在轉(zhuǎn)錄方向上的 可操作地連接的組分，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、目的DNA和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的控制元件。選擇在哺乳動 物細胞中有功能的控制元件。產(chǎn)生的包含可操作地連接的組分的構(gòu)建體側(cè)接（5'和3'）有 功能的AAV ITR序列。
[0039] "腺伴隨病毒反向末端重復(fù)"或"AAV ITR"意指在AAV基因組的每一端發(fā)現(xiàn)的本領(lǐng) 域公知的區(qū)域，其以順式一同作為DNA復(fù)制起點并且作為病毒的包裝信號。AAV ITR，與AAV r印編碼區(qū)一同，提供從表達它們的質(zhì)粒中的有效刪除。
[0040] 已知AAV ITR區(qū)的核苷酸序列。如本文使用的，"AAV ITR"不需要具有描述的野 生型核苷酸序列，但可以被修飾，例如通過核苷酸的插入、刪除或取代。此外，AAV ITR可以 源自幾種AAV血清型的任一種，包括但不限于，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此 夕卜，在AAV載體中側(cè)接所選擇的核苷酸序列的5'和3' ITR不需要一定相同或來源于相同 的AAV血清型或分離物，只要它們的功能如預(yù)期的，S卩，允許從載體刪除和拯救目的序列和 將期望的基因組包裝入AAV病毒體。
[0041] 在一個實施方案中，AAV ITR可以源自幾種AAV血清型的任一種，包括但不限于， AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，在AAV表達載體中側(cè)接選擇的核苷酸序列的 5'和3' ITR不需要一定相同或來源于相同的AAV血清型或分離物，只要它們的功能如預(yù)期 的，即，允許從載體刪除和拯救目的序列和允許將期望的基因組包裝入AAV病毒體。
[0042] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供腺伴隨病毒（AAV)載體，其包含可操作地連接至表 達盒的如上文所述的填充物組分。在某些實施方案中，表達盒包含啟動子。在某些實施方 案中，啟動子是pol III啟動子。在某些實施方案中，啟動子是mU6啟動子。在某些實施方 案中，AAV載體進一步包含靶序列。在某些實施方案中，靶序列是RNAi分子。
[0043] 如本文使用的"表達盒"意指能夠在合適的宿主細胞中指導(dǎo)特定核苷酸序列表達 的核酸序列，其可以包括可操作地連接至目的核苷酸序列的啟動子，所述目的核苷酸序列 可以可操作地連接至終止信號。編碼區(qū)通常編碼目的功能RNA，例如RNAi分子。包括目的 核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的。表達盒還可以是天然存在的但是已經(jīng)以用于異源表達 的重組形式獲得的表達盒。
[0044] 雙鏈RNA (dsRNA)可以通過稱為RNA干擾（RNAi)的過程在很多生物中誘導(dǎo)序列 特異性的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。RNA片段是RNAi的序列特異性的介體。通過這些RNA干擾 (RNAi)分子的基因表達干擾如今被公認為在很多生物的細胞中沉默基因的天然存在的策 略。
[0045] 本發(fā)明某些實施方案提供編碼分離的RNAi分子的載體。如本文使用的術(shù)語 "由……編碼"以廣義使用，類似于在專利術(shù)語中的術(shù)語"包含"。RNAi分子包括siRNA、shRNA 和其他小RNA，其可以或有能力調(diào)節(jié)靶基因的表達，例如通過RNA干擾。這樣的小RNA包括 但不限于，shRNA 和微 RNA (miroRNA, miRNA)。
[0046] "可操作地連接"指在單一核酸片段上核酸序列的連接，從而使得序列之一的功能 受另一個所影響。例如，將調(diào)節(jié)DNA序列稱為"可操作地連接至"編碼RNA或多肽的DNA序 列或"與其連接"，如果這兩個序列處于這樣的位置，從而使得調(diào)節(jié)DNA序列影響編碼DNA序 列的表達（即，編碼序列或功能RNA在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)。編碼序列可以以有義或反 義方向可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。
