專(zhuān)利名稱(chēng)：一種測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，本發(fā)明還涉及該方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞膜小凹微區(qū)域(Caveolae)是質(zhì)膜上直徑50～100nm的燒瓶狀內(nèi)陷微區(qū)，呈囊泡狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。研究發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)廣泛存在于各種類(lèi)型的細(xì)胞中，在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞中尤為豐富。Caveolae是一種特殊的細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，主要由脂類(lèi)和蛋白質(zhì)組成。脂類(lèi)成分主要包括膽固醇、鞘糖脂(glycosphingolipids，GSLS)、鞘磷(sphingomyelin，SM)。
研究的早期，人們一直以為caveolae的功能主要是參與跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，caveolae亦是細(xì)胞信號(hào)分子富集和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐。其主要的結(jié)構(gòu)蛋白-小窩蛋白(caveolin)對(duì)許多關(guān)鍵信號(hào)分子的活性狀態(tài)起直接調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caveolae參與多種生物學(xué)過(guò)程不依賴(lài)包涵素的胞飲作用(potocytosis)、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)(transcytosis)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)菌、病毒的內(nèi)化等。許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要分子存在于細(xì)胞膜小凹微區(qū)域中，包括G蛋白偶聯(lián)受體(如緩激肽、內(nèi)皮素、乙酰膽堿、β-腎上腺素能受體等)、G蛋白、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等，參與細(xì)胞分化、增殖、腫瘤發(fā)生、炎癥、疾病、衰老等多種病理、生理過(guò)程。但是對(duì)于Caveolae的脂肪酸組成的測(cè)定方法尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法。
本發(fā)明技術(shù)方案是根據(jù)細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域不溶于非離子活性劑，利用化學(xué)特征可以進(jìn)行細(xì)胞膜亞區(qū)域的分離，再采用氣相色譜分析分離的細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成。
本發(fā)明是通過(guò)以下具體步驟完成的一種測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，包含下列步驟
a.哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)；b.破裂細(xì)胞，得細(xì)胞裂解液；c.采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離細(xì)胞膜小凹微區(qū)域；d.提取經(jīng)分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸，采用氣相色譜測(cè)定分離的膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成。
所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法為將哺乳動(dòng)物臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活新生牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100U/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中破裂細(xì)胞的方法是將血管內(nèi)皮細(xì)胞用PBS洗兩次后，收集細(xì)胞，離心后沉淀重新懸浮在1ml含有1％(v/v)非離子活性劑Brij58的緩沖液1(500mMNa2CO3pH 11，25mM MES，150mMNaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)中，超聲破碎細(xì)胞，得細(xì)胞裂解液。超聲波破碎細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)。
所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的方法是將細(xì)胞裂解液與等量的濃度為90％(w/v)的溶解在緩沖液2(25mMMES，pH 6.5，150mMNaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)的蔗糖溶液混合，用5.5ml濃度為36％(w/v)溶解在緩沖液3(250mMNa2CO3，pH 11，25mM MES，150mM NaCl，0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)中的蔗糖緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5ml濃度為5％(w/v)的溶解在緩沖液3的蔗糖溶液覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心18小時(shí)，從頂部每次取1mL，收集分離組分，-80℃保存。
所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中提取經(jīng)分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸是采用萃取法提取血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸總脂。
所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其中采用氣相色譜法測(cè)定分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成是在樣品中加入正十七碳酸內(nèi)標(biāo)后用HP4890氣相色譜儀測(cè)定。氣相色譜法的操作步驟及條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)。
所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法在血管內(nèi)皮細(xì)胞小凹微區(qū)域相關(guān)疾病的防治研究，尤其是在動(dòng)脈硬化和腫瘤抑制方面研究中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用的方法可以簡(jiǎn)單準(zhǔn)確地測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成。小凹微區(qū)域的生理作用，尤其在調(diào)節(jié)動(dòng)脈硬化分子機(jī)理、一氧化氮合酶(NOS)功能、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和信號(hào)傳導(dǎo)方面的作用日益受到人們的重視。已證明小凹微區(qū)域在調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇運(yùn)輸及細(xì)胞增殖、分化、遷移方面發(fā)揮著區(qū)室化調(diào)節(jié)功能。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，小凹微區(qū)域的異常和許多疾病密切相關(guān)，如腫瘤、動(dòng)脈硬化、肌營(yíng)養(yǎng)不良及早老性癡呆、糖尿病等。因此，研究小凹微區(qū)域的脂肪酸組成，闡明小凹微區(qū)域的生物學(xué)特性有利于許多疾病的防治研究，尤其是對(duì)腫瘤、動(dòng)脈硬化方面的研究將開(kāi)辟一個(gè)新領(lǐng)域。


圖1是細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域(Caveolae)示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例11.實(shí)驗(yàn)材料人類(lèi)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUEVC(American Type Culture Collection，Manassas，VA)，DMEM培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)來(lái)源于Invitrogen公司；牛血清白蛋白(組分V)和蛋白酶抑制劑cocktail購(gòu)于Roche公司。
