專利名稱：重組vsv病毒載體和重組vsv病毒及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組VSV(水皰性口炎病毒)病毒載體及重組VSV病毒，以及該病毒載體及重組病毒的制備方法。本發(fā)明還涉及重組VSV病毒載體在外源蛋白表達，抗體制備及疫苗研制等方面的用途。
背景技術(shù)：
疫苗對于由病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病具有高效的防治作用。傳統(tǒng)制備疫苗的途徑是利用滅活或減毒后的病原體，但是滅活，減毒的過程經(jīng)常會破壞病原體的免疫原性，影響免疫效果，且安全性難以保證。亞單位疫苗和DNA疫苗雖安全性較好，但免疫原性也低，免疫效果不佳。
重組病毒載體由于表達效率高，引起免疫反應(yīng)全面而成為目前疫苗研究中的熱點。由于DNA病毒可能整合到宿主細胞基因組中，因此雖然有些DNA病毒載體疫苗能提供一定的免疫保護，但應(yīng)用時其安全性受到懷疑。
因此，研制免疫原性高，同時安全性好的重組病毒載體受到了越來越多的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建表達效率高、安全性好且容易進行分子操作和改造的重組病毒載體，以用于多種外源蛋白的表達，制備抗體及研制相應(yīng)疫苗。
本發(fā)明選擇水皰性口炎病毒(VSV)進行分子操作和改造，構(gòu)建了重組病毒載體。
水皰性口炎病毒(VSV)為RNA病毒，含有線狀單股負鏈RNA，從3’到5’端依次排列著N、P、M、G和L5個不重疊的基因，分別編碼病毒的核蛋白(N)，磷酸蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，病毒糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。VSV病毒分子結(jié)構(gòu)簡單，僅編碼五種蛋白質(zhì)，易于進行分子操作和改造，并可從DNA質(zhì)?；謴托纬赏暾闹亟MVSV病毒，使其在宿主細胞中高效表達外源基因產(chǎn)物。
VSV病毒引起的水皰性口炎是接觸性傳染的良性病毒性疾病，常見于牛、鹿和豬。人只偶然感染，但常不顯癥狀或僅輕微發(fā)熱。同時VSV病毒只在細胞質(zhì)中復制，不會整合到宿主的基因組中，將其應(yīng)用于抗體制備及疫苗研究應(yīng)用時具有較高安全性。
本發(fā)明構(gòu)建了重組VSV病毒載體，該載體是包含已知VSV病毒基因組，可攜帶外源基因，能恢復出重組VSV病毒的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明還提供了具有復制功能的重組VSV病毒，該病毒由重組VSV病毒載體恢復形成，具有復制功能及感染性，可在被感染的宿主細胞中增殖并表達基因組中所攜帶的外源基因的病毒顆粒。
所述VSV病毒基因組或其一部分可以來源于不同血清型的VSV、HIV、SARS、MulV、HTLV、SIV或其它病毒；所述VSV病毒基因組中包含的一個或多個結(jié)構(gòu)基因或其部分可以去除或通過改造其序列來改變病毒的結(jié)構(gòu)特征；所述外源基因可以是帶有或不帶有報告基因的一段或一段以上編碼生物活性物質(zhì)的外源序列；所述報告基因可以選自GFP、EGFP、YFP、RFP、BFP、AP、SEAP、Luc、LacZ、CFP或CAT其中之一；所述VSV病毒載體基因組中所包含的結(jié)構(gòu)基因順序及外源基因與報告基因位置可以改變；本發(fā)明提供的VSV載體的制備方法是1.將VSV野生病毒的RNA抽提出來，通過RT-PCR的方法獲得其基因組各片段，同時通過PCR的方法把核酶序列引入L基因的下游，將這些片段插入中間載體中；2.選擇一種帶有RNA聚合酶啟動子序列的真核細胞表達質(zhì)粒載體，在多克隆位點下游插入聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止序列；3.把中間載體中VSV病毒各片段與改造的真核細胞表達質(zhì)粒載體順序拼接起來，即得到VSV載體。
