永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備組織缺血損傷修復(fù)生物制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)組織皮膚全層缺損生物制劑和制備治療缺血缺氧性組織損傷生物制劑中的應(yīng)用，所述的復(fù)合細(xì)胞因子為低氧培養(yǎng)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，所述的復(fù)合細(xì)胞因子不含有遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）。用低氧培養(yǎng)的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子局部應(yīng)用，促進(jìn)局部血管的形成，具有明顯的效果。并且對于皮膚組織缺損等損傷疾病具有明顯的組織再生作用。復(fù)合細(xì)胞因子具有多種促進(jìn)血管生成的有效成分，能夠促進(jìn)血管再生，并對損傷組織進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)損傷組織的生長愈合，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等等。
【專利說明】永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備組織缺血損傷修復(fù)生物制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含有永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的生物制劑，用于治療皮膚全層損傷的治療制劑，以及組織缺氧損傷修復(fù)的生物制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種來自于人體肺組織微血管內(nèi)皮的細(xì)胞，具有永生化特性、并且可以分泌大量與血管生長相關(guān)的細(xì)胞因子。該細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入了含有端粒酶催化組分和類人猿病毒40大T抗原的質(zhì)粒。這種細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)超過24個(gè)月，具有非常強(qiáng)的生存能力。另外，這種細(xì)胞在裸鼠移植試驗(yàn)中不會(huì)產(chǎn)生致瘤性。(Generat1nofHuman Pulmonary Microvascular Endothelial Cell Lines)
人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于血管內(nèi)皮組織,表達(dá)有內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物,如血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(PECAM-1，⑶31)、血管性血友病因子(vWF)、細(xì)胞內(nèi)粘附分子(ICAM-1)、血管粘附因子(VCAM-1)、E選擇素等等。另外，其細(xì)胞外基質(zhì)具有非常強(qiáng)的形成血管能力。正是具有這種特點(diǎn)，這種細(xì)胞分泌物可以用于外傷、缺血性疾病等等的臨床應(yīng)用。
[0003]體外應(yīng)用物理的方法對人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)可以進(jìn)一步增強(qiáng)該細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子的血管形成能力。通過低氧1%的方法培養(yǎng)細(xì)胞24-48小時(shí)可以使細(xì)胞大量表達(dá)Gremlin-1和分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。Gremlin-1的高表達(dá)與缺血缺氧器官組織的血管生成以 及抑制凋亡作用有著密切的關(guān)系。(Generat1n of Human PulmonaryMicrovascular Endothelial Cell Lines)
局部缺血性疾病包括心肌缺血、梗塞性腦中風(fēng)、股骨頭缺血性壞死、缺血性腸壞死、難治性皮膚潰瘍、糖尿病足等等。
[0004]目前尚未有將永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用于組織缺血損傷的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)組織皮膚全層缺損生物制劑和制備治療缺血缺氧性組織損傷生物制劑中的應(yīng)用，所述的復(fù)合細(xì)胞因子為低氧培養(yǎng)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，所述的復(fù)合細(xì)胞因子不含有遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)，所述的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下步驟制備而得:1)將永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；2)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞用無血清的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基進(jìn)行收集；3)將條件培養(yǎng)基進(jìn)行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質(zhì)；4)將離心后培養(yǎng)基(含>3.5kDa分子)進(jìn)行透析濃縮，得到濃縮液；5)將濃縮液進(jìn)行凍干處理，得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子凍干粉。
[0006]優(yōu)選地，
所述的低氧培養(yǎng)的氧氣濃度為1%、5%或10%。[0007]所述的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下方法制備而成:
