天麻素與鉤藤堿配伍對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及作用機(jī)制的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種天麻素與鉤藤堿配伍對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。通過加入一定濃度的同型半胱氨酸誘導(dǎo)損傷內(nèi)皮細(xì)胞，建立高血壓細(xì)胞損傷模型。利用該模型，加入不同濃度的天麻素與鉤藤堿配伍藥物，測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等生化指標(biāo)，檢驗(yàn)配伍藥物對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效果。運(yùn)用Western?Blotting技術(shù)觀察潛在信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白表達(dá)，證實(shí)該潛在通路即為配伍藥物產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路。本發(fā)明開創(chuàng)性地將天麻、鉤藤兩種降血壓天然藥物中有效成分配伍，研究其對(duì)高血壓細(xì)胞損傷模型的保護(hù)。該配伍效果比使用任一單組分顯著，機(jī)制明確，可成為傳統(tǒng)中藥二次開發(fā)的降血壓藥物。
【專利說明】天麻素與鉤藤堿配伍對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及作用機(jī)制
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及天麻、鉤藤兩種天然降壓藥物有效成分:天麻素與鉤藤堿的配伍，特別涉及兩種成分配伍對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及作用機(jī)制。
【背景技術(shù)】
[0002]天麻是中國傳統(tǒng)名貴中藥，臨床常用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇、抽搐、破傷風(fēng)等癥。天麻中含有多種化學(xué)成分，如天麻素、天麻醚苷、天麻多糖、香莢蘭醇、香莢蘭醛、對(duì)羥基苯甲醇，檸檬酸、琥珀酸等。
[0003]天麻素是至今可以分離得到的含量最多的單一成分，結(jié)構(gòu)為對(duì)-羥甲基苯-β -D-葡萄吡喃糖苷。目前，天麻素在臨床上多應(yīng)用于頭痛眩暈及高血壓等心腦血管疾病的輔助治療，效果顯著。其降血壓主要通過對(duì)抗兒茶酚胺的縮血管效應(yīng)；降低外周血管阻力、血壓和增加動(dòng)脈血管順應(yīng)性；增加心腦血管血流量；抑制炎癥早期的滲出和阻止血栓形成和調(diào)節(jié)內(nèi)皮舒張/收縮因子的分泌對(duì)心腦血管及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)發(fā)揮作用。
[0004]在大鼠離體主動(dòng)脈預(yù)收縮實(shí)驗(yàn)中，天麻素顯示出一定的血管舒張作用。舒張效果隨濃度的增加呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，當(dāng)天麻素濃度為1.00g/L時(shí)血管舒張率達(dá)到最大值64%。進(jìn)一步的研究表明，天麻素的降壓作用可能是通過改善血管內(nèi)皮功能來實(shí)現(xiàn)的
[0005]鉤藤，原名釣藤。具有清熱平肝；熄風(fēng)止痙之功效。主治小兒驚風(fēng)；夜啼；熱盛動(dòng)風(fēng)；子癇；肝陽眩暈；肝火頭脹痛。中醫(yī)理論認(rèn)為，鉤藤具有預(yù)防和治療心血管疾病的藥理作用，包括抗血栓，抗心律失常和降血壓。研究表明，鉤藤莖枝含有多種吲哚類生物堿，包括鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿、異柯諾辛堿、柯楠因堿等多種化合物。
[0006]鉤藤堿和異鉤藤堿為鉤藤的主要有效活性成分，鉤藤堿、異鉤藤堿及鉤藤總堿均有明顯的降血壓作用。大鼠麻醉后經(jīng)頸總動(dòng)脈插管記錄外周血壓，靜脈注射鉤藤提取物:異鉤藤堿、鉤藤堿、鉤藤總堿及非生物堿部分，實(shí)驗(yàn)表明鉤藤中4種成分的降壓強(qiáng)度為異鉤藤堿(42.0% ) >鉤藤堿(32.1% ) >鉤藤總堿(21.3% ) >非生物堿(12.4% )。提示鉤藤中主要降壓成分為異鉤藤堿和鉤藤堿。
[0007]中藥復(fù)方強(qiáng)調(diào)整體上調(diào)節(jié)機(jī)體，治療效果更好，因此便需要以配伍中藥入藥，配伍的各個(gè)藥物之間能相互協(xié)同或拮抗，其治療作用遠(yuǎn)非單味中藥能比。最具代表性的是我國中醫(yī)藥中用于治療高血壓的主要方劑——天麻鉤藤飲。鉤藤味甘性涼入肝、心經(jīng)清熱平肝、熄風(fēng)定驚擅治肝熱風(fēng)動(dòng)之證；天麻甘平柔潤(rùn)，入肝經(jīng)養(yǎng)液平肝、息風(fēng)潛陽為治風(fēng)之圣藥，多用于虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)、風(fēng)痰上擾所致諸證。二藥合用，共奏清熱平肝、息風(fēng)止痙之功效。
