通過給定的因子將人內(nèi)皮細(xì)胞重編程為造血多系祖細(xì)胞的制作方法
【專利說明】通過給定的因子將人內(nèi)皮細(xì)胞重編程為造血多系祖細(xì)胞
[0001] 相關(guān)申請的奪叉參考
[0002] 本申請要求2013年1月15日申請的美國臨時申請61/752, 688的優(yōu)先權(quán)，其全部 內(nèi)容并入本申請。
[0003] 本發(fā)_的背景
[0004]通過細(xì)胞核移植（Gurdon，J.B?等，Nature182 :64_65 (1958) ;Eggan，K?等， Nature) 428 :44-49 (2004)，Noggle，S?等，Nature478 :70-75 (2011))，細(xì)胞融合（Tada， M?等，CurrBiol11:1553-1558(2001) ;Cowan，C.A?等，Science309:1369-1373(2005); Blau，H.M.等，SeminCellDevBiol10:267-272(1999))以及轉(zhuǎn)錄因子的強(qiáng)制表 達(dá)（Takahashi，K?等，Cell131:861-872(2007);Chen，M.J?等，CellStemCell9: 541-552(2011))已將體細(xì)胞重編程為寡能狀態(tài)。體細(xì)胞也被重編程為終末分化細(xì)胞，例 如成肌細(xì)胞（Davis，R.L?等，Cell51 :987-1000(1987))，類巨噬細(xì)胞（Xie，H?等，Cell 117 :663-676(2004))，0 細(xì)胞（Zhou，Q?等，Nature455 :627-632(2008))，類肝細(xì)胞 (Sekiya，S?等，Nature475 :390_393 (2011))，神經(jīng)元（Vierbuchen，T?等，Nature463 : 1035-1041(2010))和內(nèi)皮細(xì)胞（Ginsberg，M?等，Cell151 :559-575 (2012))。一些研究 組最近報道了將纖維原細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)干細(xì)胞/多系神經(jīng)祖細(xì)胞（Han，D.W.等， CellStemCell10:465-472(2012) ;Lujan，E?等，ProcNatlAcadSciUSA109: 2527-2532(2012) ;Thier，M?等，CellStemCell10:473-479(2012))。但是，將體細(xì)胞 直接轉(zhuǎn)換成為功能性的可移植的多系造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPC) -直難以實現(xiàn)（Szabo， E?等.Nature468:521-526(2010) ;Chambers，S.M?等，Cell145:827-830(2011); Pereira，C.F?等，CellStemCell13:205-218(2013))。
[0005] 在鼠科動物的發(fā)育過程中，給定的造血干細(xì)胞（HSC)起源于主動脈-性腺-中腎 (AGM)區(qū)域中的背部主動脈（North，T.E?等，Immunity16:661-672(2002);deBruijn， M.F?等，EMB0J192 :465-2474(2000) ;Medvinsky，A?等，Cell86 :897-906(1996))。在 包括斑馬魚、鼠類以及可能人類的脊椎動物中，HSC被認(rèn)為從內(nèi)襯背主動脈底部和臍動脈的 造血血管細(xì)胞的層中出現(xiàn)（Zovein，A.C?等，CellStemCell3:625-636(2008) ;Boisset， J.C?等，Nature464 :116-120(2010);Bertrand，J.Y?等，Nature464:108-111(2010); Kissa，K.等，Nature464:112-115(2010))。這個過程依賴于轉(zhuǎn)錄因子（TF)RUNXl的表 達(dá)（Chen，M.J.等，Nature457 :887-891 (2009))。在胚體中內(nèi)皮細(xì)胞（EC)和HSPC發(fā)育 的密切關(guān)系引起了造血作用的內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化理論（Zovein，A.C.等，CellStemCell3: 625-636(2008))。
