專利名稱：：自補aav介導的干擾rna分子遞送以治療或預防眼病的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過自補(self-complementary)腺伴隨病毒(scAAV)載體向患者的眼遞送干擾RNA分子的方法。本發(fā)明亦涉及向有此需要的患者施用本發(fā)明的干擾RNA分子-scAAV載體以治療眼病(oculardisorder)的方法。
背景技術：
：RNA干擾(RNAi)是用雙鏈RNA(dsRNA)來使基因表達沉默的過程。RNAi由短(即<30個核苷酸)雙鏈RNA(“dsRNA”)分子誘發(fā)，所述分子存在于細胞內(Fire等人，1998，Nature391806~811)。這些被稱為“短干擾RNA”或“siRNA”的短dsRNA分子導致與所述siRNA享有序列同源性的信使RNA(“mRNA”)降解至單個核苷酸水平(resolution)(Elbashir等人，2001，GenesDev,15188-200)人們相信siRNA的一條鏈并入已知為RNA-誘導沉默復合體(RISC)的核糖核蛋白中。RISC用這條siRNA鏈來鑒定與所并入的siRNA鏈至少部分互補的mRNA分子，然后切割這些靶mRNA或抑制它們的翻譯。siRNA看來像多周轉(multiple-turnover)酶一樣被回收利用，1個siRNA分子能夠引起大約1000個mRNA分子的切割。因此，siRNA介導的RNAi降解比現(xiàn)有的抑制靶基因表達的技術更有效。RNAi提供了一種非常讓人興奮的治療以及/或者預防疾病的手段。與各種傳統(tǒng)療法相比，RNAi的一些主要好處包括，RNAi高特異性地靶向與疾病過程相關的非常特異的基因，從而減少或者消除靶效應的能力；RNAi是正常的細胞過程，它導致高度特異的RNA降解及其基因沉默效應的細胞間擴散；并且，RNAi不像很多基于抗體的療法那樣觸發(fā)宿主免疫應答。用siRNA來特異性體內靶向和敲除眼疾病靶基因與遞送siRNA至小梁網(wǎng)(TM)靶組織中的某些物理限制有關。另外，由于核酸通常具有短的玻璃體內半衰期，為了實現(xiàn)干擾RNA的連續(xù)存在，可能需要反復的眼內注射?；谶@些原因，需要長期遞送的方法。已有一些干擾RNA遞送的方法正在被測試/開發(fā)用于體內使用。例如，可將siRNA在鹽溶液中“裸露地”遞送；與聚陽離子、陽離子脂質/脂質轉染試劑或陽離子肽絡合遞送；作為特定分子綴合物(例如膽固醇修飾的siRNA、TAT-DRBD/siRNA復合體)的組分遞送；作為脂質體的組分遞送；以及作為納米顆粒的組分遞送。用玻璃體內或前眼房(intracameral)遞送的腺病毒shRNA的TM的病毒轉導是一種可能的手段，但是這有來自在人中使用的一些不利后果，包括由抗腺病毒應答消除而導致的瞬時表達。腺伴隨病毒(AAV)由單鏈DNA基因組組成，它們毒性有限，已經(jīng)被用作基因療法的病毒載體。遺憾的是，AAV無法有效地轉導TM細胞。由于這些方法已經(jīng)示出不同程度的成功，仍然需要新的改良的方法來體內遞送siRNA分子以實現(xiàn)并增強RNAi的治療潛力。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在患者的眼中減弱靶mRNA表達的方法，包括(a)提供含有干擾RNA分子的自補腺伴隨病毒(scAAV)載體；及(b)將該scAAV載體施用至患者眼，其中干擾RNA分子能減弱眼中靶mRNA的表達。一方面，患者有眼病，諸如眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況(ocularinflammatoryconditions)、眼高血壓(ocularhypertension)或青光眼。另一方面，干擾RNA分子靶向與眼病相關的基因，所述眼病諸如眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況、眼高血壓或青光眼。例如通過眼內注射、眼局部應用(oculartopicalapplication)、靜脈內注射、口服施用、肌內注射、腹膜內注射、經(jīng)皮用(transdermalapplication)或經(jīng)黏膜用(transmucosalapplication)來施用載體。本發(fā)明也提供了含有自補腺伴隨病毒(scAAV)載體的藥物組合物，所述載體攜帶有治療有效量的干擾RNA分子和眼科可接受的載體，其中干擾RNA分子能減弱與眼病相關基因的表達。