一種永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系的構(gòu)建、 體外培養(yǎng)體系、鑒定及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，攻克癌癥治愈的任務(wù)仍很艱巨。迄今為止， 雖然抗癌藥物W雨后春算般的出市，但是癌癥的根治問(wèn)題仍未解決。研究表明，腫瘤的生長(zhǎng) 和轉(zhuǎn)移與腫瘤血管密切相關(guān)。近年來(lái)，臨床上利用"饑餓療法"配合化療治療癌癥，就是阻 斷腫瘤的新生血管使腫瘤細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)和氧分供應(yīng)缺失，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞餓死。然而，祀 向血管抗癌藥如貝伐單抗在目前臨床應(yīng)用中出現(xiàn)療效不一，其原因之一可能與在藥物研發(fā) 中采用的祀細(xì)胞來(lái)源于正常血管而不是腫瘤組織血管細(xì)胞有關(guān)。資料報(bào)道，腫瘤血管的生 物學(xué)特性是有別于正常血管，所W基于正常血管的祀向藥物用于抗癌治療（嚴(yán)格來(lái)講）是 不精準(zhǔn)的。
[0003] 對(duì)此，建立腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞模型對(duì)研發(fā)腫瘤血管祀向藥物是十分必要的。既往 國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)室已采用免疫磁珠法分離提取出實(shí)體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（孔令群等，人肝癌 血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)、鑒定及比較，中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28 (2) :236-238)，但是運(yùn)種 方法獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞的純度不高，并且由于體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命的自然極限（海弗利克極 限，Hayflicklimit,ShayJW,WrightWE:Hayflick,hislimit,andcellularageing,Nat RevMolCellBiol, 2000,I(I) :72-76),通常隨著時(shí)間的推延，培養(yǎng)的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)生 長(zhǎng)緩慢，有絲分裂停滯，細(xì)胞漸漸衰老死亡（CampisiJ=Replicativesenescence:an oldLives'tale? ,Cell, 1996, 84:497-500)。經(jīng)檢索專利數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利申請(qǐng) CN201510143871. 3,申請(qǐng)公布號(hào)為CN104726408A，發(fā)明名稱為"血管內(nèi)皮細(xì)胞的快速提取方 法"，該專利申請(qǐng)也公開(kāi)了用免疫磁珠法分離腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，包括W下步驟：用 眼科剪剪碎離體的腫瘤組織得到破碎腫瘤組織，用膠原酶和/或膜酶消化破碎腫瘤組織得 至IJ腫瘤單細(xì)胞；利用免疫磁珠法分選得到所述腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。應(yīng)該指出，該專利申請(qǐng)也 是采用"現(xiàn)用現(xiàn)取"方法獲得腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。迄今為止，本領(lǐng)域相關(guān)研究者只能采用新 鮮分離的腫瘤血管細(xì)胞作為材料，然而運(yùn)種每次"現(xiàn)用現(xiàn)取"的方法都需要消耗大量的時(shí)間 作細(xì)胞性能的鑒定，運(yùn)樣在人力、物力、財(cái)力上都是巨大的浪費(fèi)和低效。
[0004] 目前在市面上還沒(méi)有一株鑒定為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞系出售，運(yùn)種長(zhǎng)期W來(lái)缺乏穩(wěn) 定的腫瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞系及其體外培養(yǎng)體系已構(gòu)成了研究腫瘤血管生成機(jī)制W及血 管祀向藥物篩選的瓶頸問(wèn)題。因此，建立純化的人腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞模型勢(shì)在必行，特別是 獲得永生化的人腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞更是本領(lǐng)域研究人員翅首W吩的。
[0005] 近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，使體外培養(yǎng)細(xì)胞的有限壽命轉(zhuǎn)化為無(wú)限繁殖 的永生化細(xì)胞系成為可能，其基本原理是將可持續(xù)復(fù)制的外源基因插入到基因載體，然后 轉(zhuǎn)入到祀細(xì)胞（原代細(xì)胞），使該外源性基因能整合到祀細(xì)胞基因組中，從而獲得穩(wěn)定的永 生化細(xì)胞系。目前常用的可持續(xù)復(fù)制外源性基因有simianvirus401argeT(SV40-LT)病 毒基因，SV40-LT慢病毒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后可使細(xì)胞無(wú)限制繁殖即永生化轉(zhuǎn)化。因此，SV40-LT慢病毒是制備永生化細(xì)胞模型的常用工具（解慧琪，楊志明，屈藝，SV40與細(xì)胞永 生化，中國(guó)修復(fù)重建外科雜志2000,14(3) :170-174)。經(jīng)檢索專利數(shù)據(jù)庫(kù)，相關(guān)的應(yīng)用可見(jiàn) 中國(guó)專利申請(qǐng)CN01130757. 9,申請(qǐng)公布號(hào)為CN1336431A，發(fā)明名稱為"人卵巢癌永生化細(xì) 胞株的建立"，該專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種人卵巢癌永生化細(xì)胞株的建立方法，是將SV40T抗原 基因?qū)肴寺殉舶┰?xì)胞，經(jīng)篩選，抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一株體外長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳 代的人卵巢肉瘤樣癌細(xì)胞株BUPH:OVSC- 2,保藏號(hào)為NO. 0606。
