專利名稱：一種測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物力學(xué)測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法。
背景技術(shù)：
微創(chuàng)醫(yī)療技術(shù)是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最快的醫(yī)療技術(shù)之一，其原因在于為數(shù)眾多的患者需要治療。微創(chuàng)介入醫(yī)療是采用一系列微創(chuàng)器械、材料和現(xiàn)代化數(shù)字診療設(shè)備進(jìn)行診斷與治療操作的醫(yī)療技術(shù)，它具有“及時、微創(chuàng)、無痛、舒適”的優(yōu)點(diǎn)，在治療心血管疾病方面尤為突出。隨著人口老齡化時代的到來和生活質(zhì)量的提高，微創(chuàng)介入醫(yī)學(xué)工程已顯示出前所未有的應(yīng)用前景。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，現(xiàn)今我國需要接受心血管手術(shù)的病人已達(dá)約400 萬人，且每年以20%的速率增加。在2005年我國與微創(chuàng)介入醫(yī)療器械材料相關(guān)的市場銷售額約為50億元，預(yù)計在2015年，市場需求量有可能達(dá)到300 400億元。所以，目前國際上所有的醫(yī)療器械制造商都把目光瞄準(zhǔn)了中國，將中國作為全球最大的心血管疾病治療的醫(yī)療器械潛在市場。然而，由醫(yī)療導(dǎo)管/血管內(nèi)皮細(xì)胞摩擦誘發(fā)的血管疾病是一個長期存在且尚未解決的問題。在手術(shù)操作過程中，長度為80-150cm的醫(yī)療導(dǎo)管通常從淺表腿部動脈或靜脈入路，經(jīng)過迂曲的血管將治療器械(支架等)輸送到病變處(如心臟或腦部)，在此過程中，醫(yī)療導(dǎo)管不可避免地與血管內(nèi)壁表面的單層內(nèi)皮細(xì)胞膜接觸而產(chǎn)生摩擦，摩擦過高將會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損，進(jìn)而誘發(fā)手術(shù)出血、血栓形成以及術(shù)后血管再狹窄等并發(fā)癥，最終誘發(fā)動脈粥樣硬化等血管疾病。所以，醫(yī)療導(dǎo)管/人體血管內(nèi)皮細(xì)胞摩擦性能對心血管疾病微創(chuàng)介入治療成功與否意義重大。但是目前醫(yī)療導(dǎo)管/人體血管內(nèi)皮細(xì)胞摩擦性能及機(jī)理尚不明確，與迅速發(fā)展的微創(chuàng)介入醫(yī)療極不匹配，其主要原因在于目前測定醫(yī)療導(dǎo)管摩擦性能的方法的如下缺點(diǎn)1)醫(yī)療導(dǎo)管材料/材料摩擦研究對細(xì)胞而言存在局限性，這類研究占絕大多數(shù)， 主要用微摩擦力測定儀、旋轉(zhuǎn)式流變儀及多功能微摩擦試驗機(jī)等方法評價導(dǎo)管材料之間、 材料與玻璃、高分子水凝膠等基板之間的摩擦性能。但是由于未以血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，很難斷定所研究材料是否同樣具有降低血管內(nèi)皮細(xì)胞摩擦的功能。2)醫(yī)療導(dǎo)管材料/動物血管內(nèi)壁表面摩擦研究難以擴(kuò)展到人體，相關(guān)報道尚不多見，有報道用銷-盤摩擦磨損試驗機(jī)、往復(fù)式摩擦測試儀研究了導(dǎo)管材料/動物血管內(nèi)壁摩擦性能。然而，以動物血管為研究對象的最大局限性在于需要大量新鮮的血管樣品，而獲取大量人體新鮮血管樣品的機(jī)會非常有限，所以該方法難以擴(kuò)展到人體血管內(nèi)壁摩擦性能研3)另外在體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞摩擦性能測試方面，美國佛羅里達(dá)大學(xué)的 W. G. Sawyer等用微摩擦試驗機(jī)初步評價了在玻璃表面培養(yǎng)的牛大動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞/玻璃摩擦性能。雖然該研究在一定程度上反應(yīng)了血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的宏觀摩擦行為，但是還存在下列問題①研究對象問題，沒有評價人體血管內(nèi)皮細(xì)胞摩擦性能，結(jié)果難以借鑒到人體；②體系設(shè)計問題，測試中細(xì)胞處于“硬的”玻璃培養(yǎng)支架與“硬的”玻璃摩擦基板之間的 “夾心”狀態(tài)，因此，應(yīng)力會集中在“柔軟的”細(xì)胞表面，測試中細(xì)胞很快被剝離損壞，導(dǎo)致難以準(zhǔn)確評價細(xì)胞摩擦性能。