一種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基及內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基及內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管內(nèi)皮細胞又稱內(nèi)皮細胞，通常指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上 皮，它形成血管的內(nèi)壁。內(nèi)皮細胞是分布在腦、淋巴結(jié)、肺、肝臟、脾臟等等器官組織中的 一些有共同特點的吞噬細胞的總稱，他們吞噬異物、細菌、壞死和衰老的組織，還參與集體 免疫活動，包括：1、血管收縮及血管舒張，從而控制血壓；2、凝血（血栓形成及纖維蛋白溶 解）；3、動脈硬化；4、血管生成；5、炎癥及腫脹（如：浮腫）。6、內(nèi)皮細胞亦控制一些物質(zhì)， 如白血球進出血管。血管內(nèi)皮細胞最為重要的一個功能就是參與血管的形成，而在眾多心 血管疾病、糖尿病及其他原因引起的血管器質(zhì)性病變中，很多情況下都是由于血管內(nèi)皮細 胞凋亡、壞死或是不再增殖引起的。因此血管內(nèi)皮細胞就成為了現(xiàn)在很多研宄的熱點，這些 研宄以及實驗往往需要用到大量的血管內(nèi)皮細胞。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，采用M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10 %胎牛血清作為培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮細胞。然 而此培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的增殖能力較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞 培養(yǎng)基能夠提高內(nèi)皮細胞的增殖能力。
[0005] 本發(fā)明提供了一種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 維生素 C、牛血清白蛋白、堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、干細胞生長因子、層粘 連蛋白、表皮生長因子、非必須氨基酸和二甲雙胍鹽酸鹽。
[0006] 優(yōu)選地，包括轉(zhuǎn)鐵蛋白3~23 μ g/mL ;層粘連蛋白10~35ng/mL和牛血清白蛋白 8 ~33 μ g/mL〇
[0007] 優(yōu)選地，包括胰島素0. 4~I. 8mg/mL ;維生素 C 8~30 μ g/mL ;非必須氨基酸 33~68ng/mL和二甲雙胍鹽酸鹽8~33mmol/L。
[0008] 優(yōu)選地，包括喊性成纖維生長因子4~18ng/mL ;血管內(nèi)皮生長因子8~30ng/mL ; 干細胞生長因子6~28ng/mL和表皮生長因子6~14ng/mL。
[0009] 優(yōu)選地，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括IMDM無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0010] 優(yōu)選地，包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下組分：
[0011] 胰島素0. 5~I. 5mg/mL ;轉(zhuǎn)鐵蛋白5~20 μ g/mL ;維生素 C 9~28 μ g/mL ;牛血清 白蛋白10~30 μ g/mL ;堿性成纖維生長因子5~15ng/mL ;血管內(nèi)皮生長因子10~28ng/ mL ;干細胞生長因子8~25ng/mL ;層粘連蛋白12~34ng/mL ;表皮生長因子8~12ng/mL ; 非必須氨基酸35~65ng/mL和二甲雙胍鹽酸鹽10~30mmol/L。
[0012] 本發(fā)明提供了一種內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0013] 將臍帶血分離，得到白膜層細胞；
[0014] 將所述白膜層細胞接種于上述技術(shù)方案所述的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)獲得Pl 代內(nèi)皮細胞。
[0015] 優(yōu)選地，所述接種的密度為4. 5 X IO5~5. 5 X 10 5個/mL。
[0016] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的條件為：溫度為35°C，0)2體積濃度5%。
[0017] 優(yōu)選地，所述獲得Pl代內(nèi)皮細胞后還包括：
[0018] 將所述Pl代內(nèi)皮細胞進行傳代培養(yǎng)；
[0019] 所述傳代培養(yǎng)的次數(shù)為3~10次。
[0020] 本發(fā)明提供了一種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 維生素 C、牛血清白蛋白、堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、干細胞生長因子、層粘 連蛋白、表皮生長因子、非必須氨基酸和二甲雙胍鹽酸鹽。本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基 在上述組分的配伍下能夠提高內(nèi)皮細胞的增殖能力。另外，本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基 還能提高內(nèi)皮細胞的成血管能力。實驗結(jié)果表明：本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮 細胞至Pio代時，細胞依然生長旺盛；Pio代內(nèi)皮細胞表型⑶309和⑶31雙陽性表達高達 97. 2%〇
【附圖說明】
[0021] 圖1為比較例1提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長曲線圖；
[0022] 圖2為比較例1培養(yǎng)的P3代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0023] 圖3為比較例1培養(yǎng)的PlO代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0024] 圖4為本發(fā)明實施例1提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長曲線圖；
[0025] 圖5為本發(fā)明實施例1培養(yǎng)的P3代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0026] 圖6為本發(fā)明實施例1培養(yǎng)的PlO代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0027] 圖7為本發(fā)明實施例2提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長曲線圖；