[0006] 盡管已知HSCs和給定的紅系/骨髓祖細(xì)胞（EMP)來自多個含造血內(nèi)皮細(xì)胞的位 置，但仍然很難表征驅(qū)動原始造血內(nèi)皮細(xì)胞向造血祖細(xì)胞自發(fā)個體發(fā)育轉(zhuǎn)變的分子模式 (Chen，M.J?等，Nature457:887-891(2009) ;North，T.E?等，Cell137:736-748(2009))， 這是因為關(guān)鍵分子的識別和它們活動的次序仍然難以捉摸（Orkin，S.H.等，Cell132: 631-644(2008))。轉(zhuǎn)錄因子在造血內(nèi)皮細(xì)胞子代中的差異化表達(dá)與早期發(fā)育決定相關(guān)聯(lián)以 產(chǎn)生給定的HSPC或EC(Chen，M.J.etal.CellStemCell9:541-552(2011))。然而，尚 不清楚轉(zhuǎn)錄因子是否指引這些細(xì)胞命運的決定或者只是簡單地推進(jìn)造血內(nèi)皮細(xì)胞中的預(yù) 定程序。通過解剖學(xué)上不同的生態(tài)位提供的微環(huán)境線索-如AGM、胎兒肝臟和胎盤中的那 些-對原始造血HSCs的生理擴(kuò)增和有效造血發(fā)育而言也同樣需要（Gekas，C.等，DevCell 8 ：365-375(2005))〇
[0007] 治療血液疾病的現(xiàn)代方法依賴于移植健康的HSPC。目前，有兩種主要的可生產(chǎn)足 夠數(shù)量的同種異體和自體HSPC的方法，而這兩者都具有如下局限性：（1)HSPC(例如，來自 臍帶血的HSPC)的體外擴(kuò)增；以及（2)寡能干細(xì)胞定向分化為HSPC。健康的HSPC的體外 擴(kuò)增受限于可使用的供體，并且自體移植時的純化方法和同種異體移植時的HLA匹配使其 復(fù)雜化。寡能細(xì)胞的定向分化受限于我們對造血系統(tǒng)發(fā)育的理解以及穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn) 生，并且尚未得到足夠數(shù)量的成人可移植的HSPC。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 簡休
[0009] 本發(fā)明涉及通過影響在內(nèi)皮細(xì)胞中的某些轉(zhuǎn)錄因子的強(qiáng)制表達(dá)以及在內(nèi)皮飼養(yǎng) 細(xì)胞存在下在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，來從內(nèi)皮細(xì)胞生成造血多系祖細(xì)胞（HMLP)。 按照本發(fā)明生成的HMLP可以產(chǎn)生紅系、淋巴、骨髓和巨核細(xì)胞。這些生成的HMLP可以移植 到小鼠體內(nèi)，因此可用于對包括造血狀況等疾病的治療性處理中。
[0010] 因此，本發(fā)明提供了從人內(nèi)皮細(xì)胞（EC)生成人造血多系祖細(xì)胞（HMLP)的方法。所 述方法包括在有內(nèi)皮飼養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，所述內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá) 以下每種轉(zhuǎn)錄因子：Finkel-Biskis-Jinkins鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源物B(FOSB)，生長 因子獨立轉(zhuǎn)錄抑制子1 (GFI1)，侏儒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 (RUNX1)，脾臟病灶形成病毒原病毒整 合致癌基因（SPI1)，或其功能同源物或F0SB、GF11、RUNX1和SPI1的衍生物。
[0011] 內(nèi)皮細(xì)胞可用于產(chǎn)生HMLP，所述內(nèi)皮細(xì)胞包括胎兒、新生兒、成人或內(nèi)皮祖細(xì)胞。 在一些實施方式中，所述內(nèi)皮細(xì)胞選自人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)或成人皮膚微血管內(nèi) 皮細(xì)胞（hDMEC)。
[0012] 在一些實施方式中，通過一種或多種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞會影響轉(zhuǎn)錄因子的強(qiáng)制表 達(dá)，所述載體驅(qū)動FOSB、GFI1、RUNX1和SPI1的表達(dá)。這些載體中的至少一個還包括可選 擇的標(biāo)記物，如抗生素抗性標(biāo)記物、酶標(biāo)記物、表位標(biāo)記物或可視標(biāo)記物。在存在所述內(nèi)皮 飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下進(jìn)行培養(yǎng)之前，通過選擇表達(dá)至少一種可選擇標(biāo)記物的細(xì)胞，根據(jù)F0SB、 GFI1、RUNX1和/或SPI1的表達(dá)來富集所述內(nèi)皮細(xì)胞。在一些實施方式中，F(xiàn)OSB、GFI1、 RUNX1和SPI1中的一種或多種的所述表達(dá)為可誘導(dǎo)的和/或瞬時的。
