一種小鼠血管化皮膚移植模型及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學動物模型技術領域，具體涉及一種小鼠血管化皮膚移植模型及其構建方法。
【背景技術】
[0002]1943年，Medawar第一次構建了小鼠同種異體皮膚移植模型，并且揭示了自體皮膚移植不會發(fā)生排斥，而異體皮膚移植將會發(fā)生排斥的基本規(guī)律。皮膚移植模型的建立，為現(xiàn)代移植學的發(fā)展奠定了基礎，具有重要意義。近年來，臨床手移植、臉移植、腹壁移植和陰莖移植等含有皮膚的移植物迅速推廣，但由于皮膚的高免疫原性，患者仍需要較高劑量的免疫抑制劑。小鼠皮膚移植模型建立已接近70年，但皮膚移植排斥的機理仍不完全清楚，因此，合適皮膚移植模型對于進一步研究皮膚排斥機理至關重要。
[0003]傳統(tǒng)的皮膚移植模型將一只小鼠軀干或尾部的全厚皮膚移植到另一只小鼠側胸壁或者背部的創(chuàng)面。這種方法雖然耗時短，但是移植后的皮膚往往需要48_72h才能與創(chuàng)面建立血運連接，在這過程中，移植皮膚經(jīng)歷了較長時間的缺血損傷，這可能會影響對移植物最后的轉歸。因此，利用顯微外科技術，建立帶血管蒂的皮膚移植能很好的避免移植皮膚的缺血時間，能更好的模擬臨床帶皮膚移植物的排斥模式。雖然大鼠血管化的皮瓣是一個很常見動物模型，但是相比而言，小鼠具有很多優(yōu)點，不僅試劑豐富廉價、可選品系眾多，實驗及飼養(yǎng)耗費更低，而且基因操控性更好，有大量的轉基因及基因敲出品系可供機制研究。阻礙小鼠血管化皮膚移植模型建立最主要的障礙是小鼠的股動靜脈血管內徑過短(0.2-0.4_)，采用傳統(tǒng)的血管縫合方法成功率低，操作困難。目前，僅有一篇文獻報道小鼠血管化皮膚移植，他們采用了股動脈端端吻合，股靜脈端側吻合的方式建立了小鼠血管化腹部皮瓣移植。然而這種方式耗時長，手術難度大，移植物成功率低。因此，目前仍急切需要構建簡便的血管化皮膚移植模型。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便，可重復性好，成功率高的小鼠血管化皮膚移植模型及其構建方法，可用于研究臨床血管化皮膚移植排斥機理及誘導免疫耐受機理的動物模型。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是:一種小鼠血管化皮膚移植模型及其構建方法，以小鼠股動靜脈為蒂的腹部皮瓣轉移至另一只小鼠的頸部，利用血管套管(cuff)技術將股動脈與頸總動脈連接，將股靜脈與頸外靜脈連接。
[0006]—種小鼠血管化皮膚移植模型及其構建方法，具體步驟如下:
[0007]第一步:麻醉小鼠，對小鼠下腹部區(qū)域進行備皮，將小鼠四肢固定，標記腹部皮瓣范圍，碘伏或酒精消毒；
[0008]具體要求:適度麻醉，備皮不可用對皮膚有損傷的化學試劑，皮瓣設計要合理。
[0009]具體操作:腹腔注射麻醉；
[0010]利用動物剪毛器小心去除小鼠下腹部毛發(fā)，注意不要損傷皮膚；備皮完成后，將小鼠固定于泡沫塑料板上，在左或者右下三分之一腹部標記出皮瓣切取范圍，大小約為2X2cm或2X3cm，一側皮瓣切取范圍不應過中線；碘伏或酒精消毒皮瓣及周圍，鋪無菌巾；
[0011]第二步:切取皮瓣，分離出皮瓣下方的股動靜脈，保護腹壁淺動靜脈；
[0012]具體要求:皮瓣切取時周圍止血要徹底，分離血管時要去除血管周圍脂肪組織，并結扎股動靜脈周圍小分支，但不能損傷血管；
[0013]具體操作:沿腹部切口切開小鼠表皮及真皮，利用微電凝沿切口結扎皮下小血管分支；將整個皮瓣掀起后可見供應腹部的皮瓣的腹壁淺動靜脈，它們發(fā)自股動靜脈；緊貼腹壁淺動靜脈分支遠端結扎股動靜脈；小心分離股動靜脈，利用微電凝結扎股動靜脈其余小分支；分離完成后靠近心端結扎股動靜脈，利用11-0尼龍線縫牽引線，離斷股動靜脈；由此獲得由股動靜脈供血的小鼠腹部游離皮瓣；
[0014]第三步:準備血管套管(cuff)，將供體皮瓣股動靜脈分別安置合適型號的cuff管；
[0015]具體要求:cuff管為聚酰亞胺材質，內徑為0.36-0.4mm,壁厚為0.25mm(RiverTech Medical, Chatanooga, Tenn)，血管需要選擇合適型號的套管；