1)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng):永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞為 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
2)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集:在低氧下培養(yǎng)細(xì)胞至第
三代，融合率達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞因子的收集，應(yīng)用無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，將無血清培養(yǎng)基進(jìn)行收集，檢測培養(yǎng)基中是否含有遺傳物質(zhì)，如有則應(yīng)用電泳方法去除；
3)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基的離心純化
將所收集的條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa 的分子濾膜，
4)濃縮
將離心后的條件培養(yǎng)基(含>3.5kDa分子)通過超濾的方式進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer透析膜濃縮2_20倍,得到濃縮液，
5)凍干
將濃縮液放置于容器中進(jìn)行最終凍干，得到凍干粉。
[0008]含有永生化 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的修復(fù)材料，所述的修復(fù)材料包括永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子和透明質(zhì)酸或生理鹽水，每1ml修復(fù)材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子。
[0009]所述的修復(fù)材料的制備方法包括以下步驟:將復(fù)合細(xì)胞因子濃縮液或凍干粉按照一定比例加入透明質(zhì)酸或生理鹽水中，配置成每1ml修復(fù)材料中含有0.1ng-1OOmg復(fù)合細(xì)胞因子的修復(fù)材料。
[0010]所述的修復(fù)材料為膠狀修復(fù)材料、面膜修復(fù)材料或膏狀修復(fù)材料。
[0011]含有永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。
[0012]本發(fā)明具有如下技術(shù)效果:
I)用低氧培養(yǎng)的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子局部應(yīng)用，促進(jìn)局部血管的形成，具有明顯的效果。并且對于皮膚組織缺損等損傷疾病具有明顯的組織再生作用。復(fù)合細(xì)胞因子具有多種促進(jìn)血管生成的有效成分，能夠促進(jìn)血管再生，并對損傷組織進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)損傷組織的生長愈合，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等等。
[0013]2)透明質(zhì)酸材料為一種酸性粘多糖，溶解后比例為0.1_10%，理想濃度為1%，是人體的一種成分，富含水分，具有特殊的保水作用，并且在人體內(nèi)可以自然分解吸收，對皮膚創(chuàng)面以及其他理化損傷創(chuàng)面保持濕潤環(huán)境。
[0014]3)所述缺氧損傷為一種因缺血缺氧造成的組織壞死，本復(fù)合細(xì)胞因子可以，但不限于皮膚難治性潰瘍創(chuàng)面治療，其還可用于心肌缺血、梗塞性腦中風(fēng)、股骨頭缺血性壞死、缺血性腸壞死、難治性皮膚潰瘍、糖尿病足的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)圖
圖2為缺氧培養(yǎng)與正常培養(yǎng)24小時(shí)對VEGF分泌量的影響對照 圖3為永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Gremlin-1在不同氧濃度條件下的表達(dá)變化對照圖4為永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在皮膚全層缺損模型中的治療結(jié)果
圖
圖5A為永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在中風(fēng)模型中的治療作用，大鼠腦部切片。
[0016]圖5B為永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在中風(fēng)模型中的治療作用，大鼠腦部切片紅色熒光圖片。
[0017]圖5C為5A和5B的重疊圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1制備含有永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子
永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離于人正常肺部組織的血管內(nèi)皮組織，并共轉(zhuǎn)染含端粒酶催化成分(hTERT)及SV40LTag的質(zhì)粒制備成為永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HPMEC，PromoCell, Germany)。將細(xì)胞復(fù)蘇后接種于內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Lonza, Swiss)中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)傳代，待細(xì)胞養(yǎng)至第3代時(shí)開始收集細(xì)胞因子。圖1為第三代永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞收集細(xì)胞因子時(shí)形態(tài)，細(xì)胞密度達(dá)到100%。
[0019]永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的制備方法如下:
1)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞為貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代
