亚洲狠狠干,亚洲国产福利精品一区二区,国产八区,激情文学亚洲色图

存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:11106567閱讀:967來源:國知局
存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用與制造工藝

本發(fā)明涉及利用特殊方法來研究或分析材料領(lǐng)域,更具體地是一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

微粒(Microparticles,MPs)是一類在某些生理或病理狀況下,由正常細(xì)胞出芽脫落的富含磷脂的顆粒,具有一定的促凝活性。目前在人體外周靜脈血中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些血細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒,如:血小板源微粒(Platelet derived MPs,PMPs)、內(nèi)皮細(xì)胞源微粒(Endothelial MPs,EMPs)等。研究結(jié)果顯示:MPs(如PMPs)具有較強的促凝活性與免疫炎癥功能,在血栓性相關(guān)疾病等領(lǐng)域中具有很大的研究價值。

創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是我們前期研究工作的重點,顱腦受到創(chuàng)傷后所引發(fā)的一系列病理反應(yīng)直接影響患者的生命及預(yù)后,而且病程發(fā)展很快。研究TBI的多種病理反應(yīng)及時阻斷病程的發(fā)展對疾病的預(yù)后有重大意義。

由于腦源性微粒(鼠源性)(Brain-derived microparticles,BDMPs)的概念與特性是我們團隊首次在國際上報道,屬于最新的研究領(lǐng)域。另外,BDMPs的結(jié)構(gòu)非常微小(直徑0.1~1.0μm),使得分離提純鑒定工作十分困難;并且由于人體十分復(fù)雜而又極其精密,使得人體來源的BDMPs的分離提純鑒定與鼠來源的有很大區(qū)別,因此理論和前期工作的實踐都表明不能套用照搬鼠源性的實驗方案。所以急需一套人源性BDMPs的分離提純鑒定實驗方案以及應(yīng)用此套方案來探究人源性BDMPs的臨床特性。因此很有必要建立一種靈敏、精確、定量的人源性BDMP s檢測方法。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明為了解決鼠源性腦源性微粒的提取方法不能應(yīng)用于人源性腦源性微粒的提取的問題,所提出一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒及其分離提純鑒定方法和應(yīng)用。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒,所述腦源性微粒的磷脂雙分子膜上富含磷脂酰絲氨酸和組織因子并攜帶神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物。

一種上述存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒在制備治療創(chuàng)傷性顱腦損傷引發(fā)的凝血功能障礙藥物中的應(yīng)用。

一種上述存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒的分離提純鑒定方法,包括以下步驟:

a.采集腦創(chuàng)傷病人/健康人血液樣本:

采集腦創(chuàng)傷病人/健康人外周靜脈血放入枸櫞酸鈉抗凝管中,在常溫下進行120 g-150g離心20 min-30min;

b.分離提純?nèi)嗽葱訠DMPs:

Ⅰ.取上層血漿,在常溫下進行1500 g-2000g離心20 min-30min;

Ⅱ.取上層血漿,常溫下13000 g-15000g離心2 min-5min;

Ⅲ.取上層血漿,4℃下100000 g -120000 g離心60min-70min,留取沉淀,即為BDMPs,用PBS重懸后分別得到病人/健康人的富含BDMPs的懸液,用于后續(xù)流式檢測;

c.體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞制備BDMPs作為流式細(xì)胞技術(shù)檢測的陽性對照:

Ⅰ.在神經(jīng)元細(xì)胞和成長到對數(shù)生長期的膠質(zhì)細(xì)胞中,加入鈣離子超載劑,37℃孵育10-30 min;

Ⅱ.收集細(xì)胞上清液,在常溫下1500 g-2000g離心20 min-30min;

Ⅲ.取上清,在常溫下13000 g-15000g離心2 min-5min;

