專利名稱：異黃酮衍生物、其制備方法及其作為抗氧化劑的用途的制作方法
專利說明異黃酮衍生物、其制備方法及其作為抗氧化劑的用途 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及新型水溶性抗氧化劑，更具體涉及異黃酮衍生物，尤其是大豆甙元衍生物和染料木素衍生物、其制備方法及其作為抗氧化劑的用途。

背景技術(shù)：
隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到自由基與疾病(如炎癥、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、休克、中毒、腫瘤、突變、衰老等)密切相關(guān)，因而自由基的研究日益受到人們的重視。在生物體正常的代謝過程中，氧化還原反應(yīng)是最常見的反應(yīng)，氧是生物體內(nèi)的受電子體，在反應(yīng)過程中，由于其獲得的電子數(shù)的不同，可以產(chǎn)生不同的自由基，根據(jù)氧化性及其程度的不同，一般將自由基分為氧自由基和脂質(zhì)自由基兩類。其中氧自由基是與人體關(guān)系最為密切的自由基，它是活性氧衍生物，主要包括超氧陰離子自由基(O2-·)羥基自由基(·OH)，其中以O(shè)2-·形成最早，·OH作用最強(qiáng)，本發(fā)明中涉及的自由基為這兩種自由基。超氧陰離子自由基O2-·是生物體內(nèi)一類重要的活性氧自由基，它對生物分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、色素等)的損傷是廣泛和多層次的，大量的研究表明，O2-·可以使糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類發(fā)生氧化，與機(jī)體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生(如吞噬、解毒、炎癥、衰老、腫瘤、輻射損傷等)有著密切的關(guān)系。此外它還可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其它自由基，從而引發(fā)一系列疾病。但在動物生命的氧化代謝中總會不斷產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-·)，細(xì)胞中的一些膜性結(jié)構(gòu)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物體、細(xì)胞膜等都包含氧化酶系、電子傳遞酶系或過氧化氫酶系。這些酶系在催化其相應(yīng)的底物過程中以不同形式釋放出自由基，此外空氣中紫外線、X射線照射、高溫以及空氣中煙塵污染也能促使人體中產(chǎn)生O2-·自由基。O2-·自由基還能誘發(fā)諸如冠心病、動脈硬化、腫瘤等多種疾病?！H帶有一個不成對電子，性質(zhì)極活潑，其反應(yīng)性和毒性都很強(qiáng)，對生物體的損害也最大，它是造成組織細(xì)胞損傷的重要活性氧之一，氧化能力很強(qiáng)，可以發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，參與奪氫反應(yīng)和羥基化等反應(yīng)，它可以引起膜過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、核酸損傷等，氧化糖類、氨基酸和脂類而使它們遭受損傷和破壞，另外羥基自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬有關(guān)，是公認(rèn)的毒性最大的自由基之一。這些氧自由基可以攻擊生物大分子，使其交鏈或斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞。因此，它們是人類衰老和許多疾病如癌癥、多發(fā)性硬化癥、帕金森疾病、自身免疫疾病、局部缺血、貧血癥、老年癡呆病和慢性肺炎等的重要誘因。所以，尋找能夠有效清除自由基而無毒副作用的物質(zhì)一直是學(xué)者們研究的課題之一。
目前已有的可以用作抗氧化劑的藥物主要是一些天然產(chǎn)物如丹參、當(dāng)歸的提取物，但是由于其提取十分麻煩，而且由于其分子結(jié)構(gòu)的限制，水溶性和脂溶性都很差，導(dǎo)致在臨床應(yīng)用中存在一些弊端，如生物利用度不高，服用量大，制成的片劑或膠囊在體內(nèi)吸收緩慢，7～14天才能見到有限的效果，因此尋找水溶性好、抗氧化能力強(qiáng)和生物利用度高的抗氧化劑具有重大的現(xiàn)實意義。
發(fā)明概述 本發(fā)明的一般目的是提供新型水溶性抗氧化劑，其抗氧化能力強(qiáng)且生物利用度高。