培養(yǎng)；
2)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集
在低氧(1%氧濃度)下培養(yǎng)細(xì)胞至第三代，融合率達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞因子的收集，應(yīng)用無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，將無血清培養(yǎng)基進(jìn)行收集，檢測培養(yǎng)基中是否含有遺傳物質(zhì)，如有則應(yīng)用電泳方法去除；
3)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基的離心過濾，濃縮及凍干
將所收集的條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜，將離心后的條件培養(yǎng)基通過超濾的方式進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer透析膜濃縮2-20倍，得到濃縮液，將最終的濃縮液放置于容器中進(jìn)行最終凍干，制備成凍干粉。
[0020]實(shí)施例2檢測常氧及低氧環(huán)境對人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響 在培養(yǎng)過程中，將細(xì)胞分為三份。一份按照正常氧濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；一份應(yīng)用厭氧培
養(yǎng)罐(三菱，日本)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)；一份應(yīng)用厭氧培養(yǎng)罐(三菱，日本)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。厭氧培養(yǎng)罐中氧氣濃度為1%。
[0021]上述三份細(xì)胞分別收集細(xì)胞因子后進(jìn)行雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測樣本中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的濃度，并采用親和素-生物素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)進(jìn)行顯色，最后通過酶標(biāo)儀檢測不同樣本間VEGF含量。多次重復(fù)測量后低氧48小時(shí)VEGF濃度明顯高于24小時(shí)及常氧培養(yǎng)，低氧24小時(shí)也明顯高于常氧培養(yǎng)(圖2)。ELISA詳細(xì)步驟見《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。
[0022]Gremlinl是骨形態(tài)形成蛋白拮抗劑家族成員之一，具有促進(jìn)血管形成的作用。上述三份細(xì)胞分別收集細(xì)胞因子后測量Gremlinl的表達(dá)。采用免疫印跡(Western-blot)法進(jìn)行檢測，將蛋白樣品加入凝膠泳道后進(jìn)行電泳分離。隨后將含有蛋白樣品的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，并加入抗人Germlinl抗體(LifeSpan B1science)進(jìn)行結(jié)合后顯色。如圖3所示，Germlinl在缺氧48小時(shí)培養(yǎng)狀態(tài)下分泌數(shù)量最多，缺氧培養(yǎng)24小時(shí)分泌量要多余常氧狀態(tài)下培養(yǎng)(圖3)
結(jié)論:缺氧培養(yǎng)條件會(huì)影響人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，主要影響為增加了促血管形成細(xì)胞因子的分泌，如VEGF、Gremlinl等。
[0023]實(shí)施例3檢測永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在皮膚全層缺損模型中的治療作用
應(yīng)用Sprague Dawley大鼠制備皮膚全程缺損模型，即(圖4)中al,應(yīng)用制備好的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞因子和透明質(zhì)酸混合后敷于創(chuàng)口表面，并用敷貼防止膠狀液流失。對照組僅用透明質(zhì)酸敷于創(chuàng)面。術(shù)后14天照相觀察，從圖4可以看出，實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對照組。
[0024]結(jié)論:對照研究顯示永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞因子具有促進(jìn)傷口愈合恢復(fù)的作用。
[0025]實(shí)施例4檢測永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子對缺氧性中風(fēng)模型的治療作用
應(yīng)用Sprague Dawley大鼠制備中風(fēng)(MCAO)模型,大鼠麻醉后將鈍頭尼龍線延頸內(nèi)動(dòng)脈深入18mm，I小時(shí)后撤出尼龍線。模型制備成功后,大鼠腦缺血對側(cè)前肢蜷縮,行走偏向?qū)蒛。術(shù)后8小時(shí)，將10mg細(xì)胞因子稀釋至1ml生理鹽水中，進(jìn)行大鼠尾靜脈注射。48小時(shí)后，尾靜脈注射Br du (5-溴脫氧尿嘧啶核苷)，并取大鼠腦組織做抗Brdu免疫組織熒光染色。如圖5A、5B、5C所示，注射細(xì)胞因子后，大鼠腦內(nèi)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)量眾多，說明細(xì)胞因子的注射可以促進(jìn)腦內(nèi)細(xì)胞的增殖分裂，圖5C為5A和5B的重疊圖片，紅色熒光顯示增殖細(xì)胞位置。
[0026]結(jié)論:細(xì)胞因子可以促進(jìn)腦內(nèi)受損細(xì)胞的增殖。
[0027]實(shí)施例5制備含有永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的細(xì)胞因子注射液 將細(xì)胞因子混合入生理鹽水等液體中，濃度為100mg/10ml，通過介入、靜脈輸注等方法
將細(xì)胞因子液注射到損傷區(qū)域。可以抑制半損傷細(xì)胞的凋亡和新生細(xì)胞的增殖。