scAAV載體可以被包裝(package)進scAAV病毒粒體中。本發(fā)明的具體的優(yōu)選實施方案將從下面對某些優(yōu)選實施方案的更詳細描述和權利要求中顯而易見。發(fā)明詳述在此所述詳細情況采取舉例方式，僅用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的說明性討論，其目的是為了提供本發(fā)明的各種實施方案之原理及概念方面被認為是最有用、最易懂的描述。在這點上，未試圖顯示比本發(fā)明的基本理解所需的那些更詳細的本發(fā)明的結構細節(jié)，與附圖和/或實施例相關的描述使得本領域的技術人員清楚知道本發(fā)明的多種形式如何具體到實踐中。以下的定義及解釋，除非在接下來的實例中清楚無疑地被更改、或者該意義的使用導致任何的釋義無意義或基本無意義，否則便意味且意圖以任何將來的釋義限定。在某術語的釋義會導致該術語無意義或基本無意義的情況下，該定義應從第三版韋氏詞典(Webster'sDictionary)或本領域技術人員公知的詞典，諸如牛津生物化學及分子生物學i司典(OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology)(AnthonySmith編輯，牛津大學出版社(OxfordUniversityPress)，牛津，2004)中得出。本文中用的所有百分比，除非另外說明，皆指以重量計的百分比。本文所用的術語單數(shù)形式(“a”和“an”)，除非另外說明，否則意為“一個(one)”，“至少一個(atleastone)”或者“一個或更多(oneormore)”。除非上下文另有需要，否則本文所用的單數(shù)術語應當包括復數(shù)形式，而復數(shù)術語應當包含單數(shù)形式。在某些實施方案中，本發(fā)明提供減弱患者眼內靶mRNA表達的方法，其包括(a)提供自補腺伴隨病毒(scAAV)載體，該載體含有靶向在眼內表達的基因的干擾RNA分子；以及(b)施用該scAAV載體至患者眼，其中干擾RNA分子可以減弱眼中靶mRNA的表達。在特定的實施方案中，該scAAV載體被包裝(package)于scAAV病毒粒體中。在某些實施方案中，本發(fā)明提供預防或治療患者眼病的方法，所述方法包括(a)提供自補腺伴隨病毒(scAAV)載體，該載體含有靶向與眼病相關基因的干擾RNA分子；以及(b)施用該scAAV載體至患者眼，其中干擾RNA分子可以減弱與眼病相關基因的表達。scAAV載體可被包裝(package)于scAAV病毒粒體中。在特定的實施方案中，眼病與升高的眼內壓(IOP)，比如眼高血壓或青光眼有關。本文中使用的術語“患者”是指患有眼病或處于患上眼病風險的人或其他哺乳動物。與此類病相關的眼部結構可以包括例如眼(eye)、視網(wǎng)膜、脈絡膜、晶狀體、角膜、小梁網(wǎng)、虹膜、視神經(jīng)、視神經(jīng)頭、鞏膜、前段或后段、或睫狀體。在一些實施方案中，患者患有與小梁網(wǎng)(TM)細胞、睫狀上皮細胞或眼的其它細胞類型相關的眼病。本文中所用的術語“眼病”包括與眼血管生成、干眼、炎癥狀況、眼高血壓相關的狀況，以及與升高的眼內壓(IOP)如青光眼相關的眼疾病。本文中所用的術語“眼血管生成”包括例如，眼血管生成前狀況(ocularpre-angiogenicconditions)及目艮血管生成狀況(ocularangiogeniccondition)，并包括眼血管生成、眼新血管形成、視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、與視網(wǎng)膜缺血相關的后遺癥、后段新血管形成(PSNV)以及新生血管性青光眼。例如，本發(fā)明的方法中使用的干擾RNA在治療下述患者中有用，所述患者患有眼血管生成、眼新血管形成、視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、與視網(wǎng)膜缺血相關的后遺癥、后段新血管形成(PSNV)以及新生血管性青光眼，或者所述患者處于發(fā)展此類狀況的風險。術語“眼新血管形成”包括年齡相關性黃斑變性、白內障、急性缺血性視神經(jīng)病變(AION)、視網(wǎng)膜震蕩、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜撕裂或視網(wǎng)膜裂孔、醫(yī)源性視網(wǎng)膜病變及其他缺血性視網(wǎng)膜病變或視神經(jīng)病變、近視、色素性視網(wǎng)膜炎和/或諸如此類。