Ⅳ.取上清,4℃下100000 g -120000 g離心60min-70min,留取沉淀,即為BDMP,用PBS重懸后用于作為流式檢測人血腦源性微粒檢測的陽性對照;

d. 流式細(xì)胞技術(shù)鑒定人源性BDMPs:

Ⅰ.取9支無菌流式管,分別編號1~9,1號管為無抗體或染料染色的陰性對照管,2、3、4號管分別為PE Mouse anti-GFAP、MitoTracker? Green FM、APC-Annexin V抗體或染料染色的單染管,5、6號管分別為腦創(chuàng)傷病人、健康人,7號管為體外制備BDMPs的上述3種抗體或染料染色的三染管;8號管為APC-Annexin V抗體的陰性對照管;9號管為PE Mouse anti-GFAP抗體的陰性對照管;

分別取健康人的富含BDMPs的懸液至1,6號試管中,分別取病人的富含BDMPs的懸液至2,3,4,5,8,9號試管中,取體外制備BDMPs的懸液至7號試管中;

Ⅱ.向2,5,6,7號試管中加入PE Mouse anti-GFAP抗體,低速震蕩,充分混合,室溫避光孵育10 min-30min;向試管9中加入同型對照PE Mouse IgG1抗體,低速震蕩,充分混合,室溫避光孵育10 min-30min;

Ⅲ.用DMSO將免疫熒光染料MitoTracker? Green FM稀釋;向3,5,6,7號試管中加入免疫熒光染料MitoTracker? Green FM,低速震蕩,充分混合,室溫避光孵育10 min-30min;

Ⅳ.分別向4,5,6,7號試管中加入抗體APC-Annexin V,同時加入4X Annexin V結(jié)合試劑,混合后室溫避光孵育10 min-30min;向8號試管中同時加入抗體APC-Annexin V、EDTA和4X Annexin V結(jié)合試劑,混合后室溫避光孵育10min-30min;

Ⅴ.分別向試管1,2,3中加入4X Annexin V結(jié)合試劑,最后分別向試管1~8中加入2X Annexin V結(jié)合試劑將液體體積補足,混勻后進行流式細(xì)胞儀檢測。

本發(fā)明獲得了如下有益效果。

本發(fā)明采用梯度離心與超速離心結(jié)合的方式獲得了存在于人體外周靜脈血中的腦源性微粒。雖然梯度離心與超速離心是醫(yī)學(xué)科研工作的常用方法,但我們將二者有機結(jié)合起來,集中了兩者的優(yōu)點,并分別采取不同的離心速度與離心時間,極大的提高了人血BDMPs的檢出率,獲得了意想不到的效果;另外,離心過程的溫度、升降設(shè)置也與鼠腦提取BDMPs大為不同,更加突顯了本技術(shù)方案的創(chuàng)造性。

本發(fā)明的方法排除了其它血細(xì)胞碎片和污染顆粒對腦源性微粒檢測的影響,定性定量地檢測出了存在于人體外周靜脈血中的BDMPs。本發(fā)明方法保證了BDMPs檢測的可行性、簡便性的同時,也提高了其檢測的準(zhǔn)確性;并且,應(yīng)用本發(fā)明方法初步探明了腦源性微粒所具有的特殊臨床特性,這將有利于闡明TBI相關(guān)凝血功能障礙的理論機制,建立預(yù)防治療TBI引發(fā)的凝血功能障礙的新方法。

附圖說明

圖1是本發(fā)明Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒流式檢測結(jié)果圖;

圖2是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測7號管陽性對照結(jié)果圖;

圖3是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測7號管APC-Annexin V+FITC-MitoTracker雙陽性對照染色結(jié)果圖;

圖4是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測7號管APC-Annexin V+PE-GFAP雙陽性對照染色結(jié)果圖;

圖5是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測1號管陰性對照圖;

圖6是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測1號管陰性對照圖;

圖7是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測1號管陰性對照圖;

圖8是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測5號管腦創(chuàng)傷病人APC-Annexin V+PE-GFAP雙陽性染色結(jié)果圖;