本發(fā)明的更具體的目的是提供水溶性良好的異黃酮衍生物，其抗氧化能力強(qiáng)且生物利用度高，因此適合用作抗氧化劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述異黃酮衍生物的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供上述異黃酮衍生物作為抗氧化劑的用途。
本發(fā)明的這些和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)在閱讀完本說明書之后將變得更加明了。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的異黃酮衍生物由如下通式表示
其中X為氫或羥基，且M為堿金屬或堿土金屬離子，優(yōu)選鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子等。
更具體地說，當(dāng)上述通式中的X為氫時，本發(fā)明的異黃酮衍生物為3’-磺酸基-大豆甙元金屬鹽且對應(yīng)于下式
其中M如上所定義。
當(dāng)上述通式中的X為羥基時，本發(fā)明的異黃酮衍生物為3’-磺酸基-染料木素金屬鹽且對應(yīng)于下式
其中M如上所定義。
本發(fā)明的新型抗氧化劑的制備方法包括將通式(I’)磺化并使用堿金屬或堿土金屬化合物成鹽，由此引入磺酸鹽基，得到水溶性較好的抗氧化劑
其中X為氫或羥基。
更具體地說，當(dāng)上述通式(I’)中的X為氫時，反應(yīng)如下
其中M如上所定義。
當(dāng)上述通式中的X為羥基時，反應(yīng)如下
其中M如上所定義。
具體而言，3’-磺酸基-大豆甙元金屬鹽(L3)和3’-磺酸基-染料木素金屬鹽(L4)的制備可以按如下方式進(jìn)行分別使大豆甙元(L1)或染料木素(L2)與濃硫酸反應(yīng)并加入堿金屬或堿土金屬化合物使磺基成鹽，由此得到L3或L4。在所述磺化反應(yīng)中，濃硫酸的用量范圍基于每克L1或L2為2-10ml。在所述成鹽步驟中堿金屬或堿土金屬化合物的實例為堿金屬或堿土金屬的鹵化物，尤其是氯化物，碳酸鹽，硝酸鹽，硫酸鹽，碳酸氫鹽等等，其加入量應(yīng)使整個體系析出沉淀。
本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在大豆甙元(L1)和染料木素(L2)的基礎(chǔ)上引入磺酸基，提供了兩種水溶性的可以有效清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的結(jié)構(gòu)L3和L4。本發(fā)明對上述化合物進(jìn)行了一系列有關(guān)與清除超氧陰離子自由基(O2-·)和羥基自由基(·OH)的實驗，實驗結(jié)果表明它們具有較強(qiáng)的抗氧化作用。另外，它們的水溶性好，克服了以前的抗氧化劑水溶性差的缺點(diǎn)。與現(xiàn)有的抗氧化劑黃芩甙相比較，具有顯著提高清除這些氧自由基的特點(diǎn)。L3和L4在清除羥基自由基方面，其活性依照相應(yīng)的EC50計算，對比黃芩甙，分別提高了40倍和68倍。在清除超氧陰離子自由基方面，分別提高了20倍和133倍。
下面通過實施例來對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，應(yīng)當(dāng)指出的是這些實施例僅用于對本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，不應(yīng)該理解為對本發(fā)明的限制。
實施例1 抗氧化劑L3的合成 取2.52g(0.01mol)L1(供應(yīng)商為陜西賽德高科生物股份有限公司)投入到10mL濃硫酸中，室溫攪拌30分鐘，固體逐漸溶解，溶液變成深黃色。取少量反應(yīng)液滴于水中，無不溶物出現(xiàn)，說明反應(yīng)已完全。將此反應(yīng)物緩慢小心傾倒入40mL冰水中，攪拌。然后在濾液中加入固體NaCl，劇烈攪拌，直到加入的NaCl不再溶解。靜置，生成白色絮狀沉淀，過濾，飽和食鹽水洗滌。用5％NaCl水溶液重結(jié)晶，得白色針狀晶體大豆甙元-3’-磺酸鈉鹽2.6g，產(chǎn)率75％。m.p.349℃，IR(KBr，ν，cm-1)3441.4(-OH)，1635(-CO-)，1193(-SO3)；1H NMR(D2O，500MHz，δ，ppm)6.59(s，1H，HC-6)，6.64(s，1H，HC-8)，6.69或6.81(d，1H，HC-5’或6’)，7.15(d，1H，HC-5)，7.62(s，HC-2)，7.83(s，1H，HC-2’)；C15 H9O7SNa的元素分析(％)，計算值C，50.56；H，2.53；實測值C，50.58；H，2.54。