另外一種是用旋轉(zhuǎn)流變儀測試在高分子水凝膠表面培養(yǎng)的人體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面與玻璃板之間的摩擦性能，由于摩擦力較大，隨測試時間的增加，細(xì)胞逐漸被玻璃基板剝離損壞，200s以后不能得到準(zhǔn)確的摩擦信息。此外，上述兩種方法均沒有考慮溫度和(X)2濃度對測試結(jié)果的影響。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，這種方法用于體外直接、定量且能長時間準(zhǔn)確測定在體外培養(yǎng)的或者活的人體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，加強(qiáng)了細(xì)胞在水凝膠支架表面的粘附力，從而在測試中細(xì)胞不易被從水凝膠表面剝離，便于活細(xì)胞摩擦長時間準(zhǔn)確檢測；對不同的人體血管內(nèi)皮細(xì)胞可分別尋找出適合它們擴(kuò)增為單層細(xì)胞膜的合成高分子水凝膠支架，并具有與體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的接近的內(nèi)皮糖萼結(jié)構(gòu)和抗凝血功能，而該方法中使用到的高分子水凝膠，將處于“柔軟的”水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)支架與“柔軟的”水凝膠摩擦基板之間的“夾心”狀態(tài)，粘彈性的高分子水凝膠將有效減小細(xì)胞所承受的應(yīng)力，從而保護(hù)細(xì)胞生存狀態(tài)，克服細(xì)胞易于被剝離損壞的缺點(diǎn)，具有準(zhǔn)確評價活細(xì)胞摩擦性能的優(yōu)點(diǎn)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，步驟如下步驟1 首先將高分子水凝膠按照預(yù)設(shè)的支架構(gòu)架和基板構(gòu)架分別切割加工成高分子水凝膠支架和高分子水凝膠摩擦基板，將該高分子水凝膠支架和高分子水凝膠摩擦基板進(jìn)行高溫滅菌15-20分鐘；步驟2 隨后將人體臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞直接播種于高溫滅菌后的高分子水凝膠支架的一側(cè)表面后，在內(nèi)部溫度為37°C且內(nèi)部(X)2的體積百分比為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 直到血管內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增為單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，這樣帶有擴(kuò)增為單層細(xì)胞膜的高分子水凝膠支架就構(gòu)筑成軟材料活細(xì)胞人工血管模型；步驟3 將待與單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜摩擦的高分子水凝膠基板粘接在流變儀溶液池的底面，并在流變儀溶液池內(nèi)加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后將高分子水凝膠支架的帶有單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜的一側(cè)表面朝向高分子水凝膠基板，而將高分子水凝膠支架的另一側(cè)表面粘接于流變儀上部的幾何測頭上，啟動流變儀的升降系統(tǒng)控制幾何測頭下降，直至軟材料活細(xì)胞人工血管模型的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜與高分子水凝膠基板相接觸且相接觸時垂直壓力P達(dá)到預(yù)定值范圍1 50 時，保持平衡10分鐘，隨后啟動流變儀，按照預(yù)設(shè)的扭矩Τ(ω)使高分子水凝膠基板沿旋轉(zhuǎn)中心旋轉(zhuǎn)至預(yù)定的最大角速度ω，當(dāng)達(dá)到最大角速度ω時，待測點(diǎn)的摩擦力F(coR)與扭矩Τ(ω)的關(guān)系為F(coR) = ^T ( ω ) ]/3 π R3，其中 R為待測點(diǎn)和旋轉(zhuǎn)中心之間的距離，根據(jù)摩擦力F(coR)與所施加的垂直壓力P的除值導(dǎo)出被測點(diǎn)的摩擦系數(shù)μ。所述的高分子水凝膠為聚乙烯醇水凝膠、聚氧乙烯水凝膠、聚乙二醇水凝膠、聚丙烯酸水凝膠、聚甲基丙烯酸水凝膠、聚苯乙烯磺酸鈉水凝膠或者聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸水凝膠。