2.血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活新生牛血清(購(gòu)于杭州四季青公司)、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100U/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。為調(diào)節(jié)細(xì)胞的脂肪，細(xì)胞在無(wú)血清含0.4％(w/v)牛血清白蛋白(組分V)IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3.富含caveolae的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的分離。
富含caveolae的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的分離采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超離心法。血管內(nèi)皮細(xì)胞用冷的(4℃)PBS洗兩次后，收集細(xì)胞離心后沉淀重新懸浮在1ml含有1％(v/v)非離子活性劑Brij58的緩沖液1(500mMNa2CO3pH 11，25mM MES，150mM NaCl)，并加入占緩沖液1體積0.1％(v/v)的蛋白酶抑制劑cocktail(每ml含0.12mgantipain-HCl，20μg bestatin，40μg chymostatin，0.12mg E-64，20μg leupeptin，20μgpepstatin，0.12mg phosphoramidon，0.8mg pefabloc，40μg aprotinin)，超聲破碎細(xì)胞。細(xì)胞裂解液與等量的濃度為90％(w/v)的溶解在緩沖液2(25mM MES，pH 6.5，150mMNaCl，和占緩沖液2體積0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)的蔗糖溶液混合，用5.5ml濃度為36％(w/v)的溶解在緩沖液3(250mM Na2CO3，pH 11，25mM MES，150mM NaCl，和占緩沖液3體積0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)的蔗糖溶液緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5ml濃度為5％(w/v)的溶解在緩沖液3的蔗糖溶液覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心18小時(shí)，從頂部每次取1mL，收集不同的分離組分，-80℃保存。
4.氣相色譜分析細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成取分離的細(xì)胞膜小凹微區(qū)域組分，凍干后加入1mL甲醇(含0.9％苯駢三氮唑抗氧劑)混勻后，加入4mL氯仿，混勻，再加入1mL的甲醇使氯仿和甲醇的最終體積比為2∶1，混懸后，加入1mL 50mM KCl，混勻后2000g下離心15分鐘。收集有機(jī)相，水相用1.5mL氯仿洗滌2次，轉(zhuǎn)移有機(jī)相，合并3次的有機(jī)相，通過(guò)有機(jī)膜過(guò)濾(去除大于0.45μm的物質(zhì))，38℃旋轉(zhuǎn)蒸干。
在樣品中加入10μg正十七碳酸內(nèi)標(biāo)和1mL三氯化硼-乙醚∶甲醇溶液(1∶3，v/v)。置于75℃水浴30分鐘，冷卻，再加入0.5mL水和1.5mL正己烷，震蕩混勻后，2000g離心15分鐘。收集上清液，氮?dú)獯蹈?，溶解?5μl氯仿中，2μl進(jìn)樣。使用HP4890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，該系統(tǒng)配備火焰離子化檢測(cè)器(FID)，HP3398A色譜工作站和HP-FFAP石英毛細(xì)管色譜柱(30m長(zhǎng)，內(nèi)徑0.32mm，涂層厚度為0.25μm)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。載氣為高純氮?dú)?，進(jìn)樣器溫度是250℃，檢測(cè)器溫度為300℃，載氣流速為10psi，程序升溫起始溫度110℃，以8℃/分升溫至180℃，保持10分鐘，再以6℃/分升溫至230℃，保持8分鐘后，10℃/分升溫至250℃，保持3分鐘。
常規(guī)比色法測(cè)定磷的含量(用于校正)。
測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
表1是人類(lèi)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞小凹微區(qū)域脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果


(注表中脂肪酸表示方式a:b(n-c)中a代表碳原子數(shù)，b代表雙鍵數(shù)，c代表雙鍵位置)
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于包含下列步驟a.哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)；b.破裂細(xì)胞，得細(xì)胞裂解液；c.采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離細(xì)胞膜小凹微區(qū)域；d.提取經(jīng)分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸，采用氣相色譜測(cè)定分離的膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法為將哺乳動(dòng)物臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基體積百分比10％的熱滅活新生牛血清、青霉素100U/ml培養(yǎng)基、鏈霉素100U/ml培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在5％CO2于37℃條件下培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于破裂細(xì)胞的方法是將血管內(nèi)皮細(xì)胞用PBS洗兩次后，收集細(xì)胞，離心后沉淀重新懸浮在1ml含有1％(v/v)非離子活性劑Brij58的緩沖液1(500mM Na2CO3pH 11，25mM MES，150mM NaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)中，超聲破碎細(xì)胞，得細(xì)胞裂解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的方法是將細(xì)胞裂解液與等量的濃度為90％(w/v)的溶解在緩沖液2(25mM MES，pH 6.5，150mM NaCl，和0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)的蔗糖溶液混合，用5.5ml濃度為36％(w/v)溶解在緩沖液3(250mM Na2CO3，pH 11，25mM MES，150mM NaCl，0.1％(v/v)蛋白酶抑制劑cocktail)中的蔗糖緩慢覆蓋其上層，然后再用2.5ml濃度為5％(w/v)的溶解在緩沖液3的蔗糖溶液覆蓋在頂層，250000g于4℃下超速離心18小時(shí)，從頂部每次取1mL，收集分離組分，-80℃保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于提取經(jīng)分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸是采用萃取法提取血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域的脂肪酸總脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法，其特征在于采用氣相色譜法測(cè)定分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成是在樣品中加入正十七碳酸內(nèi)標(biāo)后用HP4890氣相色譜儀測(cè)定。
7.權(quán)利要求1所述的測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法在血管內(nèi)皮細(xì)胞小凹微區(qū)域相關(guān)疾病的防治研究，尤其是在動(dòng)脈硬化和腫瘤抑制方面研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域脂肪酸組成的方法及其應(yīng)用。該方法通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，破裂細(xì)胞，采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心法分離血管內(nèi)皮細(xì)胞膜小凹微區(qū)域，提取經(jīng)分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域的脂肪酸，采用氣相色譜法測(cè)定脂肪酸組成。該方法能夠簡(jiǎn)單、有效、準(zhǔn)確地測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜小凹微區(qū)域的脂肪酸組成，可用于小凹微區(qū)域相關(guān)疾病的防治研究，尤其是在動(dòng)脈和腫瘤抑制方面的研究。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1821776SQ20061000553
公開(kāi)日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者李秋榮, 譚力, 黎介壽 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院