圖9是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測5號管腦創(chuàng)傷病人APC-Annexin V+FITC-MitoTracker雙陽性染色結(jié)果圖;

圖10是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測6號管健康人APC-Annexin V+PE-GFAP雙陽性染色結(jié)果圖;

圖11是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測6號管健康人APC-Annexin V+FITC-MitoTracker雙陽性染色結(jié)果圖;

圖12是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測4號管APC-Annexin V單陽性管圖;

圖13是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測8號管EDTA+APC-Annexin 陰性對照管圖;

圖14是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測2號管PE-GFAP單陽性管圖;

圖15是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測9號管PE-GFAP的陰性對照IgG圖;

圖16是本發(fā)明流式細(xì)胞儀檢測3號管FITC-MitoTracker 單陽性管圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述。

1.采集腦創(chuàng)傷病人/健康人血液樣本:

(1)采集4毫升腦創(chuàng)傷病人/健康人外周靜脈血放入枸櫞酸鈉抗凝管中,在常溫下進行120 g離心20 min,以去除紅細(xì)胞、白細(xì)胞等大型細(xì)胞,注意離心要緩降;

2.分離提純?nèi)嗽葱訠DMPs:

(1)小心取出上層血漿,在常溫下進行1500 g離心20 min,以去除血小板等小型細(xì)胞和較大的細(xì)胞顆粒(離心機設(shè)置為快升慢降,即無閘設(shè)置);

(2)小心取出上層血漿,常溫下13000 g離心2 min,以去除較大的細(xì)胞顆粒;

(3)小心取出上層血漿,4℃下100000g離心1h,留取沉淀,沉淀即為BDMPs,用PBS重懸后即分別得到病人/健康人的富含BDMPs的懸液,用于后續(xù)流式檢測。

(4)體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞制備BDMPs作為流式細(xì)胞技術(shù)檢測的陽性對照,采用以下步驟:

①培養(yǎng)14 d的神經(jīng)元細(xì)胞和成長到對數(shù)生長期的膠質(zhì)細(xì)胞中,加入鈣離子超載劑A23187(終濃度10 μg/ml),37℃孵育20 min;

②收集細(xì)胞上清液,在常溫下1500 g離心20 min,以去除懸浮的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞;

③取上清,在常溫下13000 g離心2 min,以去除大的細(xì)胞碎片;

④取上清,4℃下100000g離心1h,留取沉淀,即為BDMP,用PBS重懸后用于作為流式檢測人血腦源性微粒檢測的陽性對照。

3. 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定人源性BDMPs

(1)取9支無菌流式管,分別編號1~9,1號管為無抗體或染料染色的陰性對照管,2、3、4號管分別為PE Mouse anti-GFAP、MitoTracker? Green FM、APC-Annexin V抗體或染料染色的單染管,單染管用于調(diào)補償,5、6號管分別為腦創(chuàng)傷病人、健康人,7號管為體外制備BDMPs的上述3種抗體或染料染色的三染管,為陽性對照管;8號管為APC-Annexin V抗體的陰性對照管;9號管為PE Mouse anti-GFAP抗體的陰性對照管。分別取50 μl 健康人的富含BDMPs的懸液至試管1,6中,分別取50 μl 病人的富含BDMPs的懸液至試管2,3,4,5,8,9中,取50 μl 體外制備BDMPs的懸液至試管7中;

(2)然后向試管2,5,6,7中加入PE Mouse anti-GFAP抗體(終濃度為10 ng/μl),低速震蕩,充分混合,室溫避光孵育20min;向試管9中加入同型對照PE Mouse IgG1抗體(終濃度為10 ng/μl),低速震蕩,充分混合,室溫避光孵育20min;