[0008]臨床研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲對(duì)高血壓有很好的療效。用天麻鉤藤的混合液進(jìn)行降血壓研究，發(fā)現(xiàn)混合液的降血壓效果比單味天麻、鉤藤提取液顯著。但是長(zhǎng)期以來，中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確等問題一直困擾傳統(tǒng)中藥的發(fā)展。
[0009]天麻素和鉤藤堿提取自天麻和鉤藤兩味君藥主要成分，成分明確，質(zhì)量可控，創(chuàng)新之處在于提取了復(fù)方中發(fā)揮君藥作用的單體，再將這些單體進(jìn)行組合。不同于傳統(tǒng)復(fù)方，這種組合將使治療作用更加集中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。以大鼠胸主動(dòng)脈為對(duì)象，考察血管的舒張效果。與每一種單體相比，鉤藤堿、天麻素2種單體組合配伍時(shí)，對(duì)預(yù)收縮血管的舒張作用均有不同程度的增強(qiáng)，并且最大舒張效果都高于復(fù)方。在此基礎(chǔ)上深入研究單體配伍成分對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，有利于闡明天麻素與鉤藤堿配伍降血壓作用機(jī)制，為中藥二次開發(fā)提供新思路。
[0010]同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)是一種含巰基的氨基酸，是甲硫氨酸(methionine, Met)和半胱氨酸(cysteine, Cys)代謝過程中的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)血中HCY濃度升高可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并能誘導(dǎo)或抑制內(nèi)皮細(xì)胞中多種基因的表達(dá)。高同型半胱氨酸血癥通過氧化應(yīng)激機(jī)制誘發(fā)心血管疾病，HCY在氧化反應(yīng)中，可產(chǎn)生超氧化物陰離子、過氧化氫及羥基等活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS),其可與NO反應(yīng)加速NO失活，降低NO生物利用度；HCY本身也能與NO反應(yīng)，直接導(dǎo)致NO濃度降低，使內(nèi)皮細(xì)胞明顯受損傷；HCY還能使低密度脂蛋白自身氧化，生成氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized low density lipo-protein, OX-LDL),而后者可被巨卩遼細(xì)胞攝取并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的進(jìn)一步損傷，同時(shí)可影響一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase, NOS)的表達(dá)進(jìn)一步使NO合成減少。因此應(yīng)用HCY可以模擬高血壓病理?xiàng)l件下細(xì)胞損傷模型。
[0011]Caveolae是細(xì)胞質(zhì)膜表面具有一定生物學(xué)功能的錐形瓶樣內(nèi)陷，Caveolins是Caveolae上的活性蛋白，有三種功能不同的微囊蛋白:Caveolin_l (CAV-1)、CaveoI in-2 (CAV-2)、Caveol in_3 (CAV-3)，其中 CAV-1 是 Caveolae 的最重要的表面標(biāo)記蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，CAV-1肽鏈中間由疏水性氨基酸形成一個(gè)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，將其錨定在細(xì)胞膜上，其相應(yīng)的氨基酸序列的N端和C端都位于細(xì)胞漿中。CAV-1通過N端一段包含41個(gè)氨基酸殘基序列的相互作用，形成14-16個(gè)單體組成的同聚體，而C端的44個(gè)氨基酸殘基使這些同聚體能相互連接。 CAV-1使Caveolae錨定在細(xì)胞骨架上，并富集于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在高爾基體及胞膜區(qū)域之間穿梭并調(diào)控信號(hào)通路，在細(xì)胞分化、發(fā)育、遷移、炎癥、應(yīng)激、免疫等方面發(fā)揮重要作用。