[0047] 可操作地連接的核酸是位于與另一核酸序列的功能關(guān)系中的核酸。例如，啟動子 或增強子可操作地連接至編碼序列，如果其影響所述序列的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點可操 作地連接至編碼序列，如果它這樣放置從而使得促進翻譯。通常，可操作地連接的DNA序列 是連續(xù)連接的DNA序列。然而，增強子不必是連續(xù)的。連接通過在方便的限制性位點連接 來完成。如果這樣的位點不存在，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭（adaptor) 或接頭（linker)。
[0048] 本發(fā)明現(xiàn)將通過以下非限制性實施例來說明。
[0049] 實施例1 生成包含AAV2 ITR、mU6啟動子、miHDSl靶序列、填充物組分填充片段和AAV骨架的 質(zhì)粒FBAAVmU6miHDSl填充片段（圖1)。5pFBAAVmU6miHDSlAAV填充片段的序列在圖2中提 供，并且該質(zhì)粒的單獨組分的序列在圖3中提供。全長的填充物組分("填充片段序列"）由 3776個核苷酸組成。
[0050] 實施例2 比較表達miHDSl的載體的體內(nèi)沉默效率。構(gòu)建4種載體：（1)表達控制序列（miSAFE) 并且包含控制序列（eGFP)的載體，（2)表達靶序列（miHDSl)并且包含控制序列（eGFP)的 載體，（3)表達控制序列（miSAFE)并且包含實施例1中所述的填充片段序列的載體，和（4) 表達靶序列（miHDS 1)并且包含實施例1中所述的填充片段序列的載體。 {I} AAV2/1 mU6mBAFE - eGFP《4 Jl Kl 2 pg/ml| (2) AAV2/1 mlJ6miHDSl eGFP {4.81 EO pg/ml) (3) AAVin mlJ6miSAFK- !ΛΑ?S-1? (4J1E12 μ&/?ιι1) (4) ΛΛ￥2/1 niU6miHDSl - Ifi/tM ? (4J1E12 pg/ml)
[0051] miSAFE和miHDSl的序列在先前已有討論(見，PCT/US2012/024904,其在此以其整 體通過引用并入本文)。野生型小鼠在紋狀體中注射4種載體。小鼠在1個月后處死并且 通過QPCR測定相對于Actb表達水平的Htt表達。圖4顯示在misafe/eGFP和miHDSl / eGFP表達盒之間存在表達20%的降低，而在mi safe/填充片段和miHDSl /填充片段表達盒 之間存在表達60%的降低，S卩，當(dāng)使用填充片段時，表達降低60%。
[0052] 實施例3 生成包含AAV2 ITR、mU6啟動子、miHDSl靶序列、填充物組分填充片段和AAV骨架的質(zhì) 粒5pFBAAVmU6miHDSl填充片段（圖5)。質(zhì)粒5pFBAAVmU6miHDSl AAV-填充片段的序列在圖 6中提供。填充片段(填充片段#2)的序列在圖7中提供。
[0053] 實施例4 AAV包裝的考慮因素之一是維持最佳的基因組大小。當(dāng)這發(fā)生時，將缺少基因組的形式 的病毒體的比例降到最低。進行測試新填充片段序列的包裝效率的實驗并且發(fā)現(xiàn)高效率的 包裝。例如，見表1"平均空的（Average empty)"和圖8。如果進行包裝的遺傳材料包含非 miRNA :內(nèi)含子填充片段序列，則也測量它。發(fā)現(xiàn)用于病毒產(chǎn)生的非計劃中的（unintended) 基因組材料的摻入是極低的（Cap/rAAV、Amp/rAAV、Gent/rAAV)。最終，病毒質(zhì)量通過在聚 丙烯酰胺凝膠電泳后的銀染色進行分析，并且發(fā)現(xiàn)包含合適比例的各種衣殼蛋白（VPl、VP2 和VP3;圖9)。總之，內(nèi)含子I/II填充片段序列允許將期望的轉(zhuǎn)基因包裝入AAV衣殼的最 佳包裝。
[0054] 全部公開、專利和專利申請通過引用并入本文。雖然在前述說明書中本發(fā)明已經(jīng) 關(guān)于其某些優(yōu)選的實施方案進行了描述，并且很多細節(jié)已經(jīng)為說明目的而進行陳述，但對 本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是本發(fā)明允許額外的實施方案，并且本文描述的某些細節(jié)可 以在不背離本發(fā)明基本原則的情況下進行相當(dāng)大地改變。