所述核酶序列來源于丁型肝炎病毒的核酶；所述RNA聚合酶是通過重組痘病毒在細胞中表達的T7 RNA聚合酶。
本發(fā)明提供的重組VSV病毒的制備方法是1.質(zhì)粒一的制備將外源基因的DNA序列插入VSV載體質(zhì)粒中；2.質(zhì)粒二的制備將VSV N蛋白基因插入真核細胞表達質(zhì)粒中；3.質(zhì)粒三的制備將VSV P蛋白基因插入真核細胞表達質(zhì)粒中；4.質(zhì)粒四的制備將VSV L蛋白基因插入真核細胞表達質(zhì)粒中；5.將上述四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到某一支持VSV復制的細胞系中，24～48小時后收集細胞上清，擴增一至兩代后收獲重組的VSV病毒。
在上述制備方法中，所述外源序列可以是克隆的DNA序列，基因組DNA，由病原體或腫瘤RNA得到的cDNA，或化學合成的DNA序列。
質(zhì)粒一中所述VSV載體在細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA分子包括a)包含復制啟動子的VSV正鏈RNA，其中復制非必需區(qū)域可以含有外源序列或被外源序列所取代；b)位于上述正鏈RNA下游的核酶序列，用于產(chǎn)生正確的正鏈RNA的3’末端。
所述外源序列既可與VSV病毒基因融合表達，也可以非融合形式表達。
所述真核細胞表達質(zhì)粒均包含噬菌體RNA聚合酶啟動子及RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止信號。
所述轉(zhuǎn)染方法可以是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，電轉(zhuǎn)染法等。
所述支持VSV復制的細胞包括BHK21，293T，Cos7，Vero等真核生物細胞系。
本發(fā)明將上述病毒載體及重組病毒用于高效表達外源基因。
本發(fā)明提供的重組VSV病毒表達的外源基因產(chǎn)物可被純化，或直接將重組VSV病毒用于感染實驗動物而獲得外源基因產(chǎn)物的抗體或中和抗體，并可用于各種病毒或細菌性疾病的疫苗研制。
本發(fā)明的優(yōu)點是1.安全重組VSV病毒具有感染性，可以在宿主細胞內(nèi)高效表達外源基因產(chǎn)物。但安全性高，不會整合到宿主細胞基因組中，最終會被宿主免疫系統(tǒng)清除，因此是一種理想的病毒載體。
重組VSV感染動物一般是引起皮膚水皰樣病變，2周內(nèi)可自愈。人雖然也能感染VSV，但不會引起嚴重后果的疾病。
2.有效重組VSV病毒可以在宿主細胞內(nèi)高效表達外源基因產(chǎn)物，往往一次接種即可引起強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。尤其是能引起較強的粘膜免疫反應(yīng)。
3.操作方便VSV載體易于進行分子操作和改造，并能恢復形成具有復制能力的重組VSV病毒。
重組VSV病毒易于培養(yǎng)，在多種細胞培養(yǎng)中滴度能達到109pfu/ml以上。
重組VSV病毒易于使用，可通過多種接種途徑進行免疫。
具體實施例方式實施例1構(gòu)建VSV載體及輔助質(zhì)粒1.VSV印第安那株來源于北京大學生命科學學院2.重組VSV載體的構(gòu)建參照PNAS(1995)Vol.92p4477-81所述方法。為方便遺傳操作，通過定點突變，在G蛋白的3’端非翻譯區(qū)引入NheI位點，并在G與L之間插入具有最小轉(zhuǎn)錄起始和終止單位的一段Linker及XhoI位點GCTAGGTATGAAAAAAACTAACAGAT ATCACGCTCGAGAATTAATTGCTAGStop/poly(A) 轉(zhuǎn)錄起始XhoI NheI通過類似方法，在G蛋白上游非翻譯區(qū)引入MluI，便于將來替換不同毒株的G蛋白。這一質(zhì)粒稱為pVSV1，基本結(jié)構(gòu)為T7啟動子-N-P-M-G-L-HDV核酶序列-T7終止子3.構(gòu)建輔助質(zhì)粒從pET28a中PCR擴出T7終止子，插入pBluescriptSK II+中，得到pSK-Ter。再通過PCR，獲得N、P、L片段，插入pSK-Ter，即得到這三種輔助表達質(zhì)粒，命名位pSK-N，pSK-P，pSK-L。