[0028] 圖8為本發(fā)明實施例2培養(yǎng)的P3代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0029] 圖9為本發(fā)明實施例2培養(yǎng)的PlO代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0030] 圖10為本發(fā)明實施例3提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長曲線圖；
[0031] 圖11為本發(fā)明實施例3培養(yǎng)的P3代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖；
[0032] 圖12為本發(fā)明實施例3培養(yǎng)的PlO代內(nèi)皮細胞的流式檢測圖。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明提供了一種內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 維生素 C、牛血清白蛋白、堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、干細胞生長因子、層粘 連蛋白、表皮生長因子、非必須氨基酸和二甲雙胍鹽酸鹽。
[0034] 本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明對所述無血清基礎(chǔ) 培養(yǎng)基的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的無血清培養(yǎng)基即可，如可以采 用其市售商品。在本發(fā)明中，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選為頂DM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM/F12基 礎(chǔ)培養(yǎng)基和RPM1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的一種或多種。
[0035] 本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括胰島素，優(yōu)選包括胰島素0. 4~I. 8mg/mL，更 優(yōu)選包括胰島素0. 5~I. 5mg/mL。在本發(fā)明的具體實施例中，所述內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括胰 島素0. 5mg/mL、l. Omg/mL或I. 5mg/mL。本發(fā)明對所述胰島素的來源沒有特殊的限制，采用 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的胰島素即可，如可以采用其市售商品。在本發(fā)明的具體實施例中，所 述胰島素購買于禮來公司。在本發(fā)明中，所述胰島素優(yōu)選為人胰島素。本發(fā)明優(yōu)選通過重 組的方式得到胰島素。在本發(fā)明中，所述胰島素能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的代謝過程，能夠促進內(nèi) 皮細胞對氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。
[0036] 本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括轉(zhuǎn)鐵蛋白，優(yōu)選包括轉(zhuǎn)鐵蛋白3~23 μ g/mL， 更優(yōu)選包括轉(zhuǎn)鐵蛋白5~20 μ g/mL。在本發(fā)明的具體實施例中，所述內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括 轉(zhuǎn)鐵蛋白5 μ g/mL、12 μ g/mL或20 μ g/mL。本發(fā)明對所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的來源沒有特殊的限制， 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)鐵蛋白即可，如可以采用其市售商品。在本發(fā)明的具體實施 例中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的品牌為ProSpec品牌，購買于艾美捷科技有限公司。本領(lǐng)域技術(shù)人員 也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組的方式獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白。在本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白 能夠降低內(nèi)皮細胞的蛋白降解；增加氨基酸的攝入，保持細胞的活性。
[0037] 本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括維生素 C，優(yōu)選包括維生素 C 8~30 μ g/mL，更 優(yōu)選包括維生素 C 9~28 μ g/mL。在本發(fā)明的具體實施例中，所內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括維生 素 C 9 μ g/mL、16 μ g/mL或22 μ g/mL。本發(fā)明對所述維生素 C的來源沒有特殊的限制，采用 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的維生素 C即可，如可以采用其市售商品。在本發(fā)明的具體實施例中， 所述維生素 C購買于GIBCO公司。在本發(fā)明中，所述維生素 C能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的形成。
[0038] 本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括牛血清白蛋白，優(yōu)選包括牛血清白蛋白8~ 33 μ g/mL，更優(yōu)選包括牛血清白蛋白10~30 μ g/mL。在本發(fā)明的具體實施例中，所述內(nèi)皮 細胞培養(yǎng)基包括牛血清白蛋白1〇1^8/11^、20以8/1111^或30以8/111匕本發(fā)明對所述牛血清白 蛋白的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的牛血清白蛋白即可，如可以采用 其市售商品。在本發(fā)明的具體實施例中，所述牛血清白蛋白購買于艾美捷Equitech Bio公 司。在本發(fā)明中，所述牛血清白蛋白能夠起到生理和機械保護作用和載體作用。
[0039] 本發(fā)明提供的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基包括堿性成纖維生長因子，優(yōu)選包括堿性成纖維生 長因子4~18ng/mL，更優(yōu)選