微粒及內(nèi)皮細胞和脫細胞化的器官和組織的用圖
【專利說明】微粒及內(nèi)皮細胞和脫細胞化的器官和組織的用途
[0001] 巧關(guān)申請的香叉引用
[0002] 本申請要求于2013年3月15日提交的美國申請序列號61/790, 118的權(quán)益，將其 公開內(nèi)容W引用的方式并入本文。
[0003] 發(fā)巧背景
[0004] 組織工程是通過植入細胞、支架W及可溶性介質(zhì)的組合來尋求修復或再生損傷或 病變的組織和器官的快速發(fā)展的領(lǐng)域。通常在2維（2D)培養(yǎng)條件下實現(xiàn)當前干細胞分化 和原代細胞培養(yǎng)。該系統(tǒng)允許特定細胞群的擴增，但是其維持功能性細胞表型W維持高密 度的細胞培養(yǎng)W及長期原代或分化的細胞功能的能力有限制。例如，相比某些細胞療法所 需的大量原代細胞的有限可獲得性，在保留分化為特定譜系的能力的同時，干細胞的數(shù)量 可W大量擴增。對于干細胞命運的控制（例如分化），不管是在體內(nèi)還是在體外，主要都歸 因于基因和分子介質(zhì)（例如生長因子和轉(zhuǎn)錄因子）。盡管干細胞和祖細胞的分化可導致細 胞具有合適的譜系特異的基因表達或組織特異的基因表達，但是分化的細胞可能缺乏體外 或體內(nèi)應用所需的功能特性。
[000引發(fā)巧概沐
[0006]本發(fā)明提供在具有完整血管床的哺乳動物器官、組織或其部分的再內(nèi)皮化和/或 再細胞化（用除內(nèi)皮細胞外的細胞）的細胞外基質(zhì)中，維持毛細血管腔直徑、降低毛細血 管腔直徑的減小或增大毛細血管腔直徑的方法，例如確保移植后合適的毛細血管直徑W維 持連續(xù)的血液流動。該方法包括提供或制備具有完整血管床的哺乳動物器官、組織或其部 分的脫細胞化的細胞外基質(zhì)，W及提供或制備內(nèi)皮細胞群體或能夠分化成內(nèi)皮細胞的干細 胞群體或祖細胞群體。向脫細胞化的細胞外基質(zhì)中同時引入或順序引入一定量的細胞和一 定量的含有生物相容性納米顆?；蛭⒘５牡谝凰匀芤?。細胞的量能有效地將脫細胞化的 細胞外基質(zhì)的脈管系統(tǒng)的再內(nèi)皮化，并且在再內(nèi)皮化期間或在其之后，相對于相應的缺少 納米顆粒或微粒的再內(nèi)皮化脫細胞化的細胞外基質(zhì)，當通過脈管系統(tǒng)循環(huán)時，，納米顆?；?微粒的量維持脈管系統(tǒng)的毛細血管腔直徑，或降低脈管系統(tǒng)的毛細血管腔直徑減少，例如 降低至約4微米，或增加脈管系統(tǒng)的毛細血管腔直徑，例如高達約15至約20微米。在一個 實施方案中，納米顆?；蛭⒘Ｊ巧锟山到獾?。在一個實施方案中，在加入添加劑（added agent)或能量源之后，納米顆?；蛭⒘Ｊ强煽焖偕锝到獾摹Ｔ谝粋€實施方案中，納米顆 ?；蛭⒘２皇巧锟山到獾?。納米顆粒可由任何生物相容性材料形成，并且可W是允許其 通過脈管系統(tǒng)的任何形狀。在一個實施方案中，納米顆?；蛭⒘５男螤钍乔蛐蔚幕蜷獔A形 的。在一個實施方案中，納米顆?；蛭⒘５钠骄睆绞羌s0. 5ym至約30ym或約5ym至 約20ym。在一個實施方案中，納米顆粒或微粒是可變形的。在一個實施方案中，納米顆粒 或微粒由聚合物形成，所述聚合物包括天然存在的和合成的（非天然存在的）聚合物。在 一個實施方案中，納米顆?；蛭⒘Ｓ傻鞍缀头堑鞍拙酆衔镄纬?。在一個實施方案中，對納米 顆粒或微粒進行修飾，W使其包含簇化物、醋、胺、醒、醇或面化物W及功能分子，如磁性分 子的配體。在一個實施方案中，添加外部能量源，例如，但不限于：降解顆粒的光、磁、機械力 或超聲。