實施例2轉(zhuǎn)染和恢復重組VSV病毒1.10cm dish中BHK-21細胞長至70％滿，用MOI為10的vTF7-3感染1小時，vTF7-3來源于PNAS(1986)Vol.83p8122-26；2.1小時后，脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染pVSV1，pSK-N，pSK-P，pSK-L四種質(zhì)粒，四種質(zhì)粒比例為10μg∶3μg∶5μg∶2μg；3.37度培養(yǎng)48小時后，細胞反復凍融三次(-70度→37度)，收集裂解液，12,000轉(zhuǎn)離心5分鐘去除細胞碎片；4.一半裂解液感染新鮮BHK細胞，同時加入25μg/μl的AraC抑制痘病毒；5.48小時后，收集上清，12,000轉(zhuǎn)離心10分鐘，用0.22μm濾器(Millipore)過濾，以徹底除去痘病毒，即得到重組VSV病毒。
結(jié)果恢復時，重組病毒產(chǎn)生的幾率非常低，相當于在107-108轉(zhuǎn)染細胞中產(chǎn)生一個病毒粒子。所以需要擴增一代才能觀察到細胞全部變圓，該現(xiàn)象不同于痘病毒產(chǎn)生的病變。
實施例3重組VSV病毒的擴增1.空斑實驗測定病毒的滴度；2.MOI為0.1的病毒上清感染新鮮BHK細胞，16-24小時后收集上清，-70度保存。
4實施例4重組VSV病毒的鑒定1.收獲的病毒上清加到10％的蔗糖溶液上，Beckman SW40轉(zhuǎn)頭35,000rpm超離1.5小時。病毒沉淀用0.1ml PBS重懸，得到純化的病毒粒子。
2.取5μl跑10％SDS-PAGE膠，考馬斯亮藍染色。
3.Western檢測P蛋白的表達，一抗使用本實驗室制備的兔多抗血清。
結(jié)果1.VSV病毒的五種結(jié)構(gòu)蛋白N、P、G、M、L大小正確。
2.Western檢測到P蛋白的表達。
實施例5重組VSV病毒表達外源基因的檢測將熒光素酶(luciferase)基因插入pVSV1的XhoI/NheI位點，按前述方法恢復，擴增病毒，并檢測報告基因的表達情況。
結(jié)果擴增一代后收獲細胞檢測熒光素酶活性1號 28810893cps2號 21251296cps
結(jié)論重組VSV病毒載體能在宿主細胞中高效表達外源基因產(chǎn)物。
實施例6重組VSV病毒免疫小鼠，產(chǎn)生針對VSV的中和抗體已知滴度的純化病毒用無血清DMEM稀釋至25μl體積中含105病毒顆粒，通過鼻腔免疫BALB/c鼠，兩周后取同批純化病毒以106劑量加強免疫。一周后尾靜脈取血。通過本實驗室建立的假病毒系統(tǒng)檢測中和抗體效價。
VeroE6檢測鼠源免疫血清實驗結(jié)果

¤對假病毒攜帶的熒光素酶表達的檢測，單位為cps結(jié)論重組VSV病毒免疫能產(chǎn)生針對VSV的中和抗體。利用該重組病毒表達病原體(細菌、病毒)來源的抗原或腫瘤抗原，可能誘發(fā)機體產(chǎn)生預防性或治療性的免疫反應(yīng)。
實施例7缺陷病毒恢復及報告基因的表達實驗目的證明經(jīng)過缺失等改造的重組病毒仍具有復制、感染及表達外源基因的能力。為將來對VSV載體進一步減毒致弱打下基礎(chǔ)。
實驗方法1.把GFP基因插入pVSV1的MluI/NheI間，得到PVΔG-GFP；2.基本按照上述方法恢復和擴增病毒，同時轉(zhuǎn)染4μg pCAG-G質(zhì)粒，反式提供G蛋白；3.觀察GFP基因的表達。
結(jié)果熒光下可見大量表達GFP的細胞。
結(jié)論缺陷病毒也具有復制及表達外源基因的能力。
