一種人皮膚干細胞活力素的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學的干細胞與組織工程學技術領域，具體涉及一種人皮膚干細 胞活力素的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 皮膚干細胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的多能干細胞，正常皮膚的 自我平衡或者受損皮膚的修復主要是由皮膚干細胞來完成的。皮膚干細胞可以產生和分泌 大量的生物活性因子，如：角質細胞生長因子（KGF)、表皮細胞生長因子（EGF)、成纖維細胞 生長因子（FGF)、血管內皮細胞生長因子（VEGF)等因子，這些細胞因子具有促進細胞增殖、 分化、抗凋亡等功能，還可以產生天然免疫蛋白，抵御或修復自身和外界因素對皮膚細胞造 成的損傷。
[0003] 當皮膚干細胞源源不斷地滿足皮膚需求時，皮膚的健康就會得到保證，各種皮膚 問題就可以被有效地預防，皮膚就可以重新回到更年輕更健康的狀態(tài)，做到真正由內而外 的美麗。
[0004] 現有技術查閱發(fā)現中國專利ZL 201310100300. 2公布了一種皮膚干細胞活性素 的制備方法及其應用，其中的一個主要發(fā)明點是將皮膚干細胞破碎，從細胞內容物中提取 活性組分，但皮膚干細胞破碎后，會釋放大量的酶，將皮膚干細胞分泌的生物活性成分降 解，降低皮膚干細胞活性素的本質上的功效。

【發(fā)明內容】

[0005] 為克服現有技術的缺點和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種人皮膚干細胞活 力素的制備方法及其在化妝品上的應用，運用優(yōu)選技術方案獲得具有針對性的皮膚修護和 皮膚保健的人的皮膚干細胞活力素。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供制得的人皮膚干細胞活力素在化妝品上的應用。
[0007] 為了實現上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術方案： 一種人皮膚干細胞活力素的制備方法，包括以下步驟： 51、 皮膚干細胞的獲取：取來源于健康新生兒或小兒的包皮組織，經磁珠篩選法篩選出 皮膚干細胞； 52、 皮膚干細胞的接種培養(yǎng) 將得到的皮膚干細胞接種在飼養(yǎng)層細胞上，用DMEM /F-12完全培養(yǎng)基，傳代擴增培 養(yǎng)； 53、 人皮膚干細胞活力素的獲得 待皮膚干細胞進行傳代擴增到2-10倍后，胰酶消化、離心，收集上清液，獲得人皮膚干 細胞活力素。
[0008] 所述皮膚干細胞來源于包皮的全厚皮膚，即皮下組織剪除后的包皮皮片。
[0009] 所述皮膚干細胞的接種培養(yǎng)是以2 ~ 5 X 104個/cm2的密度將皮膚干細胞接種在 飼養(yǎng)層細胞上。
[0010] 所述皮膚干細胞的獲取具體為：取健康的新生兒或小兒包皮環(huán)切術切除的包皮組 織，置于含有l(wèi)〇〇U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的PBS中，并經PBS反復漂洗后，剪取包皮 的全厚皮膚，即皮下組織剪除后的包皮皮片，PBS漂洗兩次，放入0. 25% Trypsin-EDTA中， 剪碎，37°C消化30min，用200目過濾網過濾細胞，收集濾液；在得到的濾液中加入含有10% FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，終止反應，反復吹打，用磁珠篩選法篩選出皮膚干細胞； 所述皮膚干細胞的接種培養(yǎng)具體為：將得到的皮膚干細胞在轉速為1200-1500 r/min 的條件下離心5 min，用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基洗皮膚干細胞1次，調整細胞密度以2 ~ 5 1104個/(^2密度將皮膚干細胞接種在飼養(yǎng)層細胞上，用01^1作-12完全培養(yǎng)基，37°(：、5% C02、90%濕度下傳代擴增培； 本發(fā)明的技術方案，更優(yōu)選的為： 一種人皮膚干細胞活力素的制備方法，包括如下步驟： 51、 人皮膚的處理 取健康的新生兒或小兒包皮環(huán)切術切除的包皮組織，置于含有l(wèi)〇〇U/ml青霉素和 100ug/ml鏈霉素的PBS (磷酸鹽緩沖液）中，并經PBS反復漂洗后，剪取包皮的全厚皮膚， 即皮下組織剪除后的包皮皮片，PBS漂洗兩次，放入0. 