一種以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥為基礎(chǔ)的具抗炎作用的腺病毒載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制血管內(nèi)皮炎癥的基因治療方法。所述基因治療方法為表達(dá)表達(dá)持續(xù)激活型核受體轉(zhuǎn)錄因子PXR(VP-PXR)的腺病毒，將此腺病毒與輔助病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，可明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可以作為新的動脈粥樣硬化的防治工具。
【專利說明】一種以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥為基礎(chǔ)的具抗炎作用的腺病毒載體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及構(gòu)建一種具有抑制炎癥作用的表達(dá)持續(xù)激活型孕烷X受體(PXR/SXR)的可調(diào)控性腺病毒載體。
【背景技術(shù)】
[0002]基因治療(gene therapy)是利用分子生物學(xué)方法將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，使之表達(dá)目的基因產(chǎn)物，作為疾病治療的一種新手段，正受到越來越多的關(guān)注。1990年美國官方批準(zhǔn)首例用基因方法治療由ADA (Adenosine Deaninase)基因缺失引起的重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，1992年Grossman等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將低密度脂蛋白受體(LDL-R)基因?qū)敫渭?xì)胞成功治療了一例家族性高膽固醇血癥，開始了基因治療在心血管疾病治療中的研究。但迄今為止，美國食品藥物監(jiān)督局還沒有通過認(rèn)可任何用于人類基因治療的產(chǎn)品，目前的基因治療研究還都集中在實驗研究和臨床實驗階段。在基因治療面臨的主要問題是如何有效的導(dǎo)入外源基因和降低載體本身引起的免疫反應(yīng)。
[0003]常用的基因?qū)胼d體主要分為非病毒載體和病毒載體兩類。其中腺病毒載體具有包裝容量大、宿主范圍廣、感染效率高同時不整合入宿主的基因組因而不會破壞宿主的基因等特點，是在基因治療中最常用的病毒載體。但其外源基因表達(dá)時間短、免疫源性較強。近年來有很多研究集中于改造腺病毒載體，研究發(fā)現(xiàn)將腺病毒載體的基因組僅保留600bp左右，即只保留復(fù)制起始位點和包裝信號仍然可以作為載體表達(dá)外源基因，這樣改造后的腺病毒免疫原性也有一定程度的降低1O
[0004]動脈粥樣硬化及其所致冠心病、中風(fēng)在我國及西方均已成為致死、致殘的首要原因。根據(jù)Ross提出的“損傷-應(yīng)答`”(ReSp0nSe-t0-1njUry)學(xué)說2，動脈粥樣硬化的發(fā)生是血管壁對循環(huán)中損傷因子傷害因子的反應(yīng)及與血管局部血流動力學(xué)因素相互作用的結(jié)果。損傷因子造成血管內(nèi)皮損傷及功能紊亂，炎性單核巨噬細(xì)胞募集、內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、修飾，由平滑肌及浸潤的巨噬細(xì)胞吞噬，最終導(dǎo)致粥樣斑塊的形成。流行病學(xué)和臨床研究表明血漿低密度脂蛋白水平升高、高血糖、高同型半胱氨酸、吸煙、缺乏運動等是動脈粥樣硬化的獨立危險因子，毒品和感染因子可能也參與動脈粥樣硬化的發(fā)生及其進展。
[0005]血管的正常功能是依靠血管內(nèi)皮細(xì)胞來保護的。但在高血糖、血脂紊亂、高血壓、肥胖等因素的刺激下，通過啟動過強的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過量的自由基和炎癥因子，可使血管內(nèi)皮功能受到損傷3。血管內(nèi)皮細(xì)胞是氧化應(yīng)激和高血糖的重要作用靶點，內(nèi)皮細(xì)胞激活是動脈粥樣硬化的始動因素和早期階段。人們逐漸認(rèn)識到炎癥在動脈粥樣硬化中的作用，在人和實驗性早期粥樣斑塊中發(fā)現(xiàn)了大量的白細(xì)胞，單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。正常內(nèi)皮細(xì)胞并不結(jié)合白細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞激活后ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等粘附因子及TNF-α、IL-8、IL-6等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)。開發(fā)更為特異的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥作用的藥物是防治動脈粥樣硬化中的新策略。
[0006]孕燒X受體(Pregnane X Receptor, PXR),是核受體超家族的成員之一,是一類配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，以內(nèi)源性配體孕烷命名。PXR的主要生物學(xué)作用是解毒。最近有研究報道，PXR的激活可以抑制肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng)4，也可以在動物體內(nèi)抑制葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性腸炎5。而PXR的激活在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的表達(dá)持續(xù)激活型PXR(VP-PXR)的腺病毒用于基因治療。