[0028]實(shí)施例6制備含有永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的細(xì)胞因子皮膚損傷修復(fù)液
將細(xì)胞因子混入透明質(zhì)酸中，濃度為100 μ g/10ml，將膠狀液直接敷于清潔創(chuàng)面，可以促進(jìn)表皮的細(xì)胞的生長，縮短恢復(fù)時(shí)間。隨著皮膚損傷逐漸的修復(fù)，可以降低細(xì)胞因子濃度，在創(chuàng)面未完全愈合前最低可用0.lng/10ml混合細(xì)胞因子的透明質(zhì)酸液進(jìn)行創(chuàng)面的修復(fù)。
[0029]實(shí)施例7將永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子與皮膚護(hù)理產(chǎn)品聯(lián)合使用 可以將永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子加入皮膚日常應(yīng)用的潤膚霜、面膜
中?？梢源龠M(jìn)面部損傷細(xì)胞的修復(fù)，如紫外線細(xì)胞損傷，也可以起到增加皮膚活性的作用。具體成分如下:
潤膚霜:三乙醇胺 0.2%
甘油3.5%丙二醇 2.5%
永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子0.002% 防腐劑、香精適量 加純水至100%。
[0030]其中每50ml潤膚霜含有細(xì)胞因子約lng。
[0031]剝離型面膜:聚乙烯比咯烷酮1.5%
聚醋酸乙烯酯4.0%
橄欖油2.0%
羊毛脂1.5%
山梨醇5.0%
十二烷基硫酸酷納鹽 0.2%
吐溫-200.8%
永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子 0.002% 香精、防腐劑適量 加純化水至100%.其中每20ml含細(xì)胞因子約0.1ngo
【權(quán)利要求】
1.永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子在制備修復(fù)組織皮膚全層缺損生物制劑和制備治療缺血缺氧性組織損傷生物制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的復(fù)合細(xì)胞因子為低氧培養(yǎng)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，所述的復(fù)合細(xì)胞因子不含有遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)， 所述的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下步驟制備而得: 1)將永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； 2)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞用無血清的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基進(jìn)行收集; 3)將條件培養(yǎng)基進(jìn)行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質(zhì)； 4)將離心后培養(yǎng)基(含>3.5kDa分子)進(jìn)行透析濃縮，得到濃縮液； 5)將濃縮液進(jìn)行凍干處理，得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，低氧培養(yǎng)的氧氣濃度為1%、5%或10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子通過以下方法制備而成: 1)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng):永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞為 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)； 2)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基的收集:在低氧下培養(yǎng)細(xì)胞至第 三代，融合率達(dá)到80-90%進(jìn)行細(xì)胞因子的收集，應(yīng)用無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，將無血清培養(yǎng)基進(jìn)行收集，檢測培養(yǎng)基中是否含有遺傳物質(zhì)，如有則應(yīng)用電泳方法去除； 3)永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基的離心純化 將所收集的條件培養(yǎng)基進(jìn)行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa 的分子濾膜； 4)濃縮 將離心后的條件培養(yǎng)基(含>3.5kDa分子)通過超濾的方式進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer透析膜濃縮2_20倍,得到濃縮液， 5)凍干 將濃縮液放置于容器中進(jìn)行最終凍干，得到凍干粉。
4.含有如權(quán)利要求1所述的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的修復(fù)材料，其特征在于，所述的修復(fù)材料包括永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子和透明質(zhì)酸或生理鹽水，每1ml修復(fù)材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的修復(fù)材料，其特征在于，所述的修復(fù)材料為膠狀修復(fù)材料、面膜修復(fù)材料或膏狀修復(fù)材料。
6.含有如權(quán)利要求1所述的永生化人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞因子的皮膚護(hù)理產(chǎn)品O
【文檔編號(hào)】A61P17/02GK104027358SQ201410273880
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】徐妍, 郭世磊, 周炳榮 申請人:徐妍