[0006] 目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)SV40相關(guān)基因?qū)朐四[瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞或其他方 式建立的永生化人腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞株及其構(gòu)建的方法和鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系EC畑CC-1，本發(fā)明另一 目的在于提供該永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系EC畑CC-I的構(gòu)建方法和鑒定，本發(fā)明的第 S目的在于提供該永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系EC畑CC-I的應(yīng)用，為研究腫瘤血管生成 的調(diào)控W及血管祀向抗癌藥物的篩選提供根本的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案：考慮到被轉(zhuǎn)染的祀細(xì)胞是原代人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，常 規(guī)的轉(zhuǎn)染技術(shù)（即物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)W及生物介導(dǎo)中的一些病毒如腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病 毒）對(duì)運(yùn)種真核原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率極低，因而很難建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。對(duì)此，本發(fā)明 采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建SV40-LT慢病毒載體（SV40-LTLentiviralvector)(見(jiàn)圖1)， 其中包含有SV40-LT基因（PSV40)和用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染篩選的抗嚷嶺霉素基因（Puro)。由 于考慮到被該病毒轉(zhuǎn)染的祀細(xì)胞在下一步應(yīng)用中會(huì)用到帶巧光報(bào)告基因（比如GFP)的轉(zhuǎn) 染方法，所W構(gòu)建SV40-LT慢病毒載體中沒(méi)有攜帶GFP基因。在制備祀細(xì)胞方面，本發(fā)明采 用CD31免疫磁珠聯(lián)合流式細(xì)胞儀雙分選技術(shù)，高度純化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞：首先用磁珠 富集肝癌組織中血管內(nèi)皮，培養(yǎng)傳代到第6代時(shí)，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步純化血管內(nèi)皮細(xì) 胞。本發(fā)明的另一個(gè)創(chuàng)新舉措是，用先進(jìn)的流式細(xì)胞分選儀對(duì)經(jīng)嚷嶺霉素多次篩選后的活 細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選純化，確保穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的祀細(xì)胞是CD31陽(yáng)性肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，是提供了一種永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系EC畑CC-1，其保 藏號(hào)為CCTCCNO:C2015172,于2015年10月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、。
[0010] 本發(fā)明的第二方面，提供了該永生化人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞系ECD肥C-I的構(gòu)建方 法和鑒定。
[0011] 本發(fā)明的構(gòu)建方法包括：
[0012] A、分離提取人肝癌（中分化）組織血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0013] B、原代人肝癌血管細(xì)胞的培養(yǎng)及培養(yǎng)體系。
[0014] C、構(gòu)建SV40-LT慢病毒載體，用該病毒轉(zhuǎn)染原代人肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，并藥物篩 選出陽(yáng)性細(xì)胞。
[0015] D、用流式細(xì)胞儀單細(xì)胞模板分選，高度純化攜帶SV40-LT基因的CD31陽(yáng)性細(xì)胞。
[0016] 步驟A具體為：經(jīng)知情同意和醫(yī)學(xué)倫理批準(zhǔn)，取人肝癌（中分化）手術(shù)切除新鮮標(biāo) 本，經(jīng)酶消化分解組織，制備單細(xì)胞懸液。隨后進(jìn)行CD31免疫磁珠分選，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)傳代至 6代時(shí)，用流式細(xì)胞儀分選，進(jìn)一步純化CD31陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0017] 步驟B具體為：將步驟A獲得的CD31陽(yáng)性細(xì)胞懸浮在T25培養(yǎng)瓶含ECM完全培養(yǎng) 基，置37 °C，5 %C〇2, 95 %濕度的解箱中培養(yǎng)。ECM完全培養(yǎng)基：ECMW%胎牛血清+1 %ECGS+ 青霉素100單位/mL+鏈霉素100yg/mL。
[0018] 步驟C具體為：構(gòu)建SV40-LT慢病毒載體，制備病毒，將該病毒轉(zhuǎn)入純化的原代 肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，在培養(yǎng)中加入嚷嶺霉素，篩選出陽(yáng)性細(xì)胞并繼續(xù)傳代培養(yǎng)。用實(shí)時(shí)定量 PCR儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的SV40-LT基因表達(dá)，確認(rèn)SV40-LT已整合到祀細(xì)胞的基因組里。
[0019] 步驟D具體為：收集經(jīng)多次嚷嶺霉素處理篩選的SV40-LT慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用 CD31巧光抗體染色，設(shè)置流式細(xì)胞儀抓FACSAriaII單細(xì)胞分選模板，進(jìn)行CD31陽(yáng)性單細(xì) 胞提取，機(jī)器自動(dòng)收集細(xì)胞到含有ECM完全培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板，每孔1個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞 培養(yǎng)形成單克隆后，膜酶消化制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行CD31抗體染色，進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀 再次分析血管內(nèi)皮細(xì)胞的純化度。
[0020] 步驟D之后，本發(fā)明的構(gòu)建方法還包括：傳代培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇。
[0021] 凍存：在細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，吸除培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基，經(jīng)膜酶消化制備單細(xì)胞懸 液，用凍存液（90 %的胎牛血清和10 %的DMSO)調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO6~2X10VmU分裝1血 細(xì)胞懸液至EP管，置入凍存盒并存放到-80°C過(guò)夜，次日移入液氮。
[0022] 復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速置于37°C溫水中，將細(xì)胞懸液吸至離屯、管中， 15(K)r/min，離屯、lOmin，棄去上清液，用ECM