了連續(xù)的矢切片和冠狀切片，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-欖香烯在大腦內(nèi)的影響是有區(qū)域特性的，小腦、海馬不受影響。左側(cè)大腦比右側(cè)大腦更容易受到影響。
在大劑量長時(shí)間β-欖香烯作用下，根據(jù)組織學(xué)和電鏡檢查認(rèn)為是大鼠顱內(nèi)血管發(fā)生了變化，這種變化會(huì)引起供血障礙，所以引起腦內(nèi)特征性病變。
五、體外血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和對β-欖香烯敏感性結(jié)果顯示腦血管內(nèi)皮細(xì)胞對β-欖香烯比其他部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞敏感數(shù)十倍，而比一般的腫瘤細(xì)胞敏感100倍以上。
1、β-欖香烯體外實(shí)驗(yàn)1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康腗TT法實(shí)驗(yàn)測定B-欖香烯對多種動(dòng)物及人體腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用1.2儀器設(shè)備(1)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，PHARMA SCIENTIFIC(2)酶聯(lián)免疫檢測儀，Labsystems，wellscan，MK.2(3)垂直單面雙人超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠(4)倒置生物顯微鏡，37XB/37×BTV，上海光學(xué)儀器六廠1.3實(shí)驗(yàn)材料及配制(1)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室原代培養(yǎng)。
(2)RPMI(1640)細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO)含10％滅活胎牛血清；L-谷氨酰氨(進(jìn)口分裝，SANGON)；丙酮酸鈉；1×105U.L-1青霉素，100mg.L-1鏈霉素；無菌過濾，4℃保存。
(3)0.25％胰蛋白酶溶液(Trypsin)購自Invitrogen公司，-20℃保存。
(4)磷酸緩沖液(PBS)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，溶于1L雙蒸水，121℃高壓消毒20min，4℃保存。
(5)MTT(AMRESCO)溶液用PBS配成5mg/ml溶液。
(6)溶解液每100ml去離子雙蒸水含SDS10g，異丁醇5ml，濃硫酸0.12ml。
1.4實(shí)驗(yàn)方法β-欖香烯對上述血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性通過MTT法測得。具體步驟如下(1)樣品制備將β-欖香烯溶解于二甲亞砜中，得到濃度為10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀釋，得到濃度分別為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml的稀釋樣品。
(2)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10μl，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測試。將DMSO相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對照。
(3)取原代培養(yǎng)好的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞以及人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EV304，經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10％肽牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2×105細(xì)胞/ml。
(4)在平底96孔板中，每孔加入90微升細(xì)胞，于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
(5)將加入細(xì)胞的平底96孔板在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫48小時(shí)。
(6)每孔中加入10μl 5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3～4小時(shí)。
(7)每孔加入100μl DMSO，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過夜，使生成的甲簪晶體充分溶解。測定492nm光吸收值。
(8)根據(jù)光吸收值計(jì)算β-欖香烯處理后細(xì)胞相對存活率。計(jì)算公式如下

(9)通過Xlift軟件計(jì)算β-欖香烯對各腫瘤細(xì)胞的IC50。
1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表21、β-欖香烯對血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外生長抑制作用

如表21所示，β-欖香烯所測試對外周血管內(nèi)皮細(xì)胞的IC50都在30--70μg/ml，對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的IC50在0.6--0.8μg/ml。
用MTT法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)表明，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞對β-欖香烯的敏感性遠(yuǎn)大于其他細(xì)胞。
比較結(jié)果得到大鼠以60mg/kg劑量腹腔注射β-欖香烯三天后，1)尾靜脈注射兩性霉素B脂質(zhì)體(5mg/kg)，于給藥后4小時(shí)取腦，HPLC法測定其藥物含量；2)尾靜脈注射硫酸長春新堿脂質(zhì)體(1mg/kg)，于給藥后0.5小時(shí)取腦，HPLC法測定其藥物含量。
測定結(jié)果顯示，腦組織中藥物含量與未經(jīng)β-欖香烯注射的比較沒有變化。
體外培養(yǎng)生長的血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常情況下組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞不一樣，這種生長迅速的狀況類似于腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)對β-欖香烯的敏感性在一定程度上類似腦腫瘤(顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤)時(shí)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的情況。我們認(rèn)為β-欖香烯之所以腦腫瘤產(chǎn)生相當(dāng)好的療效，是因?yàn)棣?欖香烯抑制了生長活躍中的腦腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到對腦腫瘤血管的抑制，最終引起腦腫瘤血液供應(yīng)障礙，達(dá)到扼腦腫瘤的作用。
本實(shí)驗(yàn)尚顯示β-欖香烯在短期應(yīng)用后，不影響血腦屏障，對長春新堿和二性霉素B均不增加它們在腦內(nèi)的濃度。因此，推測β-欖香烯對顱內(nèi)惡性腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用和一般細(xì)胞毒作用的效果似乎尚不一樣。
我們根據(jù)以上結(jié)果推測顱內(nèi)惡性腫瘤血管有一對β-欖香烯特別敏感的耙點(diǎn)，這一耙點(diǎn)在腫瘤或其他部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞是不存在或分布極少的。
權(quán)利要求
1.β-欖香烯用于抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的用途。
2.β-欖香烯用于制備治療腦腫瘤的藥物的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述腦腫瘤是腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
4.β-欖香烯用于制備治療腦轉(zhuǎn)移瘤的藥物的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述腦轉(zhuǎn)移瘤是肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及β－欖香烯的新的藥物用途。β－欖香烯對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高選擇性抑制作用，進(jìn)而抑制了腦腫瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤的生長。試驗(yàn)證明，β－欖香烯可以用作藥物，用于抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，用于治療腦腫瘤如腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，和腦轉(zhuǎn)移瘤如肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1981749SQ20051013036
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者劉珉宇, 王小晨, 劉全海, 湯生榮, 任雙喜, 許海, 杜麗華 申請人:大連遠(yuǎn)大制藥有限公司, 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 上海人類基因組研究中心