本發(fā)明以具有與生理血管類似結(jié)構(gòu)和功能的高分子水凝膠加上單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜構(gòu)筑軟材料活細(xì)胞人工血管模型，該模型具有以下優(yōu)勢(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞的偽足可伸入三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，加強(qiáng)了細(xì)胞在水凝膠支架表面的粘附力，從而在測試中細(xì)胞不易被從水凝膠表面剝離，便于活細(xì)胞摩擦長時間準(zhǔn)確檢測；(2)對不同的人體血管內(nèi)皮細(xì)胞(動脈、靜脈、微小管)，可分別尋找出適合它們擴(kuò)增為單層細(xì)胞膜的合成高分子水凝膠支架，并具有與體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的接近的內(nèi)皮糖萼結(jié)構(gòu)和抗凝血功能。上述優(yōu)勢保證了 “軟材料活細(xì)胞人工血管模型”在結(jié)構(gòu)和功能上接近于生理血管。而高分子水凝膠在該方法中發(fā)揮兩個重要作用(1)作為人體血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，用以構(gòu)筑“軟材料活細(xì)胞人工血管模型”；( 作為與單層人體血管內(nèi)皮細(xì)胞膜摩擦的摩擦基板材料。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞將處于“柔軟的”水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)支架與“柔軟的”水凝膠摩擦基板之間的“夾心”狀態(tài)，粘彈性的高分子水凝膠將有效減小細(xì)胞所承受的應(yīng)力，從而保護(hù)細(xì)胞生存狀態(tài)，克服細(xì)胞易于被剝離損壞的缺點(diǎn)，具有準(zhǔn)確評價活細(xì)胞摩擦性能的優(yōu)點(diǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明。測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，步驟如下步驟1 首先將高分子水凝膠按照預(yù)設(shè)的支架構(gòu)架和基板構(gòu)架分別切割加工成高分子水凝膠支架和高分子水凝膠摩擦基板，將該高分子水凝膠支架和高分子水凝膠摩擦基板進(jìn)行高溫滅菌15-20分鐘；步驟2 隨后將人體臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞直接播種于高溫滅菌后的高分子水凝膠支架的一側(cè)表面后，在內(nèi)部溫度為37°C且內(nèi)部CO2的體積百分比為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 直到血管內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增為單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，這樣帶有擴(kuò)增為單層細(xì)胞膜的高分子水凝膠支架就構(gòu)筑成軟材料活細(xì)胞人工血管模型；步驟3 將待與單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜摩擦的高分子水凝膠基板粘接在旋轉(zhuǎn)式流變儀溶液池的底面，并在流變儀溶液池內(nèi)加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后將高分子水凝膠支架的帶有單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜的一側(cè)表面朝向高分子水凝膠基板，而將高分子水凝膠支架的另一側(cè)表面粘接于流變儀上部的幾何測頭上，啟動流變儀的升降系統(tǒng)控制幾何測頭下降， 直至軟材料活細(xì)胞人工血管模型的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜與高分子水凝膠基板相接觸且相接觸時垂直壓力P達(dá)到預(yù)定值范圍1 50 時，保持平衡10分鐘，隨后啟動流變儀，按照預(yù)設(shè)的扭矩Τ(ω)使高分子水凝膠基板沿旋轉(zhuǎn)中心旋轉(zhuǎn)至預(yù)定的最大角速度ω，當(dāng)達(dá)到最大角速度ω時，待測點(diǎn)的摩擦力F(coR)與扭矩Τ(ω)的關(guān)系為F(coR) = [4T ( ω ) ]/3 π R3, 其中R為待測點(diǎn)和旋轉(zhuǎn)中心之間的距離，根據(jù)摩擦力F(coR)與所施加的垂直壓力P的除值導(dǎo)出被測點(diǎn)的摩擦系數(shù)μ。所述的高分子水凝膠為聚乙烯醇水凝膠、聚氧乙烯水凝膠、聚乙二醇水凝膠、聚丙烯酸水凝膠、聚甲基丙烯酸水凝膠、聚苯乙烯磺酸鈉水凝膠或者聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸水凝膠，這樣的合成高分子水凝膠為中性、弱電解質(zhì)及強(qiáng)電解質(zhì)，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、性能穩(wěn)定且易于調(diào)控、無異物感染、易于滅菌且廉價的優(yōu)勢。本發(fā)明的摩擦力隨時間變化中，能使摩擦力在幾秒鐘內(nèi)首先達(dá)到一個最大峰值， 然后隨時間變化逐漸減小，最后達(dá)到一個平衡值，這樣即使測試2000s，大于98%的細(xì)胞都保存在“軟材料活細(xì)胞人工血管模型”的表面，同時細(xì)胞摩擦系數(shù)可以維持在0. 006-0. 008， 說明表面摩擦非常低，細(xì)胞幾乎沒有受損，可以長時間測試。