本文中所用的術語“炎癥狀況”包括例如眼部炎癥及過敏性結膜炎等狀況。本文中所用的術語“重組AAV(rAAV)載體”是指來自重組AAV的含有至少一個末端重復序列的核酸。自補AAV(scAAV)載體含有雙鏈載體基因組，該基因組通過從一個rAAVTR刪除末端解離位點(terminalresolutionsite,TR)而形成，防止了在被突變端的復制起始。這些構建體生成單鏈、反向重復序列基因組，該基因組在每一端有野生型(wt)TR，在中間有突變的TR。已知數(shù)種天然存在及雜種的AAV血清型，包括AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11(Choi等人，2005，Curr.GeneTher.5:299_310)。本領域技術人員會知道scAAV載體可以基于以上任意或其他AAV血清型來產(chǎn)生。本文中所用的短語“scAAV病毒粒體”是指含有scAAV載體和蛋白外殼的完整病毒顆粒，根據(jù)本文所述發(fā)明，它能夠感染宿主細胞并將干擾RNA分子遞送到宿主細胞中。Xu等人(2005，MolTherll:523_530)和Borras等人(2006，JGeneMed8589-602)進一步論述了含有干擾RNA分子(比如本文所提供的那些)的scAAV載體及scAAV病毒粒體的產(chǎn)生。Xu等人用scAAV載體將siRNA遞送到抗多種藥物性人乳腺癌和口癌細胞中，以抑制MDRl基因表達。Borras等人展示了高效scAAV轉導人小梁網(wǎng)(TM)細胞和人TM器官灌注培物(perfusionorganculture)。另外，Yokoi，K等人(2007，InvestOphthalmolVisSci，48:3324_3328)向視網(wǎng)膜下間隙(subretinalspace)注射2型scAAV載體并觀察到綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜上皮細胞表達。本發(fā)明的方法可用于使用RNA干擾減弱患者眼中特定基因的表達。RNA干擾(RNAi)是用雙鏈RNA(dsRNA)來沉默基因表達的方法。盡管不希望受到理論限制，RNAi由RNaseIII樣酶dicer將較長的dsRNA切成小段干擾RNA(siRNA)開始。siRNA是長度通常為大約19到28個核苷酸、或20到25個核苷酸、或21到22個核苷酸的dsRNA，通常包含2個核苷酸的3’突出端，以及5’磷酸和3’羥基末端。siRNA的一條鏈并入已知為RNA誘導沉默復合體(RISC)的核糖核蛋白復合體中。RISC用這條siRNA鏈來鑒定與所并入的siRNA鏈至少部分互補的mRNA分子，然后切割這些靶mRNA或抑制它們的翻譯。因此，這條并入RISC的siRNA鏈已知為指導鏈或反義鏈。另一條siRNA鏈，已知為過客鏈或有義鏈，從siRNA中被排除掉并且與靶mRNA至少部分同源。本領域的技術人員會意識至IJ，原則上siRNA的任意一條鏈都可以并入RISC中并發(fā)揮指導鏈的功能。但是siRNA的設計(例如在期望的指導鏈5’端減少的雙鏈體穩(wěn)定性)可以有利于期望的指導鏈并入RISC中。siRNA的反義鏈是siRNA的主動指導物(activeguidingagent)，因為所述反義鏈被并入RISC，從而使得RISC能鑒定與反義siRNA鏈至少部分互補的靶mRNA用于切割或翻譯抑制。具有與指導鏈至少部分互補的序列的mRNA的RISC-介導的切割導致該mRNA和由這一mRNA所編碼的相應蛋白質的穩(wěn)態(tài)水平的降低?？蛇x地，RISC還可以通過無靶mRNA切割的翻譯阻抑來降低相應蛋白質的表達。干擾RNA似乎是以催化方式作用用于對靶mRNA的切割，也就是說，干擾RNA能以亞化學計量的量來達到靶mRNA的抑制。與反義療法相比，在這種切割條件下，提供療效所需的干擾RNA顯著更少。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了遞送干擾RNA以抑制靶mRNA表達，從而降低患有眼病的患者中靶mRNA水平的方法。本文中所用的短語“減弱靶mRNA表達”是指施用或表達一定量的干擾RNA(例如siRNA)，以通過mRNA切割或通過直接翻譯抑制，來降低靶mRNA向蛋白質的翻譯。本文所用的術語“抑制”、“沉默”以及“減弱”，是指與沒有本發(fā)明方法中使用的干擾RNA存在時靶mRNA或相應蛋白質的表達相比，該靶mRNA或相應蛋白質的表達可測量的降低。