[0012]在血管內(nèi)皮細(xì)胞中關(guān)于CAV-1的研究大多集中在其與eNOS的相互作用，影響NO合成。在靜息條件下，微囊中的CAV-1對(duì)eNOS有負(fù)調(diào)控作用，eNOS與CAV-1的相互作用是eNOS和CAV-1腳手架區(qū)域(OTS)直接結(jié)合的結(jié)果。NO由eNOS合成，eNOS催化L-精氨酸(L-arginine)轉(zhuǎn)化成 L-瓜氨酸(L-citrulline)和 NO。當(dāng) eNOS 結(jié)合到 CSD 上時(shí)，eNOS 失活，導(dǎo)致NO的合成受到了限制。在CDS中的第89-95氨基酸殘基是起到抑制作用的主要部位，特別是第92位的苯丙氨酸對(duì)eNOS的抑制起到?jīng)Q定性的作用。在開發(fā)心血管保護(hù)藥物中，研究作用于CAV-1/eNOS調(diào)節(jié)的藥物十分必要，前景廣闊。因?yàn)镹O是正常生理活動(dòng)進(jìn)程的中心，內(nèi)皮細(xì)胞中NO的異常將導(dǎo)致高血壓等疾病。因此，CAV-1是一個(gè)重要的血壓決定蛋白，在高血壓病中起著重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供了一種針對(duì)治療高血壓，保護(hù)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的天然藥物活性成分配伍。本發(fā)明基于傳統(tǒng)中藥復(fù)方天麻鉤藤飲中降血壓的活性成分作為配伍對(duì)象，同時(shí)避免了中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，質(zhì)量難以控制的缺點(diǎn)，配伍使用比單味藥作用更加顯著。[0014]保護(hù)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的天然降血壓藥物配伍，其配伍成分為:天麻素與鉤藤堿。本發(fā)明涉及的天然降血壓藥物配伍重量比例為，天麻素:鉤藤堿=(0.1~10): I
[0015]本發(fā)明第二個(gè)目的是確證了該配伍藥物對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是通過CAV-1/eNOS/NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。
[0016]根據(jù)高血壓細(xì)胞損傷通過氧化應(yīng)激機(jī)制減少NO誘發(fā)心血管疾病的特點(diǎn)，候選CAV-1/eNOS/NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為潛在配伍藥物的靶點(diǎn)。具體方法是將天麻素鉤藤堿配伍藥物加入構(gòu)建好的細(xì)胞損傷模型中，通過檢測(cè)LDH、MDA、NO等生化指標(biāo)，檢驗(yàn)配伍藥物對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效果，運(yùn)用Western Blotting技術(shù)觀察潛在信號(hào)通路上CAV-1蛋白表達(dá)量驗(yàn)證藥物發(fā)揮保護(hù)作用的途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1天麻素鉤藤堿配伍藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)量效曲線
[0018]圖2MDA含量測(cè)定
[0019]圖3LDH釋放量測(cè)定
[0020]圖4N0含量測(cè)定
[0021]圖5ECV-304細(xì)胞中CAV-1蛋白表達(dá)水平
[0022]圖6CAV-1與β -actin表達(dá)量比值
【具體實(shí)施方式】
[0023]藥品與試劑
[0024]天麻素(gastrodin,98<% );鉤藤喊(rhynchophylla, 90% ) ;DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；MTT (Sigama公司)；DMS0分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)；同型半胱氨酸(阿拉丁公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Gibco);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)；化學(xué)發(fā)光劑(北京碧云天公司)；抗體(Anbo公司)
[0025]細(xì)胞與培養(yǎng)
[0026]人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304:購于武漢大學(xué)“中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC) ”培養(yǎng)條件:5% CO2、37°C、完全培養(yǎng)基(1OOmL完全培養(yǎng)基中含DMEM培養(yǎng)基90mL，胎牛血清10mL，雙抗ImL) 12h后將培養(yǎng)基小心移除，PBS清洗，重新添加培養(yǎng)基6mL，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后將培養(yǎng)基移除，用PBS清洗后，用0.25%胰酶于37°C下消化，加入培養(yǎng)基，按I傳2比例傳代。凍存液按DMSO: FBS: DMEM=I: I: 8凍存細(xì)胞。
[0027]實(shí)施例1天麻素鉤藤堿配伍對(duì)ECV-304細(xì)胞活力的影響
[0028]分組:(I)對(duì)照組:加入10% DMEM培養(yǎng)基；(2)模型組:1000 μ mo I r1Hcy ； (3)天麻素組:100 μ g.mL_1 (4)鉤藤堿組:100 μ g.mL—1 (5)實(shí)驗(yàn)組:分別加入含有不同濃度天麻素鉤藤堿(0.1~10): I配伍的10% DMEM培養(yǎng)基；(6)調(diào)零組:加入無細(xì)胞培養(yǎng)基。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。