[0013] 內(nèi)皮飼養(yǎng)細(xì)胞可以從多種內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行選擇。在一些實施方式中，所述飼養(yǎng)細(xì) 胞是人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)，所述人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)被轉(zhuǎn)化以表達(dá)選自 以下的基因：腺病毒E4開放閱讀框1 (E40RF1)基因或Akt基因。
[0014] 內(nèi)皮細(xì)胞可以在內(nèi)皮飼養(yǎng)細(xì)胞存在下，在無血清造血培養(yǎng)基中生長，如無血清造 血干細(xì)胞培養(yǎng)基。所述無血清造血培養(yǎng)基可以包括生長因子和/或細(xì)胞因子，特別是bFGF、 EGF、SCF、FLT3、TP0和IL-6。無血清造血培養(yǎng)基也可以包括IGF-l、IGF-2和IL-3?？梢耘?養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞至少五天，以產(chǎn)生HMLP。可以基于⑶45+細(xì)胞的選擇從細(xì)胞培養(yǎng)中分離HMLP。 在一些實施方式中，通過選擇⑶45+⑶34+細(xì)胞來選擇HMLP。生成的HMLP通常是細(xì)胞的異 質(zhì)混合物，但在特定實施方式中，HMLP的混合物包括⑶45+Lin⑶45RA⑶38⑶90+⑶34+和/ 或CD45+LinCD45RACD38CD90CD34+的細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明所公開的方法產(chǎn)生的HMLP的群體。一種組合物，所述 組合物包括在藥學(xué)上可接受的運載體中的通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的HMLP。
[0016] 本發(fā)明還提供了治療造血功能障礙的方法，包括向給需要治療的對象給予內(nèi)皮細(xì) 胞生成的HMLP。HMLP可以在移植到接受者后分化成造血細(xì)胞。所述造血功能障礙可以選 自，例如，白血病或淋巴瘤。給予所述對象的HMLP可以是與對象自體同源的，或與對象同種 異體。根據(jù)所述公開的方法生成的HMLP不會在接受者中引起惡變。
[0017] 附圖的簡要說明
[0018] 圖1A-1E。A?將人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)向造血多系祖細(xì)胞（rEC-HMLP) 重編程的平臺技術(shù)的圖示。從丟棄的臍帶中分離HUVEC，分類以得到表型標(biāo)記為 ⑶45⑶133cKit⑶31+的內(nèi)皮細(xì)胞（EC)的純?nèi)后w，并擴(kuò)增以用于進(jìn)一步的實驗（-14至0 天）。用FGRS轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVEC，并使轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達(dá)（1-3天）。轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC以1/6密度鋪 板（第4天），并在無血清培養(yǎng)基中的E40RF1+HUVEC(E4-HUVEC)的血管生態(tài)位樣層上生 長（12-40天）。在向血管生態(tài)位樣層上接種轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞兩周左右后，觀察不同的扁平集落 (12-16天）。隨著時間的推移（21-29天），一些菌落呈現(xiàn)了代表假定的rEC-HMLP的三維葡 萄狀結(jié)構(gòu)。一個月后（29-40天）rEC-HMLP大量擴(kuò)增出現(xiàn)典型的造血集落。重編程的過程 細(xì)分為兩個階段：階段I-特異化和階段II-擴(kuò)增。常規(guī)測定擴(kuò)增的培養(yǎng)物的形態(tài)變化、細(xì) 胞數(shù)量以及全造血標(biāo)記物⑶45的表達(dá)?；揖€代表將HUVEC重編程為rEC-HMLP的細(xì)胞數(shù)量 動態(tài)。黑線說明hES-EC分化成造血祖細(xì)胞的低擴(kuò)增潛力。B.用一組TF(白色箭頭）轉(zhuǎn)導(dǎo) HUVEC兩至三個星期后出現(xiàn)圓形造血樣⑶45+細(xì)胞。比例尺為200ym。C.通過與血管生態(tài) 位共培養(yǎng)和無血清環(huán)境來增強(qiáng)以及通過血清的存在來阻斷從FGRS轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC產(chǎn)生造血 狀集簇。D.通過逐一去除TF揭示了在HUVEC培養(yǎng)中能夠產(chǎn)生造血狀集落的最小的一組因 子（FOSB，GFI1，RUNX1和SPI1)。對一組26種TF減去一種TF引起造血狀集簇形成（n= 3)的能力進(jìn)行評估。星號表示，與全組轉(zhuǎn)錄因子相比，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC中的造血狀集簇的數(shù) 目在統(tǒng)計學(xué)上顯著（P< 0.05)減少。對照樣本代表非轉(zhuǎn)導(dǎo)HUVEC。在無血清造血培養(yǎng)基 中在非轉(zhuǎn)導(dǎo)的E4-HUVEC層上培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。E.逐一去除FGRS因子表明，所有四種FGRS 因子對長效造血狀集落的產(chǎn)生是必要的且充分的。