靶mRNA或相應蛋白質表達的降低通常被稱為“敲低(knock-down)”，并且被報道為相對于非靶向對照RNA(例如非靶向對照siRNA)的施用或表達后存在的水平。本文的實施方案預期將表達敲低50%至100%之間(包括端點)的量。但達到這樣的敲低水平并非本發(fā)明的目的所必需的。通過用定量聚合酶鏈式反應(qPCR)擴增來測量mRNA水平或通過用Western印跡法或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測量蛋白質水平來通常評估敲低。分析蛋白質水平提供了對mRNA切割和翻譯抑制二者的評估。其它測量敲低的技術包括RNA溶液雜交、核酸酶保護、Northern雜交、用微陣列的基因表達監(jiān)控、抗體結合、放射免疫測定和熒光激活細胞分析。通過觀察眼病癥狀的改善，可以推斷出在人或其它哺乳動物中干擾RNA分子減弱了靶基因的表達，包括例如，例如眼內壓降低指示了青光眼靶基因的抑制。在一個實施方案中，單種干擾RNA分子被遞送以降低靶mRNA水平。在其他實施方案中，兩種或多種靶向mRNA的干擾RNA被施用以降低靶mRNA水平?？梢栽谕粋€scAAV載體或分別的載體中遞送干擾RNA0本文所用的術語“干擾RNA”及“干擾RNA分子”是指所有能與RISC相互作用并參與RISC介導的基因表達變化的RNA或RNA樣分子。其他能與RISC相互作用的干擾RNA分子的實例包括短發(fā)夾RNA(shRNA)、單鏈siRNA、微小RNA(miRNA)及dicer-底物27_mer雙鏈體。能與RISC相互作用的“RNA樣”分子的實例包括siRNA、單鏈siRNA、微小RNA以及shRNA分子，所述分子含有一個或多個經(jīng)化學修飾的核苷酸、一個或多個非核苷酸、一個或多個脫氧核糖核苷酸，以及/或者一個或多個非磷酸二酯鍵。因此，siRNA、單鏈siRNA、shRNA、miRNA以及dicer-底物27_mer雙鏈體是“干擾RNA”或“干擾RNA分子”的子集。本文中所用的術語“siRNA”，除非另外說明，否則都是指雙鏈干擾RNA。本發(fā)明的方法中使用的siRNA通常是含有兩條核苷酸鏈的雙鏈核酸分子，每條鏈有大約19到大約28個核苷酸(即約19，20，21，22，23，24，25，26，27或28個核苷酸)。本發(fā)明方法中使用的干擾RNA通常有約19到約49個核苷酸的長度。當提到雙鏈干擾RNA時，短語“19到49個核苷酸長”是指反義鏈和有義鏈獨立地有約19到約49個核苷酸的長度，包括其中有義鏈和反義鏈通過接頭分子連接起來的干擾RNA分子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單鏈干擾RNA實現(xiàn)mRNA沉默，盡管不如雙鏈RNA有效。因此，本發(fā)明的實施方案也提供了施用單鏈干擾RNA。與上述關于雙鏈干擾RNA—樣，單鏈干擾RNA長約19到大約49個核苷酸。單鏈干擾RNA具有5’磷酸或者在5’位置被原位或體內磷酸化。術語“5’磷酸化”用于描述例如具有磷酸基團的多核苷酸或寡核苷酸，該磷酸基團在該多核苷酸或寡核苷酸的5’端以酯鍵與糖(例如核糖、脫氧核糖或者其類似物)的C5羥基相連。單鏈干擾RNA可以化學合成或通過體外轉錄合成，或從本文所述(根據(jù)雙鏈干擾RNA)的載體或表達盒內源性表達。5’磷酸基團可通過激酶添加，或者5’磷酸可以是核酸酶切割RNA的結果。發(fā)夾干擾RNA是單分子(比如單寡核苷酸鏈)，它含有以莖-環(huán)或發(fā)夾結構(如shRNA)的干擾RNA的有義鏈和反義鏈。例如，shRNA可從這樣DNA載體表達，該載體中編碼有義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸通過短的間隔區(qū)與編碼反向互補反義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸相連。如果所選擇的表達載體需要，可以添加3’末端T’s和形成限制性位點的核苷酸。得到的RNA轉錄產(chǎn)物折疊到自己上形成莖_環(huán)結構。本文中所用的短語“靶序列”和“靶mRNA”是指能被本發(fā)明方法中所用的干擾RNA識別的mRNA或mRNA序列的部分，其中干擾RNA如本文所述沉默基因表達。使用可用的設計工具來選擇在靶mRNA序列內的干擾RNA靶序列(如siRNA靶序列)。提供了用于選擇siRNA的靶序列的技術，例如，通過由Tuschl，T.