實施例2 抗氧化劑L4的合成 取2.69g(10mmol)L2(供應(yīng)商為陜西賽德高科生物股份有限公司)投入到10mL濃硫酸中，室溫攪拌30分鐘，固體逐漸溶解，溶液變成深黃色。取少量反應(yīng)液滴于水中，無不溶物出現(xiàn)，說明反應(yīng)已完全。將此反應(yīng)物緩慢小心傾倒入40mL冰水中，攪拌。然后在濾液中加入固體NaCl，劇烈攪拌，直到加入的NaCl不再溶解。靜置，生成白色絮狀沉淀，過濾，飽和食鹽水洗滌。用5％NaCl水溶液重結(jié)晶，得白色針狀晶體(L4)2.8g(產(chǎn)率78％)。m.p.＞260℃(分解)，IR(KBr，ν，cm-1)3441.4(-OH)，1642.5(-CO-)；1H NMR(D2O，500MHz，δ，ppm)5.89或5.91(s，1H，HC-6或HC-8)，6.90或7.02(d，1H，HC-5’或HC-6’)，7.59(s，1H，HC-2)，7.69(s，1H，HC-2’)；C15H9O8SNa的元素分析(％)，計算值C，48.39；H，2.42；實測值C，48.37；H，2.39。
實施例3 L3和L4對羥基自由基的清除 一、熒光光譜法 通用程序 在5ml比色管中，加入0.1ml 20mM的H2O2溶液、0.1ml 2mM的對苯二甲酸(TA)溶液以及一定體積的0.3mM的樣品溶液，定容至5ml，迅速放置于紫外燈下，以254nm紫外光照射20分鐘，準(zhǔn)確計時，迅速測定溶液的熒光強(qiáng)度。
熒光條件激發(fā)波長(Ex)312nm，發(fā)射波長(Em)427nm，高靈敏度；狹縫EX＝5nm，EM＝5nm。
原理 H2O2在紫外光照射下會發(fā)生分解反應(yīng)，生成羥基自由基(·OH)，它容易進(jìn)攻芳環(huán)化合物一對苯二甲酸(TA)，生成具有熒光的羥基-對苯二甲酸(反應(yīng)1)，而在實驗條件下，TA的熒光很弱，基本可以忽略。因此，通過監(jiān)測產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度就可以確定體系中·OH的相對含量。當(dāng)體系中有樣品存在時，H2O2產(chǎn)生的部分·OH與樣品反應(yīng)，生成無熒光物質(zhì)(反應(yīng)2)。
這樣，·OH與對苯二甲酸反應(yīng)產(chǎn)物減少，通過測定加入樣品后溶液熒光強(qiáng)度的變化，便能間接反映出樣品對·OH自由基的清除能力。樣品對·OH的清除率(％)可以按如下方程計算
其中F0、F分別代表體系中未加入樣品和加入樣品時反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果 通過使用不同濃度的各個樣品進(jìn)行對羥基自由基的清除試驗，結(jié)果如表1所示 表1 L3和L4的濃度與羥基自由基的清除率關(guān)系 通過將F0/F對[樣品]/[TA]作圖，可得到樣品L3和L4的直線斜率，并由此求得它們與羥基自由基反應(yīng)的速率常數(shù)分別為1.3×1012L·mol-1·s-1(L3)和1.8×1012L·mol-1s-1(L4)，半數(shù)有效清除濃度EC50分別為0.0031mmol.L-1(L3)和0.0019mmol.L-1(L4)。
在相同實驗條件下對天然產(chǎn)物baicalin(黃芩甙，購自陜西賽德高科生物股份有限公司)進(jìn)行測試，結(jié)果求得baicalin與羥基自由基反應(yīng)的速率常數(shù)為2.3×109L·mol-1·s-1，半數(shù)有效清除濃度EC50為0.13mmol.L-1。
由此可見，本發(fā)明化合物L(fēng)3和L4對羥基自由基的清除效果都明顯好于天然產(chǎn)物baicalin。
二、單掃示波極譜法 原理和通用程序 用自旋捕集劑PBN捕捉Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基·OH，生成的PBN自旋加合物可利用單掃示波極譜法檢測。在pH7.4的PBS緩沖底液中，加合物給出一個靈敏的二階導(dǎo)數(shù)還原波，峰電位在-0.52V(vs.SCE)。測定反應(yīng)時間為4分鐘時的峰高。反應(yīng)混合溶液的終體積為10mL，各反應(yīng)物的終濃度分別為Fe2+(1×10-4mol/L)，EDTA(1×10-4mol/L)，Vc(抗壞血酸)(2.0×10-4mol/L)，PBN(1.65×10-4mol/L)，H2O2(0.03％)。對羥基自由基產(chǎn)生的抑制率可根據(jù)下面公式計算
在上式中A空白為沒有加樣品時二階導(dǎo)數(shù)極譜波的峰高，A樣品為加了樣品時二階導(dǎo)數(shù)極譜波的峰高。
為了便于比較，同時給出單掃示波極譜法測得具有抗氧化作用的天然產(chǎn)物紅景天甙對羥基自由基的清除率。
結(jié)果 通過使用不同濃度的各個樣品進(jìn)行對羥基自由基的清除試驗，結(jié)果如表2所示 表2 L3、L4和紅景天甙的濃度與羥基自由基的清除率關(guān)系 L3、L4和紅景天甙的半數(shù)有效清除濃度分別為0.09g.L-1、0.06g.L-1和0.10g.L-1。由此可見L3和L4對羥基自由基的清除效果都明顯好于天然產(chǎn)物紅景天甙。
另外，由表1和表2還可以看出L4對羥基自由基的清除效果好于L3。