[0055] 在描述本發(fā)明的情況下使用的術(shù)語"一個（a)"和"一個（an)"和"所述（the)"和 相似的指示物，應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非本文另有說明或在上下文中明顯矛盾。術(shù)語 "包含（comprising)"、"具有（having)"、"包括（including)" 和"含有（containing)" 應(yīng)解 釋為開放式（open-ended)術(shù)語（S卩，意為"包括，但不限于")，除非另有注釋。本文的值的范 圍的詳述僅僅旨在作為單獨地指每一獨立的值落入所述范圍內(nèi)的速記方法，除非本文另有 說明，并且每一獨立的值如同其被本文單獨地描述一樣并入本說明書中。本文描述的所有 方法可以以任何合適的順序?qū)嵤潜疚牧碛姓f明或另外在上下文中明顯矛盾。本文提 供的任何和全部實例、或示例性語言(例如"例如（such as ) ")的使用，僅僅旨在更好地說明 本發(fā)明并且不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，除非另有聲明。在說明書中的任何語言均不應(yīng)解 釋為表示對于本發(fā)明的實踐是必需的任何未聲明的要素。
[0056] 本文描述了本發(fā)明的實施方案，其包括本發(fā)明人已知的實施本發(fā)明的最佳模式。 那些實施方案的變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言基于閱讀前文描述可以是顯而易見的。 本發(fā)明人期望技術(shù)人員合適地采用此類變化，并且本發(fā)明人旨在本發(fā)明以與本文明確描述 不同的其他方式來實踐。因此，本發(fā)明包括由適用法律允許的在本文附帶的權(quán)利要求中描 述的主題的所有修改和等同方案。此外，上述要素在其所有可能變化中的任何組合均包括 于本發(fā)明中，除非本文另有說明或另外在上下文中明顯矛盾。
【主權(quán)項】
1. 腺伴隨病毒（AAV)填充物組分，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2具有至少 90%同一性的長度為3300-4200個核苷酸的核酸。
2. 腺伴隨病毒（AAV)填充物組分，其由與SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2具有至少90% 同一'I"生的長度為3300-4200個核苷酸的核酸組成。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的AAV填充物組分，其中所述核酸為3500-4000個核苷酸。
4. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的AAV填充物組分，其中所述核酸為3700-3850個核苷酸。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項的AAV填充物組分，其中所述核酸與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2具有至少95%的同一性。
6. 腺伴隨病毒（AAV)載體，其包含可操作地連接至表達盒的權(quán)利要求1至5中任一項 的填充物組分。
7. 權(quán)利要求6的AAV載體，其中所述表達盒包含啟動子。
8. 權(quán)利要求7的AAV載體，其中所述啟動子是pol III啟動子。
9. 權(quán)利要求8的AAV載體，其中所述啟動子是mU6啟動子。
10. 權(quán)利要求6至9中任一項的AAV載體，其進一步包含靶序列。
11. 權(quán)利要求10的AAV載體，其中所述靶序列是RNAi分子。
【專利摘要】公開了包含長度為3300-4200個核苷酸的核酸的腺伴隨病毒填充物組分。
【IPC分類】C12N5-00, C12N7-00, C12N15-00
【公開號】CN104619832
【申請?zhí)枴緾N201380035802
【發(fā)明人】B.L.戴維森, M.希爾, R.布德羅
【申請人】衣阿華大學(xué)研究基金會
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2013年3月14日
【公告號】CA2878401A1, EP2870237A1, US20150184197, WO2014007858A1