等人，"ThesiRNAUserGuide,“(2004年5月6日修訂，可以在RockefellerUniversity網(wǎng)站獲??；技術公報#506，“siRNADesignGuidelines,“AmbionInc(Ambion的網(wǎng)站)；和其他基于網(wǎng)頁的設計工具，例如在Invitrogen、Dharmacon、IntegratedDNATechnoIogies>Genscript或Proligo網(wǎng)站提供。最初的搜索參數(shù)可以包括35%到55%之間的G/C含量和19到27個核苷酸的siRNA長度。靶序列可以位于mRNA的編碼區(qū)或者5’或3’非翻譯區(qū)中。靶序列可用于衍生干擾RNA分子，例如此處所述的那些?？梢酝ㄟ^轉染表達靶mRNA的細胞隨后評估如此處所述的敲低來體外測試對應于靶序列的干擾RNA?？梢允褂帽绢I域技術人員已知動物模型在體內進一步評估干擾RNA。可如下在體外評估干擾RNA敲低例如HeLa細胞中內源性靶基因表達水平的能力。在轉染前24小時將HeLa細胞平板接種在標準生長培養(yǎng)基(例如，補充了10%胎牛血清的DMEM)中。使用例如Dharmafect1(Dharmacon,Lafayette,CO)根據(jù)生產(chǎn)商的教導以0.InM到IOOnM的干擾RNA濃度進行轉染。將SiCONTROL非靶向siRNA#l和siCONTROL親環(huán)蛋白BSiRNA(Dharmacon)分別用作陰性和陽性對照。在轉染后24小時通過qPCR評估靶mRNA水平和親環(huán)蛋白BmRNA(PPIB,NM_000942)水平，使用例如優(yōu)選覆蓋靶位點的TAQMAN基因表達測定法(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)。當轉染效率是100%時，陽性對照siRNA給出了親環(huán)蛋白BmRNA的基本完全的敲低。因此，通過參考轉染了親環(huán)蛋白BsiRNA的細胞中親環(huán)蛋白BmRNA水平來就轉染效率校正靶mRNA敲低?？梢栽谵D染后約72小時(實際的時間取決于蛋白質更新率)通過例如western印跡評估靶蛋白水平。用于從培養(yǎng)的細胞分離RNA和/或蛋白質的標準技術是本領域技術人員已知的。為了降低非特異性、脫靶效應的機會，使用干擾RNA的最低可能的濃度，其將產(chǎn)生希望水平的靶基因表達敲低。人角膜上皮細胞或其它人眼細胞系也可用于評估干擾RNA對內源靶基因的敲低水平的能力。在某些實施方案中干擾RNA分子-配體綴合物含有干擾RNA分子，其靶向與眼病相關的基因。設計本發(fā)明的干擾RNA以靶向的mRNA靶基因的實例包括與影響視網(wǎng)膜的病癥相關的基因，與青光眼相關的基因，和與眼炎癥相關的基因。與視網(wǎng)膜病癥相關的mRNA靶基因的實例包括酪氨酸激酶，內皮(TEK)；補體因子B(CFB)；低氧誘導因子1，α亞基(HIFlA)；HtrA絲氨酸肽酶1(HTRAl)；血小板-衍生生長因子受體β(PDGFRB)；趨化因子，CXC基序，受體4(CXCR4)；胰島素樣生長因子I受體(IGFlR)；血管生成素2(ANGPT2)；v-fosFBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FOS)；組織蛋白酶Li，轉錄變體I(CTSLl)；組織蛋白酶Li，轉錄變體2(CTSL2)；胞內黏著分子1(ICAMl)；胰島素樣生長因子I(IGFl)；整聯(lián)蛋白a5(ITGA5)；整聯(lián)蛋白β1(ITGBl)；核因子κ-B，亞基1(NFKBl)；核因子κ-B，亞基2(NFKB2)；趨化因子，CXC基序，配體12(CXCL12)；腫瘤壞死因子-α-轉化酶(TACE)；以及激酶插入結構域受體(KDR)。