在一個實施方案中，在再內(nèi)皮化之后添加水性溶液。在一個實施方案中，通過用另 一溶液洗涂再內(nèi)皮化的脈管系統(tǒng)來移除納米顆?；蛭⒘?，所述溶液不含所述顆粒，并且可 含有降解顆粒的物質(zhì)。在一個實施方案中，所述方法包括引入含有生物相容性納米顆?；?微粒的第二水性溶液，所述納米顆?；蛭⒘５钠骄睆奖鹊谝蝗芤褐械募{米顆?；蛭⒘５?平均直徑大至少10%。顆粒的濃度可W發(fā)生變化，并且可W是實現(xiàn)目的的任何量。例如，每 yL的第一溶液可包含約300至約50, 000, 000個顆粒。
[0007] 脫細胞化的細胞外基質(zhì)可來自任何器官或組織，只要所述器官和組織具有允許溶 液循環(huán)進入其血管導管并循環(huán)流出其血管導管的完整的血管（毛細血管）床（"完整的" 脈管系統(tǒng)）。在一個實施方案中，脫細胞化的器官為脫細胞化的屯、臟、膜腺、肝臟、腎臟、骨或 肺。可使用能夠?qū)⒕哂型暾}管系統(tǒng)的脫細胞化的器官、組織或其部分的細胞外基質(zhì)脈管 系統(tǒng)再內(nèi)皮化的任何細胞類型。例如，所述細胞可W是從iPS細胞獲得的。在一個實施方 案中，通過注射或灌注或它們的組合將細胞引入基質(zhì)。在一個實施方案中，通過注射或灌注 或它們的組合將細胞引入脈管系統(tǒng)。在一個實施方案中，向脫細胞化的細胞外基質(zhì)中引入 的細胞是原代細胞。在一個實施方案中，向脫細胞化的細胞外基質(zhì)中引入的細胞是意圖將 器官、組織或其部分完全或部分再細胞化的多種不同的細胞類型。在一個實施方案中，向脫 細胞化的細胞外基質(zhì)中引入的細胞是人胚胎干細胞。在一個實施方案中，細胞與灌注的脫 細胞化的器官、組織或其部分是同種異體的。在一個實施方案中，細胞與灌注的脫細胞化的 器官、組織或其部分是異種的。
[0008] 附圖簡要說巧
[0009] 圖IA顯示了灌注脫細胞化的豬肝臟的照片。
[0010] 圖IB-C分別顯示了灌注脫細胞化的豬肝臟的血管和實質(zhì)基質(zhì)的掃描電子顯微鏡 (SEM)照片。
[0011] 圖2提供了浸入脫細胞化的大鼠肝臟的總視圖，其中在低放大倍數(shù)（左）和高放 大倍數(shù)（右）下均可觀測到基質(zhì)磨損。
[001引圖3顯示了浸入脫細胞化的大鼠肝臟的沈M照片（A和B)W及灌注脫細胞化的大 鼠肝臟的沈M照片（C和D)。
[0013] 圖4提供了浸入脫細胞化的肝臟的組織結(jié)構(gòu)（A，H&E染色；B，=色染色）和灌注脫 細胞化的肝臟的組織結(jié)構(gòu)（C，H&E染色；D，=色染色）。
[0014] 圖5顯示了大鼠屯、臟的浸入脫細胞化（頂行）與灌注脫細胞化（底行）的比較。
[0015] 圖6顯示了利用大鼠腎臟的浸入脫細胞化（頂行）與灌注脫細胞化（底行）的比 較。
[001引圖7顯示了脫細胞化的腎臟的沈M照片。
[0017] 圖8A顯示了灌注脫細胞化的屯、臟的沈M照化同時圖8B顯示了浸入脫細胞化的 屯、臟的沈M照片。
[001引發(fā)巧詳沐
