一種復(fù)合型血小板凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合型血小板凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 新近的研究發(fā)現(xiàn)，血小板除發(fā)揮凝血、止血等經(jīng)典的生理功能外，還儲備著人體合 成的大量重要細胞因子和生物活性物質(zhì)，特別是和組織再生、創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān)的活性物 質(zhì)、內(nèi)源性大麻素樣鎮(zhèn)痛物質(zhì)、以及廣譜抗菌肽（如天然防御素等）。當機體組織受損時，血 小板最早被迅速招募至創(chuàng)傷局部，活化后釋放出血小板儲備的平均高于外周血濃度4-5倍 的天然細胞因子（主要包括血小板源性生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子、胰島素樣生長 因子-1、堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子等）和生物活性物質(zhì)（主要包括5-羥 色胺、天然防御素、內(nèi)源性類大麻樣鎮(zhèn)痛物質(zhì)等）。通過招募白細胞，趨化干/祖細胞并促 進其分化增殖，以及促進局部血管新生、膠原合成，血小板在組織再生與創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著 極其重要的作用，因而日益受到關(guān)注，成為近年來創(chuàng)傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之 一。國內(nèi)外已有在臨床上應(yīng)用富血小板血衆(zhòng)（platelet-richplasma，PRP)治療骨缺損、 軟組織缺損、難治性糖尿病皮膚潰瘍等的多項研究報告，結(jié)果均證明：PRP能明顯促進患者 的創(chuàng)傷修復(fù)，且安全無毒、患者耐受性好、無不良反應(yīng)發(fā)生（l.KimDH，KimJY，SeoSH，et al.Recalcitrantcutaneousulcerofcomorbidpatienttreatedwithplateletrich plasma:acasereport.JKoreanMedSci2012 ；27:1604-1606. 2.GiovaniniAFjGonzaga CCjZielakJC，etal.Platelet-richplasma(PRP)impairsthecraniofacial bonerepairassociatedwithitselevatedTGF-0levelsandmodulatesthe co-expressionbetweencollagenIIIanda-smoothmuscleactin.JOrthoRes2011 ； 29(3):457-463. 3.李明，張長青，艾自勝等.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射富血小板血漿對膝關(guān)節(jié)軟骨退 行性變的治療作用。中國修復(fù)重建外科雜志.2011 ;25 (10) :1192-1196.)。本申請的發(fā)明人 在前期也開展了PRP促進血管生成、創(chuàng)面愈合、造血干細胞增殖、肝再生等一系列體內(nèi)、外 研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PRP確實具有促進組織再生、創(chuàng)面愈合、抑制疤痕形成等無可比擬的優(yōu)勢； 但是，也發(fā)現(xiàn)PRP在使用中存在如下嚴重缺陷，限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用：
[0003] I. PRP在應(yīng)用時，首先經(jīng)凝血酶和含鈣離子溶液進行活化，活化后的血小板釋放出 細胞因子發(fā)揮作用；但體外活化過程中，細胞因子釋放過快、迅速流失且難以控制，因而發(fā) 揮效應(yīng)時間過短，生物學(xué)效應(yīng)不能持久；
[0004] 2. PRP活化過程中，快速形成的纖維蛋白網(wǎng)彈性和穩(wěn)定性差、易收縮，不利于體內(nèi) 干/祖細胞的趨化和植入；
[0005] 3. PRP和常規(guī)使用的外科敷料結(jié)合差，造成大部分有效成分損失；
[0006] 4.臨床應(yīng)用時，將活化的PRP浸透外科敷料后直接敷于創(chuàng)面上；由于敷料不具有 保濕作用且與周圍組織結(jié)合緊密，因此換藥時往往引起難以忍受的劇痛和創(chuàng)面再次損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種促進組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)效果更好、 臨床應(yīng)用更方便的復(fù)合型血小板凝膠。
[0008] -種復(fù)合型血小板凝膠，由殼聚糖與富血小板血漿混合液被活化得到，其微觀結(jié) 構(gòu)為：富血小板血漿被活化得到的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連結(jié)于殼聚糖分子構(gòu)成凝膠載體支 架，血小板來源的細胞因子粘附、錨著于凝膠載體支架中，形成復(fù)合型血小板凝膠。
[0009] 所述的復(fù)合型血小板凝膠，活化過程為：先將殼聚糖與富血小板血漿凍融裂解液 混合，再加入活化劑靜置，將富血小板血漿中的纖維蛋白原活化成纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
