一種sd大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種生理功能，能產(chǎn)生和分泌許多生物活性物質(zhì)，在維持血管舒縮，抗凝血等方面起重要作用。體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細(xì)胞功能及其在各種疾病發(fā)生發(fā)展中所起作用的基礎(chǔ)。從實驗用SD大鼠頸總動脈分離得到的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)是廣泛用于實驗研究的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0003]內(nèi)皮細(xì)胞體外生長能力較差，原代培養(yǎng)不易成功。以往主要是采用機(jī)械分離法和組織塊移植法。將臍靜脈剪開，用手術(shù)刀背等刮取內(nèi)皮細(xì)胞或使用帶有尼龍篩的分離管，但這一方法很難掌握力度，用力太輕，取得的細(xì)胞數(shù)量很少；用力太重，易混雜其他血管壁細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等，而且此方法易損傷內(nèi)皮細(xì)胞。近幾年來內(nèi)皮細(xì)胞分離已逐漸被酶消化法取代，此法獲得的細(xì)胞較純，且能較好地保持其生物活性，但是胰酶對細(xì)胞膜有較強(qiáng)的分解能力，能夠破壞細(xì)胞的完整性，影響細(xì)胞的活力，并且消化所得的內(nèi)皮細(xì)胞中，可能含有大量的成纖維細(xì)胞，對后續(xù)實驗產(chǎn)生影響，膠原酶消化時間長，細(xì)胞解離不充分且損傷大，另外所得細(xì)胞極少，培養(yǎng)時細(xì)胞活性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，不僅成活率高、對細(xì)胞損害低，而且經(jīng)濟(jì)實用、簡單易行，適于工廠等大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明為解決上述問題所采取的技術(shù)方案是:一種SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內(nèi)膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內(nèi)，使頸總動脈的內(nèi)膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現(xiàn)頸總動脈內(nèi)膜的消化，所述消化酶溶液由質(zhì)量濃度為0.2%的I型膠原酶和質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內(nèi)膜消化的過程中振動容器，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，消化結(jié)束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1-2:2，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉(zhuǎn)速為1500r/min的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞，將頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)期后轉(zhuǎn)入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)即可。
[0006]進(jìn)一步優(yōu)化，步驟2)所述消化的溫度為37°C、時間20min。
[0007]所述SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入溫度為37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后倒掉培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細(xì)胞和死細(xì)胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入EBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2-3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6天后除去培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入消化液中進(jìn)行消化反應(yīng)，待細(xì)胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應(yīng)；
D、將完成消化反應(yīng)的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，在轉(zhuǎn)速為1500rpm的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養(yǎng)即可。
[0008]進(jìn)一步優(yōu)化，步驟C中所述的消化液是將質(zhì)量濃度為0.125 %的胰酶和質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0009]有益效果
本發(fā)明采用SD大鼠為材料，材料來源廣泛，方便易得。采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化的方法分離得到內(nèi)皮原代細(xì)胞，克服了兩種酶的各自缺點，可獲得較高的細(xì)胞存活數(shù)量。選擇37°C為消化條件，兩種酶活性最高，消化效果最佳，對內(nèi)皮細(xì)胞的消化能力較強(qiáng)。兩種酶按1:1混合，對內(nèi)皮細(xì)胞的損害較小，分離出的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多，雜細(xì)胞污染少，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。此方法經(jīng)濟(jì)實用，簡便易行，有利于獲得所需的體外實驗?zāi)Ｐ图?xì)胞，為進(jìn)一步研究內(nèi)皮細(xì)胞在提高心血管疾病藥物藥效方面提供幫助。
【附圖說明】
[0010]圖1為內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中形態(tài)觀察結(jié)果；
圖2為內(nèi)皮細(xì)胞VIII因子免疫組化結(jié)果；
圖3為丹參注射液對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的MTT檢測存活率圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實施例。
[0012]一種SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內(nèi)膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內(nèi)，使頸總動脈的內(nèi)膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現(xiàn)頸總動脈內(nèi)膜的消化，所述消化酶溶液由質(zhì)量濃度為0.2%的I型膠原酶和質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內(nèi)膜消化的過程中振動容器，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，消化結(jié)束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1-2:2，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉(zhuǎn)速為1500r/min的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞，將頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)期后轉(zhuǎn)入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)即可。
[0013]所述SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入溫度為37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后倒掉培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細(xì)胞和死細(xì)胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入EBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2-3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6天后除去培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入消化液中進(jìn)行消化反應(yīng)，待細(xì)胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應(yīng)；
D、將完成消化反應(yīng)的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，在轉(zhuǎn)速為1500rpm的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養(yǎng)即可。
[0014]步驟2)所述消化的溫度為37°C、時間20min。
[0015]步驟C中所述的消化液是將質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶和質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0016]實施例1
一種SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內(nèi)膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內(nèi)，使頸總動脈的內(nèi)膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現(xiàn)頸總動脈內(nèi)膜的消化，所述消化酶溶液由質(zhì)量濃度為0.2%的I型膠原酶和質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內(nèi)膜消化的過程中振動容器，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，消化結(jié)束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1:2，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉(zhuǎn)速為1500r/min的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞，將頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)期后轉(zhuǎn)入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)即可。
[0017]所述SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入溫度為37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后倒掉培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細(xì)胞和死細(xì)胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入EBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6天后除去培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入消化液中進(jìn)行消化反應(yīng)，待細(xì)胞變圓后除去消化液，并加入胎牛血清以終止消化反應(yīng)；
D、將完成消化反應(yīng)的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，在轉(zhuǎn)速為1500rpm的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后，將沉淀加入到DMHM培基中培養(yǎng)即可。
[0018]步驟2)所述消化的溫度為37°C、時間20min。
[0019]步驟C中所述的消化液是將質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶和質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA按6:1的體積比混合并攪拌均勻后制得。
[0020]實施例2
一種SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
1)選取重為100-150g的SD大鼠，在無菌條件下切取SD大鼠的頸總動脈并除去血污，備用;
2)將頸總動脈切割成長為3-5cm的長段后放入PBS溶液中，剝除頸總動脈的外膜，并將頸總動脈沿縱向切割，把頸總動脈的內(nèi)膜向下平攤于裝有消化酶溶液的容器內(nèi)，使頸總動脈的內(nèi)膜與容器中的消化酶溶液充分接觸，實現(xiàn)頸總動脈內(nèi)膜的消化，所述消化酶溶液由質(zhì)量濃度為0.2%的I型膠原酶和質(zhì)量濃度為0.125%的胰酶按1:1的體積比混合并攪拌均勾后制得；
3)在頸總動脈內(nèi)膜消化的過程中振動容器，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，消化結(jié)束后除去頸總動脈，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清與容器中液體的體積比為1:1，攪拌均勻后制得混合液；
4)將混合液放入轉(zhuǎn)速為1500r/min的離心機(jī)中離心3min，除去上清液后得到頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞，將頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)期后轉(zhuǎn)入溫度為37°C、CO2體積濃度為5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后進(jìn)行傳代培養(yǎng)即可。
[0021]所述SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代方法，包括了以下步驟:
A、把步驟4離心得到的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞放入溫度為37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，然后倒掉培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去紅細(xì)胞和死細(xì)胞；
B、將步驟A處理后的SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入EBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)4-6天后除去培養(yǎng)基，并用無菌PBS溶液清洗，備用；
C、將SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入消化液