[0019] 本發(fā)明提供工程化的細胞和ECM，其通過物理W及分子相互作用，經(jīng)由控制那些細 胞的環(huán)境而直接控制細胞行為。特別地，本發(fā)明提供工程化的具有灌注脫細胞化的ECM的 器官、組織或生物反應器，所述灌注脫細胞化的ECM移植有包含細胞組合的細胞群體，并經(jīng) 歷了例如包括灌注可溶性介質(zhì)的培養(yǎng)條件，該ECM結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)條件產(chǎn)生與相應的原始器官 基本相同的功能細胞和毛細血管腔直徑，例如約5ym至約10ym或約3ym至約20ym。特 別地，由于維持了毛細血管腔直徑，本發(fā)明可W為成人細胞和胚細胞W及部分分化的祖細 胞的細胞分化、生長和表型表達提供改善的調(diào)節(jié)，W及為分化的細胞類型提供改善的維持。 還包括原代細胞的生長和功能維持，所述原代細胞包括胎兒來源的細胞，例如從胎兒細胞 或新生兒細胞中獲得的器官特異的細胞（例如定型至特定譜系但未終末分化的細胞）。
[0020] 本發(fā)明提供灌注脫細胞化的器官或組織來源的細胞外基質(zhì)巧CM)的用途W(wǎng)及在 運些基質(zhì)的細胞外基質(zhì)脈管系統(tǒng)中可用于支持W下的系統(tǒng)：具有血管（例如內(nèi)皮的）細胞 的運些基質(zhì)再細胞化，或干細胞或祖細胞分化和/或成熟為內(nèi)皮細胞，或原代細胞的維持 或分化，或它們的任何組合。原代細胞是從生物體中獲得的細胞，然后，通常將其進行體外 培養(yǎng)，但是那些細胞不能無限增殖。分化的細胞包括原代細胞和已經(jīng)體外分化的細胞，例如 本發(fā)明的灌注脫細胞化的基質(zhì)中的干細胞或祖細胞。在一個實施方案中，至少5%、10%或 20%或更多的分化細胞具有功能上成熟的表型。組織是具有共同結(jié)構(gòu)和功能的細胞群體， 例如上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織（骨骼肌、屯、肌或平滑?。￤及神經(jīng)組織，并且包括覆 蓋或內(nèi)襯或連結(jié)器官的柔軟的層。器官是W結(jié)構(gòu)單元連接在一起的行使共同功能的一些組 織（兩種或更多種）。器官包括但不限于：腦、肝臟、膜腺、骨、屯、臟、胃、腎臟、肺、全身肌肉、 胸腺、肛口和腸。如本文使用的，器官包括可灌注的全部器官或器官的部分或其血管化的結(jié) 構(gòu)，組織包括含有血管化的組織的任何結(jié)構(gòu)，例如氣管。
[0021] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供器官或組織特異的細胞外基質(zhì)巧CM)支架在再內(nèi) 皮化中的用途，該用途利用可需要分化或成熟的細胞，如干細胞或祖細胞。分化是一個過 程，細胞通過該過程獲得不同于原始細胞群體的新表型，例如不同的細胞基因和/或蛋白 表達和/或功能。成熟進一步將細胞群體的表型闡明為具有體內(nèi)細胞群體中的細胞的正常 成熟功能能力。在一個實施方案中，支架是器官的灌注脫細胞化的ECM部分。在另一實施 方案中，支架是灌注脫細胞化的ECM器官。
[0022] 與其它脫細胞化技術(shù)（如基于浸入的脫細胞化）相比，來自器官或組織的灌注脫 細胞化的ECM保留了更多的天然微結(jié)構(gòu)，包括完整的血管和/或微血管系統(tǒng)。例如，來自器 官或組織的灌注脫細胞化的ECM保留了膠原含量W及其它結(jié)合和信號因子W及脈管系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)，因而為引入的細胞的功能分化或細胞功能維持提供了具有天然誘因的生態(tài)位環(huán)境。 在一個實施方案中，在合適的條件（包括合適的壓力和流量）下，利用灌注脫細胞化的ECM 的脈管系統(tǒng)，用細胞和/或介質(zhì)灌注來自器官或組織的灌注脫細胞化的ECM，W模擬通常存 在于生物體中的條件。