[0008]本發(fā)明所提供的腺病毒全稱為四環(huán)素調(diào)控腺病毒表達(dá)持續(xù)激活型PXR(tet-offadenovirus expressing VP-PXR)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為Ad VP-PXR感染原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抑制TNF- α誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。
[0010]A為Ad VP-PXR在原代內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。
[0011]B為單核細(xì)胞黏附實驗。
[0012]C為感染Ad VP-PXR后血管內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子mRNA水平的變化。
[0013]D為感染Ad VP- PXR后血管內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子蛋白水平的變化。
[0014]E，F(xiàn)為流式細(xì)胞分析感染Ad VP-PXR后血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子VCAM-1和E-seIectin的蛋白表達(dá)水平變化。
[0015]圖2為Ad VP-PXR抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)皮粘附分子表達(dá)增高。
[0016]A為免疫熒光染色鑒定Ad VP-PXR在大鼠血管內(nèi)皮中的表達(dá)。
[0017]B，C為Ad VP-PXR抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)皮粘附分子VCAM-1和E-selectin表達(dá)增高。
【具體實施方式】
[0018]圖1為Ad VP-PXR感染原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抑制TNF- α誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。
[0019]將Ad VP-PXR, Ad tTA(輔助病毒)感染至原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞，對照組同時再加入四環(huán)素(0.1μ g/ml)，24小時后提取細(xì)胞總蛋白，利用抗PXR的特異抗體(Santa Cruz, sc-48403)進行 Western blot 檢測 PXR 蛋白水平。結(jié)果表明 Ad VP-PXR 能夠誘導(dǎo)PXR在平滑肌細(xì)胞中的過表達(dá)，并且此表達(dá)受四環(huán)素調(diào)控(Tet-off)。
[0020]用VP-PXR感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時，然后使用腫瘤壞死因子a (TNF a ) 2ng/mL刺激2小時或24小時，使用Realtime PCR，Western blot以及流式細(xì)胞技術(shù)的方法檢測粘附分子VCAM-1和E-selectin的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)TNF-α很強地誘導(dǎo)VCAM-1和E_selectinmRNA的表達(dá)，而VP-PXR可以抑制TNF- a誘導(dǎo)的粘附分子的表達(dá)。
[0021]圖2為Ad VP-PXR抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)皮粘附分子表達(dá)增高。
[0022]體重400g雄性Sprague-Dawley大鼠，腹腔注射0.6%戍巴比妥鈉麻醉(注射劑量為25mg/kg)，正中切開大鼠頸部皮膚，鈍性分離肌肉層，并分離頸外動脈、頸內(nèi)動脈和頸總動脈。結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，用動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈上剪口。將球囊從該切口處插入頸總動脈。注入80 μ I病毒稀釋液(IO8Pfu),處理組為AdVP-PXR和Ad tTA,對照組為Ad LacZ和Ad tTA,孵育15min后吸出病毒液，結(jié)扎血管切口，并打開頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈的動脈夾恢復(fù)血流。腺病毒感染后24小時后，腹腔注射2mg/kg內(nèi)毒素(LPS)，24小時后取材，用針對VP-16標(biāo)簽的抗體做免疫熒光染色，確定基因過表達(dá)。用針對VCAM-1和E-selectin抗體做Enface染色，發(fā)現(xiàn)Ad VP-PXR可以顯著抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的VCAM-1和E-selectin在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。[0023]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.一種基因治療方法，所述基因治療方法為表達(dá)持續(xù)激活型核受體轉(zhuǎn)錄因子PXR (VP-PXR)的腺病毒用于抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥為基礎(chǔ)的所有炎癥性疾病。
2.編碼權(quán)利要求1所述的 分子的其他表達(dá)載體。
【文檔編號】A61P29/00GK103446591SQ201210174833
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】汪南平, 王曉虹, 趙蓓蕾 申請人:北京大學(xué)