和青光眼相關的靶基因的實例包括碳酸酐酶II(CA2)；碳酸酐酶IV(CA4)；碳酸酐酶XII(CA12)；β1腎上腺素能受體(ADBRl)；β2腎上腺素能受體(ADBR2)；乙酰膽堿酯酶(ACHE)；Na+/K+-ATP酶；溶質載體家族12(鈉/鉀/氯化物轉運蛋白)，成員1(SLC12A1)’溶質載體家族12(鈉/鉀/氯化物轉運蛋白)，成員2(SLC12A2)；結締組織生長因子(CTGF)；血清淀粉樣A(SAA)；分泌的frizzled-相關蛋白1(sFRPl)；gremlin(GREMl)；賴氨酰氧化酶(LOX)、c-Maf；rho-相關的含卷曲螺旋的蛋白激酶I(ROCKl)；rho-相關的含卷曲螺旋的蛋白激酶2(R0CK2)；纖溶酶原激活物抑制劑I(PAIl)；內皮分化，鞘脂G蛋白偶聯(lián)受體，3(Edg3R)；肌纖蛋白(MYOC)；NADPH氧化酶4(N0X4)；蛋白激酶Cδ(PKCδ)；水通道蛋白I(AQPl)；水通道蛋白4(AQP4)；補體級聯(lián)系統(tǒng)的成員；ATP酶、H+轉運，溶酶體Vl亞基A(ATP6V1A)；間隙連接蛋白α-I(GJAl)；甲酰肽受體1(FPRl)；甲酰肽受體樣1(FPRLl)；白介素8(IL8)；核因子κ-B，亞基I(NFKBl)；核因子κ-B，亞基2(NFKB2)；早老蛋白1(PSENl)；腫瘤壞死因子-α-轉化酶(TACE)；轉化生長因子β2(TGFB2)；瞬時受體潛在陽離子通道(transientreceptorpotentialcationchannel)，亞家方矣V，成員1(TRPVl)；氯離子通道3(CLCN3)；間隙連接蛋白a-5(GJA5)；以及殼多糖酶3樣-2(CHI3L2)。和眼炎癥相關的mRNA靶基因的實例包括腫瘤壞死因子受體超家族，成員lA(TNFRSFlA)；磷酸二酯酶4D，cAMP特異(PDE4D)；組胺受體Hl(HRHl)；脾酪氨酸激酶(SYK)；白介素1β(ILlB)；核因子κ-B，亞基I(NFKBl)；核因子κ-B，亞基2(NFKB2)；以及腫瘤壞死因子_α_轉化酶(TACE)。此類靶基因在例如美國專利申請中有描述，所述專利申請具有公開號20060166919、20060172961、20060172963、20060172965、20060223773、20070149473，以及20070155690中，其公開內容以其整體引入作為參考。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了降低患者眼內壓的眼藥物組合物，所述組合物含有自補腺伴隨病毒(scAAV)載體，該載體能在眼科可接受的運載體(carrier)中表達治療有效量的干擾RNA分子，其中該干擾RNA分子能減弱與眼病相關基因的表達。該scAAV載體可被包裝在scAAV病毒粒體中。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是制劑，所述制劑含有干擾RNA或其鹽，以重量計高達99%地與可藥用運載體介質(medium)混合，所述介質包括下面描述的那些，并且例如水、緩沖液、鹽水、甘氨酸、透明質酸、甘露醇等等。含有干擾RNA的scAAV載體或者本發(fā)明的藥物組合物可以作為溶液劑、混懸劑或乳劑被施用。以下是可用于本發(fā)明方法的藥物組合物制劑的例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如此處所用的術語“治療有效量”是指在哺乳動物中產(chǎn)生治療反應所確定的干擾RNA或包含干擾RNA的藥物組合物的量。此類治療有效量通過本領域普通技術人員并利用如此處所述的方法是容易確定的。通常，本發(fā)明的治療有效量的干擾RNA導致靶細胞表面的細胞外濃度為IOOpM到1μΜ，或InM到ΙΟΟηΜ，或5nM到約50nM或到約25nM。實現(xiàn)該局部濃度所需的劑量將隨著許多因素而變，所述因素包括遞送方法、遞送位點、遞送位點和靶細胞或組織之間細胞層數(shù)目，遞送是局部還是全身的，等等。遞送位點的濃度可以比靶細胞或組織表面的顯著更高。根據(jù)臨床醫(yī)生的常規(guī)考慮，將局部組合物每天一至四次或以延長的遞送時間表，如每天、每周、每兩周、每月或更長時間遞送到靶器官例如眼睛表面。制劑的PH為約pH4.0到約pH9.0，或約pH4.5到約pH7.4。制劑的治療有效量可以取決于如下因素，如受試者的年齡、種族和性別、靶基因轉錄物/蛋白質更新的速率、干擾RNA效力、和干擾RNA穩(wěn)定性。在一個實施方案中，將包含干擾RNA的scAAV載體局部遞送到靶器官并且以治療劑量到達含有靶mRNA的組織，如小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)頭，從而改善靶基因相關的疾病過程。預期用針對靶mRNA的干擾RNA對患者的治療性治療比與小分子治療有益處，干擾RNA治療性治療通過增加作用持續(xù)時間從而允許較低頻率給藥和更大的患者依從性，并通過增加靶特異性從而減輕副作用來實現(xiàn)所述益處。如此處所用的“眼科可接受的載體”是指那些載體，其最多引起、很少引起或不引起眼刺激、如果需要，提供合適的防腐作用，和以均勻劑量遞送本發(fā)明的一種或多種干擾RNA。