人體尺寸的器官的正常壓力為約40至約200mmHg,其中產(chǎn)生的流 動速率取決于進入的灌注血管直徑。對于正常的人體屯、臟，產(chǎn)生的灌注速率為約20至約 200mL/min/100g。利用此系統(tǒng)，接種的細胞可達到的接種濃度比在2D細胞培養(yǎng)條件下達到 的接種濃度大約5x至高達約1000 x并且不像2D培養(yǎng)系統(tǒng)，ECM環(huán)境允許細胞進行進一步 的功能分化，例如祖細胞分化成顯示具有持續(xù)功能的器官或組織特異表型的細胞。在一個 實施方案中，培養(yǎng)條件與ECM來源的組合允許引入至ECM的細胞進行功能分化。
[0023] 在一個實施方案中，方法包括選擇器官或組織的灌注脫細胞化的基質(zhì)W及包含內(nèi) 皮細胞的細胞群體或能夠分化成內(nèi)皮細胞的祖細胞的細胞群體。在一定條件下，將選擇的 灌注脫細胞化的基質(zhì)與細胞群體接觸一段時間，來為灌注脫細胞化的基質(zhì)提供再細胞化， 并且使細胞群體中的祖細胞分化成功能細胞。在一個實施方案中，引入納米顆粒和微粒，并 使其與細胞一起通過脈管系統(tǒng)進行循環(huán)。在一個實施方案中，在再內(nèi)皮化之后，引入納米顆 粒和微粒，并使其通過脈管系統(tǒng)進行循環(huán)。在一個實施方案中，所述器官為屯、臟。在另一實 施方案中，所述器官為肝臟。在另一實施方案中，所述器官為膜腺。在另一實施方案中，所 述器官為肺。
[0024] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供在再內(nèi)皮化的灌注脫細胞化的基質(zhì)中維持毛細血 管腔直徑的方法。所述方法包括選擇器官或組織的灌注脫細胞化的基質(zhì)W及能夠分化成內(nèi) 皮細胞或內(nèi)皮細胞的干細胞群體。在一定條件下，將選擇的灌注脫細胞化的基質(zhì)與細胞接 觸一段時間來為灌注脫細胞化的基質(zhì)提供再內(nèi)皮化，并且提供內(nèi)皮細胞或者使群體中的干 細胞分化成功能性內(nèi)皮細胞。在一個實施方案中，干細胞為誘導的多能干（iP巧細胞。在 一個實施方案中，干細胞為胚胎干巧巧細胞，例如，人ES細胞。在一個實施方案中，干細胞 為成體干細胞。
[00巧]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法使用器官或組織ECM的一部分，例如屯、臟的屯、 房或屯、室，或者膜腺的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，包括膜島。在一個實施方案中，所述部分的厚度為約5至 約10mm。在一個實施方案中，所述部分的厚度為約70至約100mm。
[0026] 可從任何來源獲得ECM器官或組織基質(zhì)，所述來源包括但不限于屯、臟、肝臟、肺、 骨骼肌、腦、膜腺、脾臟、腎臟、子宮、眼睛、脊髓、全身肌肉或膀脫，或其任何部分（例如主動 脈瓣、二尖瓣、肺動脈瓣、=尖瓣、肺靜脈、肺動脈、冠狀脈管系統(tǒng)、隔膜、右屯、房、左屯、房、右 屯、室或左屯、室）。實體器官是指具有"基本閉合的"脈管系統(tǒng)的器官。關(guān)于器官的"基本閉 合的"脈管系統(tǒng)意為，假設(shè)主要的血管被插管、被結(jié)扎或者W其它方式受限制，在用液體灌 注后，大部分液體包含于實體器官中或從天然血管結(jié)構(gòu)中流出，并且不從實體器官中漏出。 盡管具有"基本閉合的"脈管系統(tǒng)，上文列出的許多器官具有確定的"入口 "或"出口 "血管， 在灌注期間，可將其用于引入液體W