權(quán)利要求
1.重組VSV病毒載體，特征是包含VSV病毒基因組、可攜帶外源基因，并能恢復出重組VSV病毒的質(zhì)粒載體。
2.重組VSV病毒，特征是由重組VSV病毒載體恢復形成、具有復制功能及感染性、可在被感染的宿主細胞中增殖并表達基因組中所攜帶的外源基因的病毒顆粒。
3.權(quán)利要求1或2所述的重組VSV病毒載體或重組VSV病毒，所述VSV病毒基因組的部分可以來源于不同血清型的VSV、HIV、SARS、MulV、HTLV、SIV或其它病毒。
4.權(quán)利要求1或2所述的重組VSV病毒載體或重組VSV病毒，所述VSV病毒基因組中包含的一個或多個結(jié)構(gòu)基因或結(jié)構(gòu)基因的一部分可以去除或進行序列改造；或結(jié)構(gòu)基因順序及外源基因與報告基因位置可以改變。
5.權(quán)利要求1或2所述的重組VSV病毒載體或重組VSV病毒，所述外源基因是帶有或不帶有報告基因的一段或一段以上編碼生物活性物質(zhì)的外源序列；其中所述報告基因選自GFP、EGFP、YFP、RFP、BFP、AP、SEAP、Luc、LacZ、CFP或CAT其中之一。
6.權(quán)利要求1所述的重組VSV病毒載體的制備方法是1)將野生VSV病毒的RNA抽提出來，通過RT-PCR的方法獲得其基因組各片段，同時通過PCR的方法把核酶序列引人L基因的下游，將這些片段插入中間載體中；2)選擇帶有RNA聚合酶啟動子序列的真核細胞表達質(zhì)粒載體，在多克隆位點下游插入聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止序列；3)把中間載體中VSV病毒各片段與改造的真核細胞表達質(zhì)粒載體順序拼接起來，即得到VSV載體。
7.權(quán)利要求2所述的重組VSV病毒的制備方法是1)質(zhì)粒一的制備將外源基因的DNA序列插入VSV載體質(zhì)粒中；2)質(zhì)粒二的制備將VSV N蛋白基因插入真核細胞表達質(zhì)粒中；3)質(zhì)粒三的制備將VSV P蛋白基因插入真核細胞表達質(zhì)粒中；4)質(zhì)粒四的制備將VSV L蛋白基因插入真核細胞表達質(zhì)粒中；5)將上述四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到某一支持VSV復制的細胞系中，24～48小時后收集細胞上清，擴增一至兩代后收獲重組的VSV病毒。
8.權(quán)利要求7所述的重組VSV病毒的制備方法，所述外源序列是克隆的DNA序列、基因組DNA、由病原體或腫瘤RNA得到的cDNA，或化學合成的DNA序列；且所述外源序列既可與VSV病毒基因融合表達，也可以非融合形式表達。
9.權(quán)利要求1或2所述的重組VSV病毒載體或重組VSV病毒用于表達外源基因的用途。
10.權(quán)利要求1或2所述的重組VSV病毒載體或重組VSV病毒用于制備外源基因產(chǎn)物的抗體或中和抗體的用途。
11.權(quán)利要求1或2所述的重組VSV病毒載體或重組VSV病毒用于制備病毒或細菌性疾病的疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了包含VSV(水皰性口炎病毒)病毒基因組、可攜帶外源基因，能恢復出重組VSV病毒的重組VSV病毒載體，還制備了具有復制功能及感染性，可在被感染的宿主細胞中增殖并表達基因組中所攜帶的外源基因的重組VSV病毒顆粒。本發(fā)明將上述病毒載體及重組病毒用于高效表達外源基因，所表達的外源基因產(chǎn)物可被純化，或直接將重組VSV病毒用于感染實驗動物而獲得外源基因產(chǎn)物的抗體或中和抗體，并可用于各種病毒或細菌性疾病的疫苗研制。
文檔編號C12N15/11GK1590552SQ0315614
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月1日
發(fā)明者鄧宏魁, 丁明孝, 聶玉春, 袁菲, 王在, 郭延平, 胡建軍, 李錦全, 易凌 申請人:北京大學