[0016]具體操作:將套管剪切成2mm小段；利用顯微剪一側插入套管管腔，橫向和縱向剪開套管一半，做出套管的延伸柄；股動脈選擇內徑為0.36_套管，股靜脈選擇內徑為0.4mm套管；將股靜脈的牽引線從靜脈套管中穿出，牽拉使血管進入管腔；左手顯微鑷夾住股靜脈，盡可能靠近其遠端，右手用血管夾把套管柄夾住，蚊式鉗夾住血管夾尾部以穩(wěn)定血管夾；將股靜脈殘端像卷袖口那樣翻轉，套在套管外面，然后利用11-0尼龍線結扎固定；同樣方法給股動脈放置套管；利用肝素水沖洗移植物，利用濕紗布覆蓋放于-4°C冰箱保存；
[0017]第四步:受體手術準備，解剖分離頸總動脈及頸外靜脈，小鼠皮瓣異位移植；
[0018]具體要求:快速、準確的解剖頸部血管，防止繼發(fā)損傷，妥善放置血管蒂，防止血管蒂急性扭轉；
[0019]具體操作:與供體同樣的方法麻醉受體小鼠，右側頸部利用剪毛器備皮，固定小鼠四肢，將小鼠上顎用橡皮筋固定于泡沫板；
[0020]在受體小鼠右頸部標記出同樣大小的皮瓣受區(qū)(2X2cm)，移除標記的皮瓣；暴露小鼠頌下腺，分離出右側頌下腺并予以結扎，利用微電凝結扎頸外靜脈其他小分支；利用微電凝切除小鼠右側部分胸鎖乳突肌，暴露右頸總動脈，向上分離至頸內動脈分支處，利用11-0尼龍線在分支處結扎血管；利用血管夾于近心端夾閉頸外靜脈，于遠心端結扎并剪斷頸外靜脈；此時將已經(jīng)獲得供體皮瓣置于術區(qū)，左手持顯微鑷夾住股靜脈套管，右手用血管夾把套管柄夾住，蚊式鉗夾住血管夾尾部以穩(wěn)定血管夾，然后利用顯微鑷將頸外靜脈套于股靜脈套管上，11-0尼龍線固定；同樣的方法連接股動脈與頸總動脈；松開血管夾，待皮瓣充血變?yōu)榉奂t后6-0尼龍線縫合皮膚。
[0021]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果主要體現(xiàn)在:
[0022]本發(fā)明的一種小鼠血管化皮膚移植模型及其構建方法，大鼠的股動靜脈較粗，后肢側肢循環(huán)豐富，利用傳統(tǒng)的股動靜脈端端吻合即可原位構建血管化皮膚移植。但小鼠血管較細，利用傳統(tǒng)顯微外科吻合方法手術難度大，小鼠死亡率高；并且由于小鼠后肢側肢循環(huán)欠佳，后肢完全阻斷股靜脈易發(fā)生后肢淤血壞死。Brian等人曾采用股動脈端端吻合，股靜脈端側吻合的方式構建了小鼠原位血管化皮瓣移植，與其比較我們的模型有顯著的優(yōu)勢:
[0023](一)小鼠血管套管替代傳統(tǒng)血管吻合
[0024]傳統(tǒng)的顯微外科血管吻合方法需要很長的供受體準備時間以及血管吻合時間。Brian等人在構建小鼠血管化皮膚移植時采用的是傳統(tǒng)的顯微外科吻合方法，而我們采用的是廣泛運用于小鼠實體器官移植及近年來運用于小鼠復合組織移植常用的血管套管；其優(yōu)勢在于:①更短的供體準備時間更短的受體準備時間；③明顯縮短了移植物熱缺血時間動靜脈吻合更加簡單、迅速和容易掌握；⑤血管吻合口幾乎不會滲血；⑥血管痙攣發(fā)生率更低；
[0025]( 二 )異位皮瓣移植取代原位皮瓣
[0026]Brian等人最早構建的方法為小鼠皮瓣的原位移植，這樣雖然更加符合原來解剖，但是由于原位移植皮瓣截取了小鼠股動靜脈的血供，這樣所帶來的手術并發(fā)癥增加，成功率下降。雖然作者通過股靜脈端側吻合解決了后肢血供問題，但這增加了手術難度，延長了手術時間，增加了手術死亡率。我們采用的小鼠皮瓣頸部異位移植的優(yōu)勢在于:
[0027]①縮短了受體準備時間，小鼠頸外靜脈及頸總動脈相隔較遠，分離這兩只血管要不分離股動靜脈容易，而且頸部血管分支較少，血管蒂較長，為手術提供了較大便利。②顯著提高了小鼠存活率，Sucher等人比較了小鼠后肢原位移植及異位移植，發(fā)現(xiàn)異位移植對受體創(chuàng)傷小，其成功率要遠高于原位移植，我們的實驗也發(fā)現(xiàn)，小鼠異位皮膚移植成功率高達90%以上。③防止術后小鼠撕咬皮瓣，異位皮瓣移植于小鼠頸部，防止了小鼠撕咬皮瓣，而原位移植發(fā)生撕咬皮瓣概率要高很多。
【附圖說明】
[0028]圖1是供體小鼠腹部皮瓣設計位置及大??；
[0029]圖2是供體小鼠分離出股動靜脈，圖中左側為股動脈，右側為股靜脈；
[0030]圖3是小鼠血管套管過程；
[0031 ]圖4是得到的小鼠血管化皮瓣；
[0032]圖5是受體小鼠受區(qū)解剖觀，圖中可以看出右側頌下腺以及胸鎖乳突??；
[0033]圖6是受區(qū)解剖出頸總動脈及頸外靜脈觀；
[0034]圖7是利用血管套管(cuff)技術將股動脈與頸總動脈連接，將股靜脈與頸外靜脈連接，通暢后；
[0035]圖8是皮瓣縫合完成；
[0036]圖9是同基因小鼠皮瓣移植第90天；
[0037]圖10是小鼠異基因皮瓣移植第5天；