[0029]細(xì)胞活力檢測(cè):(1)收集對(duì)數(shù)期EVC-304細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80~90%后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度藥物溶液100 μ L0對(duì)照組和調(diào)零組加入培養(yǎng)基100 μ L0每孔終體積100 μ L0
(2)5% C02，37°C分別孵育12、24、36、48h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入16 μ LMTT溶液，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。(3)將上清吸凈，加入DMSO，使藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度。設(shè)對(duì)照組的細(xì)胞相對(duì)活力為1，其他組的細(xì)胞相對(duì)活力為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比值。作用細(xì)胞12h、24h、36h、48h無明顯細(xì)胞毒性，最終確定藥物溶液與細(xì)胞作用36h最佳。
[0030]為了進(jìn)一步確定最佳用藥濃度范圍，測(cè)定量效關(guān)系，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)量效關(guān)系曲線，選取藥物濃度為5、10、50、100μ g.mL—1。
[0031]實(shí)施例2天麻素鉤藤堿配伍對(duì)HCY損傷的ECV-304細(xì)胞模型保護(hù)效果測(cè)定
[0032]根據(jù)實(shí)施例一確定的用藥濃度和分組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、NO試劑盒說明書方法測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2~圖4所示。根據(jù)結(jié)果表明:與模型組相比，天麻素鉤藤堿配伍降低MDA和LDH的釋放，同時(shí)能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放，對(duì)ECV-304細(xì)胞保護(hù)比使用同濃度單組分效果更加顯著。實(shí)施例3天麻素鉤藤堿配伍對(duì)ECV-304細(xì)胞中CAV-1蛋白表達(dá)量的影響
[0033]提取細(xì)胞中總蛋白，Western Blot檢測(cè)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶。分析結(jié)果如圖5、圖6所示。與對(duì)照組相比，模型組能夠增加細(xì)胞CAV-1的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組中，低濃度的藥物(5 μ g .mr1及10 μ g .mL-1)能夠抑制Hcy損傷細(xì)胞CAV-1的表達(dá)量，高濃度藥物(50 μ g.ml-1及100 μ g.ml-1)對(duì)損傷細(xì)胞CAV-1表達(dá)量的抑制作用不明顯。該結(jié)果表明，天麻素鉤藤堿配伍藥物對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)具有不可逆恢復(fù)性特點(diǎn)，作用機(jī)制是通過CAV-1/eNOS/NO信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)降血壓的功效。
【權(quán)利要求】
1.保護(hù)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的降血壓天然藥物活性成分配伍，其特征在于:該配伍活性成分為，天麻素、鉤藤堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降配伍活性成分，其特征在于:該配伍中活性成分的質(zhì)量比值為，天麻素:鉤藤堿=(0.1-10): I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，其特征在于:所述人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為ECV-304 細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，是在模擬高血壓細(xì)胞損傷模型中，加入不同濃度天麻素鉤藤堿配伍藥物后，與模型組比較，藥物組中LDH、MDA釋放量下降，NO生成量增加，關(guān)鍵蛋白Caveo`lin-1表達(dá)量降低作為保護(hù)作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
【文檔編號(hào)】A61P9/12GK103446168SQ201310413513
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】許激揚(yáng), 卞筱泓, 沃龍飛, 危喜玲 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)