[0010] 所述殼聚糖是北極深海蝦、蟹殼的天然提取物及其衍生物，選用適用于人體 的醫(yī)用級藥物輔料，殼聚糖在反應(yīng)體系中的終濃度為0. 5-8 % (質(zhì)量/體積濃度，單位 g/100ml)，凝膠為噴劑、膏劑或乳劑形式，其中膏劑或乳劑中殼聚糖濃度為6% -8%，噴劑 中殼聚糖濃度為0.5%。
[0011] 所述活化劑為氯化鈣_凝血酶混合液，殼聚糖與富血小板血漿混合液與氯化 鈣-凝血酶混合液體積比10:1-4:1。所述氯化鈣-凝血酶混合液中，氯化鈣濃度為 20-40mmol/mL，凝血酶濃度為400-1000U/mL，溶劑為無菌水。
[0012] 所述活化劑為葡萄糖酸鈣溶液，殼聚糖與富血小板血漿混合液與葡萄糖酸鈣溶液 體積比10:1。所述葡萄糖酸鈣溶液質(zhì)量/體積濃度為10% (g/l〇〇ml)，溶劑為無菌水。
[0013] 所述的復(fù)合型血小板凝膠，所述富血小板血漿來自用血細胞分離機直接采集的濃 縮血小板（機采血小板）、靜脈采集的全血（抗凝血）經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板濃縮 液（富衆(zhòng)法手工血小板）或商業(yè)富血小板血衆(zhòng)。
[0014]本發(fā)明還提供一種制備上述復(fù)合型血小板凝膠的方法，包括以下步驟：
[0015] 1)制備富血小板血漿凍融裂解液：_70°C凍存的富血小板血漿，使用前轉(zhuǎn)移至 37°C水浴凍融而得；
[0016] 2)制備凝膠：將殼聚糖按質(zhì)量/體積濃度0.5-8% (在反應(yīng)體系中的終濃度， g/100ml)比例加入富血小板血漿凍融裂解液，混合后再與氯化鈣-凝血酶混合液或葡萄糖 酸鈣溶液按體積比10:1-4:1的比例混合，室溫靜置5分鐘，得到復(fù)合型血小板凝膠。
[0017]本發(fā)明還提出上述復(fù)合型血小板凝膠在制備適用于軟/硬組織缺損、皮膚/粘膜 難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等修復(fù)治療的基質(zhì)膠中的應(yīng)用；其 中噴劑產(chǎn)物用于粘膜損傷和潰瘍修復(fù)。
[0018] 本發(fā)明提供了 一種新型復(fù)合型血小板凝膠。其制備方法是以具有良好的生物可 降解性和生物相容性的天然材料一殼聚糖作為生物支架與遞藥載體，富血小板血漿凍融裂 解液與殼聚糖混合后，即與氯化鈣-凝血酶混合液或葡萄糖酸鈣溶液按比例混合；富血小 板血漿中的纖維蛋白原經(jīng)活化交聯(lián)為纖維蛋白，纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連結(jié)于殼聚糖分子構(gòu)成 凝膠載體支架，血小板來源的細胞因子粘附、錨著于凝膠載體支架中，得到復(fù)合型血小板凝 膠。該凝膠具有保濕作用，并可實現(xiàn)血小板源性生長因子（主要包括血小板源性生長因子、 血管內(nèi)皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因 子等）及活性物質(zhì)（主要包括5-羥色胺、天然防御素、內(nèi)源性類大麻樣鎮(zhèn)痛物質(zhì)等）的緩 釋，發(fā)揮生物效應(yīng)持久。本發(fā)明的復(fù)合型血小板凝膠與目前常用的血小板相關(guān)制劑相比，不 僅具有更為快速促進組織再生與創(chuàng)傷修復(fù)、止血、抗菌、鎮(zhèn)痛等多重作用，而且具有制備簡 單、使用方便的特點，通過調(diào)整殼聚糖的用量還可以根據(jù)需要調(diào)整成膠時間和成膠強度，并 具有穩(wěn)定性、延展性好，不易收縮、保濕，細胞因子釋放可控的特點；另外，殼聚糖為CFDA批 準適用于人體的醫(yī)用級藥物輔料，與細胞和組織生物相容性好，因此本發(fā)明復(fù)合型血小板 凝膠還具有適宜體內(nèi)干細胞粘附定植、塑形性強、可注射、能降解等多重優(yōu)點。作為含天然 細胞因子的新型可注射性組織工程基質(zhì)膠，本發(fā)明復(fù)合型血小板凝膠可廣泛適用于軟/硬 組織缺損、皮膚/粘膜難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等疾病的治 療，具有重要的臨床應(yīng)用價值。
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠的外觀和形態(tài)
[0021] 圖2為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠的微觀結(jié)構(gòu)示意圖
[0022] 圖3為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠治療動物（裸鼠）皮膚全層潰瘍的試驗 結(jié)果
[0023] 圖4為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠促進血管新生的試驗結(jié)果
[0024] 圖5為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠促進間充質(zhì)干細胞向創(chuàng)面迀移的試驗 結(jié)果
[0025] 圖6為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠蛋白緩釋的試驗結(jié)果
[0026] 圖7為本發(fā)明可注射性復(fù)合型血小板凝膠細胞因子緩釋的試驗結(jié)果
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明針對PRP