(3)用DMSO將免疫熒光染料MitoTracker? Green FM稀釋為1 mM,注意全程避光低溫操作;向試管3,5,6,7中加入免疫熒光染料MitoTracker? Green FM(終濃度為10 ng/μl),低速震蕩,充分混合,室溫避光孵育15min;

(4)然后向試管4,5,6,7中分別加入抗體APC-Annexin V(終濃度為50 ng/μl),同時加入50 μl 4X Annexin V結(jié)合試劑,混合后室溫避光孵育15min;向試管8中分別同時加入抗體APC-Annexin V(終濃度為50 ng/μl)和EDTA(終濃度為50 ng/μl),同時加入50 μl 4X Annexin V結(jié)合試劑,混合后室溫避光孵育15min;

(5)向試管1,2,3中分別加入50 μl 4X Annexin V結(jié)合試劑,最后向試管1~8中分別加入2X Annexin V結(jié)合試劑將液體體積補足到500μl,在避光條件下用移液器無渦流吹打各試管中的懸液,輕輕混勻避免產(chǎn)生氣泡,混勻后進行流式細(xì)胞儀檢測;

注意,每個標(biāo)本上機前在避光條件下用移液器無渦流吹打懸液,輕輕混勻避免產(chǎn)生氣泡,混勻后即可進行流式細(xì)胞儀檢測。

(6)在FSC/SSC散點圖中,應(yīng)用購買的Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒(直徑分別為0.5,0.9和3 μm)確定不同微粒大小的位置(圖1)。根據(jù)結(jié)果我們?nèi)x直徑小于0.9 μm的區(qū)域即為P1區(qū)域,圖2中所示P2區(qū)域即為MPs區(qū)域,橫縱坐標(biāo)FSC和SSC均采用對數(shù)刻度。圈選P2區(qū)域的MPs進入散點圖(圖3和圖4),圖3橫坐標(biāo)為APC結(jié)合的PS標(biāo)記Annexin V,縱坐標(biāo)為FITC結(jié)合的線粒體標(biāo)記;圖4橫坐標(biāo)為APC結(jié)合的PS標(biāo)記Annexin V,縱坐標(biāo)為PE結(jié)合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP,橫縱坐標(biāo)均采用對數(shù)刻度。共收集100萬個細(xì)胞顆粒。圖1為Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒流式檢測結(jié)果;圖2、圖3和圖4均為7號管流式檢測結(jié)果;圖5、圖6和圖7均為1號管流式檢測結(jié)果;圖8、9為5號管腦創(chuàng)傷病人流式檢測結(jié)果;圖10、11為6號管健康人流式檢測結(jié)果;圖12為4號管流式檢測結(jié)果;圖13為8號管流式檢測結(jié)果;圖14為2號管流式檢測結(jié)果;圖15為9號管流式檢測結(jié)果;圖16為3號管流式檢測結(jié)果。

通過研究發(fā)現(xiàn):BDMPs具有獨特的結(jié)構(gòu)與功能,其磷脂雙分子膜上富含磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)和組織因子(tissue factor,TF)并攜帶神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物。BDMPs的直徑相對較小,但其促凝活性較PMPs更強。

通過應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)發(fā)現(xiàn):TBI病人外周靜脈血中的BDMPs含量遠(yuǎn)多于健康人。這一發(fā)現(xiàn)說明機體在遭受顱腦創(chuàng)傷后,血腦屏障受到了破壞,神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放的BDMPs會通過血腦屏障釋放到外周血中。

目前,創(chuàng)傷后出現(xiàn)凝血功能障礙是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者死亡的一個主要原因,但是相關(guān)凝血功能障礙發(fā)生發(fā)展的機制仍然知之甚少,而本發(fā)明對于BDMPs的發(fā)現(xiàn)與研究則有望能夠闡明TBI相關(guān)凝血功能障礙的理論基礎(chǔ),明確相關(guān)機制,建立預(yù)防治療TBI引發(fā)的凝血功能障礙的新方法。

當(dāng)前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1