25% Trypsin-EDTA (胰酶-EDTA)中， 剪碎，37 °C消化30min，用200目過濾網過濾細胞，收集濾液； 52、 皮膚干細胞的獲取 S1得到的濾液中加入含有10% FBS (胎牛血清）的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，終止反應， 反復吹打，用磁珠篩選法篩選出皮膚干細胞； 53、 皮膚干細胞的接種培養(yǎng) 將得到的皮膚干細胞在轉速為1200-1500 r/min的條件下離心5 min，用DMEM/F-12完 全培養(yǎng)基洗皮膚干細胞1次，調整細胞密度以2 ~ 5 X 104個/cm 2密度將皮膚干細胞接種 在飼養(yǎng)層細胞上，用DMEM /F-12完全培養(yǎng)基，37°C、5% C02、90%濕度下傳代擴增培； 54、 人皮膚干細胞活力素的獲得 待皮膚干細胞進行傳代擴增到2-10倍后，胰酶消化、離心，收集上清液，即獲得人皮膚 干細胞活力素。
[0011] 本發(fā)明中，所述飼養(yǎng)層細胞由如下步驟獲得： 511、 將終濃度為0. 25Pg/ml絲裂霉素 C加至接近匯合的人成纖維細胞中，37°C過夜，更 換DMEM/F-12完全培養(yǎng)基； 512、 0· 25% Trypsin-EDTA消化，懸液lxlO7個/ml中加入絲裂霉素 C，終濃度為2〇μ8/ ml，37°C孵育lh，離心清洗去除絲裂霉素 C，再以lxlO5個/ml的人成纖維細胞進行接種； 513、 再培養(yǎng)1~3 d后，0· 25% Trypsin-EDTA消化，再接種在新的DMEM/F-12完全培養(yǎng) 基中，接種濃度5xl05個/ml或10 4個細胞/cm2; 514、 繼續(xù)培養(yǎng)1~2 d，即可進行皮膚干細胞接種。
[0012] 進一步地，接近匯合的人成纖維細胞的濃度為lxlO5個/ml 上述制得的人皮膚干細胞活力素應用于化妝品。
[0013] 上述人皮膚干細胞活力素在化妝品上的應用，以凍干粉的形式應用，該凍干粉的 保護劑為含量為0.2 %- 5 %海藻糖，溶媒為生理鹽水以及PBS中的至少一種，按個人實際 情況，確定施用本品方式及用量。
[0014] 上述人皮膚干細胞活力素在化妝品上的應用，應用于精華液，該精華液的穩(wěn)定保 護劑為海藻糖；保濕增稠劑為聚谷氨酸、輔酶Q10以及透明質酸中的至少一種。
[0015] 與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點及有益效果： 本發(fā)明是取自健康新生兒、小兒包皮環(huán)切術切除的包皮組織，采用磁珠分選法篩選出 皮膚干細胞，體外培養(yǎng)獲得人皮膚干細胞活力素。本發(fā)明的一個優(yōu)點是所用的飼養(yǎng)細胞是 人成纖維細胞，而不是小鼠的細胞，避免鼠源成份。本發(fā)明人的皮膚干細胞活性素可廣泛應 用于美容醫(yī)學及護膚、鍵膚等美容化妝品中。
【具體實施方式】
[0016] 現結合具體實施例詳細說明本發(fā)明。
[0017] 實施例1 一種人皮膚干細胞活力素的制備方法的步驟如下： 51、 人皮膚的處理 取健康的新生兒或小兒包皮環(huán)切術切除的包皮組織，置于含有?οου/ml青霉素和 100ug/ml鏈霉素的PBS (磷酸鹽緩沖液）中，并經PBS反復漂洗后，剪取包皮的全厚皮膚， 即皮下組織剪除后的包皮皮片，PBS漂洗兩次，放入0. 25% Trypsin-EDTA (胰酶-EDTA)中， 剪碎，37 °C消化30min，用200目過濾網過濾細胞，收集濾液； 52、 皮膚干細胞的獲取 S1得到的濾液中加入含有10% FBS (胎牛血清）的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，終止反應， 反復吹打，用磁珠篩選法篩選出皮膚干細胞； 53、 皮膚干細胞的接種培養(yǎng) 將得到的皮膚干細胞在轉速為1200-1500 r/min的條件下離