用于施用本發(fā)明實施方案的干擾RNA的可接受的載體包括基于陽離子脂類的轉染試劑TransIT-TKO(MirusCorporation，Madison,WI)、LIPOFECTIN、Lipofectamine、OLIGOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)或DHARMAFECT(Dharmacon,Lafayette,CO)；聚陽離子，如聚乙烯亞胺；陽離子肽，如Tat、聚精氨酸或者Penetratin(Antp肽)；納米顆粒；或者脂質體。脂質體從標準的形成小泡的脂類和固醇，如膽固醇形成，并且可以包括靶向分子，如對細胞表面抗原具有結合親和力的單克隆抗體。此外，脂質體可以是加入聚乙二醇的脂質體?？梢砸匀芤?、懸浮液、或者生物蝕解的或非生物蝕解的遞送裝置遞送包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物。例如，可以通過氣霧劑、含服、皮膚、皮內、吸入、肌內、鼻內、眼內、肺內、靜脈內、腹膜內、經(jīng)鼻、眼、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或者經(jīng)皮施用遞送包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物。在某些實施方案中，用干擾RNA分子治療眼病是通過將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物直接施用于眼來完成的。由于許多原因，對眼局部施用是有利的，包括劑量可比全身遞送更小，且分子在不同于眼睛的組織中沉默基因靶的機會更少。許多研究已顯示在體內成功并有效將干擾RNA遞送至眼。例如，Kim等人證實結膜下注射和全身遞送靶向VEGF通路基因的siRNA抑制了小鼠眼中的血管發(fā)生(Kim等人·，2004，Am.J.Pathol.165:2177_2185)。另外，研究已顯示遞送至玻璃體腔的siRNA可擴散至整個眼睛，并在注射后達5天都可檢測到(Campochiaro，2006，GeneTherapy13:559-562)。研究也表明scAAV載體可有效地體內轉導至人小梁網(wǎng)(TM)細胞中。例如，Borras等人表明，可以用scAAV載體來實現(xiàn)在分離的HTM細胞中和來自死后捐獻者的完整組織上的TM的轉導(Borras等人，2006，JGeneMed8:589_602)。可以通過眼組織注射，如眼周、結膜、眼球筋膜下(subtenon)、前眼房(intracameral)、玻璃體內、眼內、視網(wǎng)膜下、結膜下、眼球后、或者小管內注射將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物直接遞送到眼中；或者使用導管或者其他放置裝置，如視網(wǎng)膜彈丸劑、眼內插入物、栓劑或者包含多孔的、非多孔的或者凝膠狀材料的植入物直接應用于眼；通過局部眼滴劑或者軟膏劑；或者通過盲路中的緩釋裝置或者植入鞏膜附近(經(jīng)鞏膜)或鞏膜中(鞏膜內)或者眼中進行遞送。前眼房注射可以通過角膜注射到前房中以允許活性劑到達小梁網(wǎng)。小管內注射可以注射到靜脈集合管引流輸淋管或者注射到輸淋管中。對于眼遞送，包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物可以與眼科可接受的防腐劑、共溶劑、表面活性劑、粘性增強劑、滲透增強劑、緩沖劑、氯化鈉或者水組合以形成水性的無菌眼用混懸液或溶液。通過將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物溶解在生理學上可接受的等滲水性緩沖液中可以制備溶液制劑。此外，溶液可以包括可接受的表面活性劑以幫助溶解包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物。粘性助劑，如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等可以加入到本發(fā)明的組合物中用于提高化合物的保留。為了制備無菌眼用軟膏制劑，將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物與防腐劑在合適的載體(vehicle)，如礦物油、液體羊毛脂或者白礦脂中組合。