權(quán)利要求
1.一種測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，其特征在于，步驟如下步驟1 首先將高分子水凝膠按照預(yù)設(shè)的支架構(gòu)架和基板構(gòu)架分別切割加工成高分子水凝膠支架和高分子水凝膠摩擦基板，將該高分子水凝膠支架和高分子水凝膠摩擦基板進(jìn)行高溫滅菌15-20分鐘；步驟2 隨后將人體臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞直接播種于高溫滅菌后的高分子水凝膠支架的一側(cè)表面后，在內(nèi)部溫度為37°C且內(nèi)部CO2的體積百分比為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到血管內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增為單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，這樣帶有擴(kuò)增為單層細(xì)胞膜的高分子水凝膠支架就構(gòu)筑成軟材料活細(xì)胞人工血管模型；步驟3 將待與單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜摩擦的高分子水凝膠基板粘接在流變儀溶液池的底面，并在流變儀溶液池內(nèi)加入對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后將高分子水凝膠支架的帶有單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜的一側(cè)表面朝向高分子水凝膠基板，而將高分子水凝膠支架的另一側(cè)表面粘接于流變儀上部的幾何測頭上，啟動流變儀的升降系統(tǒng)控制幾何測頭下降，直至軟材料活細(xì)胞人工血管模型的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜與高分子水凝膠基板相接觸且相接觸時垂直壓力P達(dá)到預(yù)定值范圍1 50 時，保持平衡10分鐘，隨后啟動流變儀，按照預(yù)設(shè)的扭矩 Τ(ω)使高分子水凝膠基板沿旋轉(zhuǎn)中心旋轉(zhuǎn)至預(yù)定的最大角速度ω，當(dāng)達(dá)到最大角速度ω 時，待測點(diǎn)的摩擦力F(coR)與扭矩Τ(ω)的關(guān)系為F(coR) = [4Τ ( ω ) ]/3 π R3，其中R為待測點(diǎn)和旋轉(zhuǎn)中心之間的距離，根據(jù)摩擦力F(coR)與所施加的垂直壓力P的除值導(dǎo)出被測點(diǎn)的摩擦系數(shù)μ。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，其特征在于 所述的高分子水凝膠為聚乙烯醇水凝膠、聚氧乙烯水凝膠、聚乙二醇水凝膠、聚丙烯酸水凝膠、聚甲基丙烯酸水凝膠、聚苯乙烯磺酸鈉水凝膠或者聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸水凝膠。
全文摘要
一種測定活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，以具有與生理血管類似結(jié)構(gòu)和功能的高分子水凝膠加上單層血管內(nèi)皮細(xì)胞膜構(gòu)筑軟材料活細(xì)胞人工血管模型，用于體外直接、定量且能長時間準(zhǔn)確測定在體外培養(yǎng)的或者活的人體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面摩擦性能的方法，加強(qiáng)了細(xì)胞在水凝膠支架表面的粘附力，從而在測試中細(xì)胞不易被從水凝膠表面剝離，便于活細(xì)胞摩擦長時間準(zhǔn)確檢測；而該方法中使用到的高分子水凝膠，將處于“柔軟的”水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)支架與“柔軟的”水凝膠摩擦基板之間的“夾心”狀態(tài)，粘彈性的高分子水凝膠將有效減小細(xì)胞所承受的應(yīng)力，從而保護(hù)細(xì)胞生存狀態(tài)，克服細(xì)胞易于被剝離損壞的缺點(diǎn)，具有準(zhǔn)確評價活細(xì)胞摩擦性能的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N19/02GK102346128SQ20111019155
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者董坤, 陳詠梅 申請人:西安交通大學(xué)