實施例4 L3和L4對超氧陰離子自由基的清除 一、紫外分光光度法 通用程序 測試波長為319nm，反應(yīng)總體積為10mL。取pH＝8.2，0.05M Tris-HCl緩沖液4.5mL，與適量蒸餾水混勻后置于25℃水浴中保溫10分鐘，再依次加入1、2、3、4mL的樣品(L3，L4)溶液，最后加入3mM鄰苯三酚溶液0.3mL，然后用蒸餾水定容至10mL，混勻后在25℃繼續(xù)保溫4分鐘，嚴(yán)格控制時間，立即在319nm處測定吸光度A值。由于L3，L4本身在319nm處都有吸收，因而測定混合體系的吸光度時分別以對應(yīng)濃度的供試樣品溶液為參照溶液，空白組以去離子水代替供試品溶液，并按下式計算清除率(E％)
結(jié)果 通過使用不同濃度的各個樣品進(jìn)行對超氧陰離子自由基的清除試驗，結(jié)果如下表3所示 表3 L3和L4的濃度與超氧陰離子自由基的清除率關(guān)系 表4 baicalin的濃度與超氧陰離子自由基的清除率關(guān)系 由此可見，2個實驗樣品對O2-·有不同程度的清除作用，并呈明顯的量效關(guān)系，L3、L4和baicalin對超氧陰離子自由基的半數(shù)有效清除濃度分別為0.0071mmol.L-1，0.0011mmol.L-1和0.148mmol.L-1。
由此可見，L3、L4對超氧陰離子自由基的清除效果都明顯好于天然產(chǎn)物baicalin。
二、單掃示波極譜法 原理和通用程序 超氧陰離子自由基(O2-·)可通過鄰苯三酚在pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液中自氧化產(chǎn)生。分別加入適量的樣品溶液，以單掃示波極譜法檢測-0.96V處的二階導(dǎo)數(shù)還原波隨時間的變化情況。掃描電位-0.3～1.2V。反應(yīng)混合液總體積為10mL，鄰苯三酚的終濃度為1×10-4mol/L。按下式計算清除率(E％)
其中A空白為沒有加樣品時二階導(dǎo)數(shù)極譜波的峰高，A樣品為加了樣品時二階導(dǎo)數(shù)極譜波的峰高。
為了便于比較，同時給出單掃示波極譜法測得具有抗氧化作用的天然產(chǎn)物紅景天甙對超氧陰離子自由基的清除率。
結(jié)果 通過使用不同濃度的各個樣品進(jìn)行對超氧陰離子自由基的清除試驗，結(jié)果如下表所示 表5 L3、L4和紅景天甙的濃度與超氧陰離子自由基的清除率關(guān)系 L3、L4和紅景天甙的半數(shù)有效清除濃度分別為0.10g.L-1、0.08g.L-1和0.15g.L-1。由此可見，L3和L4對超氧陰離子自由基的清除效果都明顯好于天然產(chǎn)物紅景天甙。另外，由表5還可以看出L4對超氧陰離子自由基的清除效果好于L3。
權(quán)利要求
1.如下通式的異黃酮衍生物
其中X為氫或羥基，且M為堿金屬或堿土金屬離子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的異黃酮衍生物，其中X為氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的異黃酮衍生物，其中X為羥基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的異黃酮衍生物，其中M為鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子等。
5.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的異黃酮衍生物的方法，包括使用濃硫酸將通式(I’)的化合物磺化
其中X為氫或羥基，
然后使用堿金屬或堿土金屬化合物使磺基成鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中濃硫酸的用量范圍基于每克通式(I’)化合物為2-10ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中在所述成鹽步驟中堿金屬或堿土金屬化合物的實例為堿金屬或堿土金屬的鹵化物，尤其是氯化物，碳酸鹽，硝酸鹽，硫酸鹽，碳酸氫鹽等等，其加入量應(yīng)使整個體系析出沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的異黃酮衍生物作為抗氧化劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型水溶性抗氧化劑，更具體涉及異黃酮衍生物、其制備方法及其作為抗氧化劑的用途。本發(fā)明的新型水溶性抗氧化劑通過大豆甙元或染料木素的磺化和成鹽而制備。本發(fā)明的新型水溶性抗氧化劑可以較好地清除羥基自由基和超氧陰離子自由基。
文檔編號A61P39/06GK1982305SQ200510130118
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月12日
發(fā)明者延璽, 劉蕓, 馬雨偉, 司書峰 申請人:北京師范大學(xué)