[0019] 圖2A-2E。A.對混合的GFPE4-HUVEC飼養(yǎng)血管單層和GFP+FGRS轉(zhuǎn)導(dǎo)的HUVEC的 FACS分析表明，GFP+新生造血細(xì)胞失去⑶31的表達(dá)（成熟的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物），并獲得 ⑶45 +和⑶45 +⑶34+造血表型。在灰色字體的點圖中的百分?jǐn)?shù)是指在左上角點圖（GFP+細(xì) 胞）的門。在黑色字體的點圖中的百分?jǐn)?shù)是指GFP細(xì)胞。B.FGRS重編程的HUVEC的免疫表 型分析。對形成的造血細(xì)胞進(jìn)行譜系標(biāo)記物，⑶45RA、⑶45、⑶34、⑶90和⑶38的表達(dá)測試。 如圖所示，兩個群體CD45+LinCD45RACD38CD90+CD34+和CD45+LinCD45RACD38CD90CD34+ 細(xì)胞，分別滿足造血干細(xì)胞樣細(xì)胞或多能祖細(xì)胞的表型標(biāo)準(zhǔn)。C.在階段I結(jié)束時，在FGRS 轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生態(tài)位誘導(dǎo)四周后，對GFPCD45CD34細(xì)胞進(jìn)行分類并進(jìn)行接種用于CFU測試。在 CFU測試（放大倍數(shù)X4)、寬視場（左列）和相應(yīng)的熒光圖像（右列）中出現(xiàn)典型造血集 落。從上到下依次為：粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-單核細(xì)胞-巨核細(xì)胞（GEMM)、紅系細(xì)胞/骨髓細(xì)胞 和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞（GM)的集落。下方圖像顯示血紅蛋白化的集落。圖表顯示了CFU測 試的定量結(jié)果。D.從CFU測試集落獲得的細(xì)胞離心涂片的瑞氏-吉姆薩（Wright-Giemsa) 染色證實了分化中的rEC-HMLP(放大倍數(shù)X60)的譜系特異化。我們發(fā)現(xiàn)了具有紅細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞前體的典型形態(tài)特征的細(xì)胞。E.對在CFU試驗中生長的細(xì)胞 的免疫表型分析表明了⑶235+、⑶llb+、⑶14+、⑶83+和⑶45 +細(xì)胞的存在，這表明rEC-HMLP 分化成紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞后代。
[0020] 圖3A-3G。A?將重編程的細(xì)胞（1. 5X106個⑶45 +GFP+細(xì)胞）經(jīng)眼眶后注入到亞致 死劑量照射（275Rad)的小鼠（n= 9 ;輻射1天后）體內(nèi)。B.在2、5、12和16周在經(jīng)注射 的小鼠外周血中檢測循環(huán)的人⑶45+細(xì)胞。在2周（n= 7 ;17. 38±7. 73% )、5周（n= 6 ; 15. 1±13.39%)、12周（n= 6 ;14. 14±5.44%)和 22-40周（n= 6 ;21.23±22.27%)對循 環(huán)的人CD45+細(xì)胞進(jìn)行檢測。將移植22-44周（最多10個月）的小鼠用于進(jìn)一步分析脊髓異 常增生和纖維性變化。C.在移植16周后，外周血、骨髓和脾的分析表明在所有三種組織中 存在人⑶45+細(xì)胞并在外周血中存在h⑶45h⑶235+紅細(xì)胞。BM結(jié)果如圖所示。BM和脾聚集 了rEC-HMLP(CD45+CD33+)的髓系后代和少量但易于檢測的量的CD41a+細(xì)胞（巨核細(xì)胞）。 D.甲基纖維素培養(yǎng)物的FACS分析顯示⑶45隔室包含⑶235 +(血型糖蛋白A)和非小鼠Terll9+細(xì)胞，這表明在CFU試驗中人⑶45 +⑶34+細(xì)胞強(qiáng)烈的紅細(xì)胞分化。E.骨髓內(nèi)體內(nèi)移 植的rEC-HMLP的表型分析顯示少數(shù)人細(xì)胞被表型標(biāo)記為⑶45+Lin⑶45RA⑶38⑶90⑶34+ 并且滿足多效祖細(xì)胞（MPP)的定義。F.在單集落水平上鑒定病毒的整合。將Lin⑶45RA