根據(jù)本領域中已知的方法，通過將干擾RNA懸浮在從例如CARBOPOL-94()(BFGoodrich,Charlotte,NC)等的組合制備的親水基質中制備無菌眼用凝膠制劑。VISCOAT(AlconLaboratories,Inc.,FortWorth,TX)可以用于例如眼內注射。在干擾RNA在眼中的滲透性較弱的情況下，本發(fā)明的其他組合物可以含有滲透增強劑，如cremephor和TWEEN80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，SigmaAldrich,St.Louis,MO)。在某些實施方案中，本發(fā)明還提供了試劑盒，其包括用于減弱如本文引用的mRNA在細胞中表達的試劑。該試劑盒含有能夠減弱與眼病相關基因表達的干擾RNA和/或scAAV載體和/或scAAV載體的產(chǎn)生所必須的組分(例如，包裝細胞系以及包含病毒載體模板的載體和用于包裝的額外輔助載體)。試劑盒也可以含有陽性和陰性對照siRNA或者shRNA表達載體(例如，非靶向對照siRNA或者靶向不相關mRNA的siRNA)。試劑盒還可以含有用于評估預期靶基因的敲低的試劑(例如，用于檢測靶標mRNA的定量PCR的弓|物和探針和/或用于Western印跡的抗對應蛋白質的抗體)。備選地，試劑盒可以包含siRNA序列或者shRNA序列和使用說明書和通過體外轉錄產(chǎn)生siRNA或者構建shRNA表達載體必須的材料。還提供了藥盒形式的藥物組合，其在包裝的組合中包括載體工具(其適于接受與之密切限制的容器工具)，和第一個容器工具，其包括干擾RNA組合物和scAAV載體。如果需要，此類藥盒可以還包括多種常規(guī)的藥物藥盒組分的一種或多種，如具有一種或多種可藥用的載體的容器、額外容器，等等，如本領域技術人員將顯而易見。藥盒中也可以包括作為插頁或標簽的印刷的說明書，其指出待施用的組分的量，施用指導，和/或用于混合組分的指導。本文中所引用之參考，以它們?yōu)楸疚乃龅哪切┨峁┦纠猿绦蚧蚱渌毠?jié)補充的程度通過參考特異性并入。本領域技術人員參考本公開將理解可以進行本文公開的實施方案的多種修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。參考本公開可以不用過度實驗就可以做出和實施本文公開的所有實施方案。本發(fā)明的完整范圍在本公開和其等同實施方案中給出。不應將本說明書理解為過度地限制本發(fā)明的完整保護范圍。應當理解上述公開強調了本發(fā)明的特定技術方案，并且所有等同的修飾或備選方案均在如所附的權利要求中給出的本發(fā)明的精神和范圍內。權利要求減弱患者眼中靶mRNA的表達的方法，其包括(a)提供含有干擾RNA分子的自補腺伴隨病毒(scAAV)載體；和(b)將該scAAV載體施用至患者眼，其中干擾RNA分子能減弱眼中靶mRNA的表達2.權利要求1的方法，其中scAAV載體被包裝進scAAV病毒粒體中。3.權利要求1的方法，其中所述載體通過眼內注射、眼局部應用、靜脈內注射、口服施用、肌內注射、腹膜內注射、經(jīng)皮用或經(jīng)黏膜用來施用。4.權利要求1的方法，其中干擾RNA分子是siRNA、miRNA或shRNA。5.權利要求1的方法，其中靶mRNA與眼病相關。6.權利要求5的方法，其中眼病與眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況、眼高血壓或青光眼相關。7.含有自補腺伴隨病毒(scAAV)載體的藥物組合物，所述載體攜帶有治療有效量的干擾RNA分子和眼科可接受的載體，其中干擾RNA分子能減弱與眼病相關基因的表達。8.權利要求7的組合物，其中scAAV載體被包裝在scAAV病毒粒體中。9.權利要求7的方法，其中干擾RNA分子是siRNA、miRNA或shRNA。10.權利要求7的方法，其中眼病與眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況、眼高血壓或青光眼相關。全文摘要本發(fā)明提供了遞送干擾RNA分子至患者眼以治療眼病的方法。具體來說，本發(fā)明的方法包括自補腺伴隨病毒(scAAV)載體的應用，該載體能遞送干擾RNA分子至患者眼，從而抑制與眼病相關的基因的表達。文檔編號A61K48/00GK101815536SQ200880110028公開日2010年8月25日申請日期2008年10月1日優(yōu)先權日2007年10月1日發(fā)明者A·R·謝帕德申請人:愛爾康研究有限公司